人gfap抗原決定簇多肽、抗體及其體外診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人GFAP抗原決定簇多肽、抗體及其 在體外診斷試劑盒上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行病學(xué)調(diào)查研究表明，目前腦血管疾病與心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成人類疾病死亡 的三大原因。與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率明顯高于心血管 病。腦血管疾病是指由于腦血管病變引起的腦功能障礙，盡管各種腦血管疾病由于病因、發(fā) 病機(jī)理不同，臨床表現(xiàn)有很大差異，但大體上可把腦血管疾病分為三大類：①出血性腦血管 ??；②缺血性腦血管?。孩燮渌耗X動(dòng)脈硬化，各種腦動(dòng)脈炎，腦動(dòng)脈缺血性綜合征，顱內(nèi)靜 脈竇或靜脈血栓等。
[0003] 急性腦血管疾病也稱腦卒中（俗稱腦血栓、腦出血等）是由于急性腦循環(huán)障礙所 致的局限或全面性腦功能缺損綜合癥。據(jù)估算，全國(guó)每年新發(fā)腦卒中患者約為200萬人， 每年死于腦卒中的患者約為150萬人，存活患者人數(shù)600萬~700萬，且70%~80 %的存 活者遺留癱瘓、失語(yǔ)等嚴(yán)重殘疾，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前我國(guó)腦卒中的分型比例 中，腦出血約占35%~45%，農(nóng)村高于城市，貧窮地區(qū)高于富裕地區(qū)，腦出血的病死率遠(yuǎn)較 腦梗塞高。腦卒中是一種致死率和致殘率均高的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類特別是老年 人的健康，威脅病人的生命，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。
[0004] 膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)是一種分子量為 50~52KDa的酸性蛋白，是腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AST)中間纖維的結(jié)構(gòu)蛋白組成 成分，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)識(shí)蛋白，在星形細(xì)胞中有豐富的、唯一的表達(dá)。研究表明，中樞 神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，膠原纖維酸性蛋白可釋放入外周血，特別是腦外傷后外周血中膠原纖維 酸性蛋白濃度顯著升高。進(jìn)一步研究表明，腦出血患者發(fā)病六小時(shí)內(nèi)血清GFAP水平即明顯 升高，而缺血性腦卒中患者六小時(shí)內(nèi)血清GFAP水平與正常對(duì)照組無明顯差異，因此GFAP在 發(fā)病六小時(shí)以內(nèi)對(duì)出血性及缺血性卒中患者具有早期鑒別診斷意義。還有研究表明，急性 腦出血患者血清中的GFAP腦出血體積之間有著密切的正相關(guān)。因此GFAP水平在出血后早 期判斷腦損傷的程度及患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。
[0005] 檢測(cè)血清GFAP最理想的方法是免疫測(cè)定，但前提是必須制備針對(duì)GFAP的特異性 抗體，因此尋找合適的具有免疫原性的GFAP多肽片段成為研究的重點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種抗原性強(qiáng)的人 GFAP抗原決定簇多肽。
[0007] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種能與上述人GFAP 抗原決定簇多肽特異性結(jié)合的特異性強(qiáng)的人GFAP抗體。
[0008] 本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種應(yīng)用上述人GFAP 抗體的人GFAP體外診斷試劑盒。
[0009] 本發(fā)明解決第一個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種人GFAP抗原決定簇多肽， 其氨基酸序列如SEQIDNO: 1(多肽片段1)或SEQIDNO: 2 (多肽片段2)所述。
[0010] 上述多肽片段1和多肽片段2均通過化學(xué)合成法制備：利用美國(guó)ABI431A型多肽 自動(dòng)合成儀，通過固相法合成抗原決定簇多肽，多肽的純度用薄層色譜和高效液相色譜進(jìn) 行評(píng)定，并測(cè)定抗原多肽的濃度。固相肽合成的主要思想是：先將所要合成肽鏈的羧基末 端氨基酸的羧基以共價(jià)鍵形式同一個(gè)不溶性的高分子化合物（樹脂）相連接，然后以此結(jié) 合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組份反 應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈，上述步驟可以反復(fù)地多次進(jìn)行，最后達(dá)到所需要合成的肽鏈的長(zhǎng)度（該方法 的具體步驟參見Eur.J.Immunol. 1994, 24, 3188-3193J.Org.Chem. 1972, 37,3404-3409 ; 《多肽合成》，黃惟德，陳常慶，北京：科學(xué)出版社，1985)。
[0011] 上述兩種GFAP抗原決定簇多肽片段（多肽片段1和多肽片段2)是通過以下原則 進(jìn)行篩選：親水性、抗原性強(qiáng)及易于合成，同時(shí)使得篩選的多肽片段具有以下功能：具有免 疫原性；與載體蛋白連接后作為抗原可刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體；用上述制備的抗體可 特異性的與人GFAP結(jié)合。
[0012] 本發(fā)明解決第二個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種人GFAP抗體，其能特異性 地結(jié)合上述抗原決定簇多肽。上述多肽片段1或多肽片段2與載體蛋白連接后作為抗原來 免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從而制得特異性的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明中多肽片段1為人GFAP蛋白N端的一段15個(gè)氨基酸殘基，在該氨基酸殘 基的N端、C端分別加上Tyr而組成多肽片段3、多肽片段4,如下：
[0014] 多肽片段 3 :Y-SGEMMVGGLAPGRRL
[0015] 多肽片段 4 :SGEMMVGGLAPGRRL-Y
[0016] 多肽片段3或多肽片段4通過BDB(雙偶氮聯(lián)苯胺二氯化物 Bis-diazotizedbenzidinedichloride)交聯(lián)到血蘭蛋白（KLH)上作為抗原制備抗體，多 肽片段3產(chǎn)生抗多肽C端抗體，多肽片段4產(chǎn)生抗多肽N端抗體。
[0017] 本發(fā)明中多肽片段2是人GFAP蛋白C端的一段9個(gè)氨基酸殘基，在該氨基酸殘基 的N端、C端分別加上Tyr則組成多肽片段5、多肽片段6,如下：
[0018] 多肽片段 5 :Y-KTVEMRDGE
[0019] 多肽片段 6 :KTVEMRDGE-Y
[0020] 多肽片段5或多肽片段6通過BDB交聯(lián)到血蘭蛋白（KLH)而形成抗原來制備抗體， 其中多肽片段5產(chǎn)生抗多肽C端抗體，而多肽片段6產(chǎn)生抗多肽N端抗體。
[0021] 本發(fā)明解決第三個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種人GFAP診斷試劑盒，包括 包被抗體、結(jié)合抗體以及酶標(biāo)記二抗，其中包被抗體采用上述任意一種人GFAP抗體，而結(jié) 合抗體采用任意一種人GFAP抗體且與上述包被抗體的多肽來源不同。該試劑盒可以基于 免疫方法對(duì)人體組織、細(xì)胞或體液中的GFAP進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選對(duì)血液標(biāo)本中的GFAP進(jìn)行檢 測(cè)。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0023] (1)本發(fā)明中的人GFAP抗原決定簇多肽（SEQIDNO: 1和SEQIDN0:2)具有良好 的抗原性，用其制備的抗原免疫動(dòng)物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。
[0024] (2)本發(fā)明中制備的各種GFAP抗體能高度特異性的與血液樣本中的GFAP結(jié)合。
[0025] (3)本發(fā)明中的人GFAP診斷試劑盒能有效檢測(cè)血清中的GFAP水平，對(duì)用來判斷血 性腦卒中患者的腦損傷程度及預(yù)后具有重要的臨床意義。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027] 實(shí)施例1 :人GFAP單克隆抗體制備
[0028] (1)抗原的制備：用碳二亞胺法將GFAP多肽片段3 (Y-SGEMMVGGLAPGRRL)或多肽 片段4 (SGEMMVGGLAPGRRL-Y)與載體血蘭蛋白（KLH)聯(lián)接制備成GFAP抗原3 (制備人GFAP 單克隆抗體3)或GFAP抗原4 (制備人GFAP單克隆抗體4)。
[0029] (2)免疫動(dòng)物：取上述制備的抗原與弗氏完全佐劑（基礎(chǔ)免疫）或弗氏完不全佐 劑（加強(qiáng)免疫）等體積混合，充分乳化后免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，每次劑量為200ug/ ml，免疫4~5次，末次免疫后的第四天取尾靜脈血測(cè)定抗體效價(jià)。
[0030] (3)測(cè)定抗體效價(jià)：用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果顯示抗體效價(jià)達(dá)到1:30000以 上。
[0031] (4)雜交瘤細(xì)胞篩選：免疫動(dòng)物抗體效價(jià)符合要求后，取小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓 瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50%PEG(分子量4000)介導(dǎo)進(jìn)行融合，并用HAT條件培養(yǎng)基選擇培 養(yǎng)。融合后放入〇)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)9~11天后，孔內(nèi)出現(xiàn)較大的細(xì)胞克隆。11天開始 用間接ELISA進(jìn)行篩選，對(duì)陽(yáng)性的孔利用有限稀釋法進(jìn)行4次克隆化培養(yǎng)，之后擴(kuò)增細(xì)胞、 凍存、制備腹水。
[0032] (5)腹水制備：將Balb/c小鼠用降植烷0. 5ml/只處理，一周后腹腔接種雜交瘤細(xì) 胞2XIO6個(gè)/只，十天后收集腹水。
[0033] (6)測(cè)定單克隆抗體效價(jià)：用間接ELISA測(cè)定GFAP抗原制備的單克隆抗體效價(jià)， 結(jié)果顯示單抗的效價(jià)達(dá)到1:3000