黃酮醇7-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12基因及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃酮醇7位葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因 CsUGT75L12及其編碼蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃酮類化合物是構(gòu)成茶葉品質(zhì)及功能成分的特征性物質(zhì)，是影響茶葉滋味、湯色 的重要因素。是自然界普遍存在的一類低分子量的多酚化合物，黃酮類化合物是由苯丙 氨鹽途徑合成，根據(jù)黃酮類化合物中心C環(huán)的不同修飾，可分為黃酮、黃酮醇、黃烷醇、異黃 酮、黃烷酮和花青素等幾大類。表1分別列舉了一些常見(jiàn)的黃酮、黃酮醇和花青素的化合物 及其結(jié)構(gòu)。
[0003] 黃酮類化合物是藥用植物的主要活性成分之一，如抗突變，抗糖尿病，抗菌，消炎， 降血壓，抗紫外線，控制體重以及帕金斯病的防治等，還有保護(hù)肝臟、抑制癌細(xì)胞增生、增加 血液的抗氧化活性等藥效，是新藥研發(fā)的活性先導(dǎo)物的來(lái)源寶庫(kù)。但是，天然存在的黃酮類 化合物往往具有水溶性差、穩(wěn)定性不好、作用靶點(diǎn)多、選擇性較差、藥效不好等缺點(diǎn)，給適應(yīng) 性新藥的尋找與開(kāi)發(fā)還來(lái)了相當(dāng)大的困難。進(jìn)而進(jìn)行化學(xué)修飾研究，是新藥研制的一條有 效途徑之一。
[0004] 經(jīng)過(guò)糖苷化修飾后的黃酮類化合物，以黃酮糖苷的形式存在于植物體內(nèi)，糖苷化 修飾后的化合物，可作為一種活化的中間體參與到其它代謝途徑。糖苷化是對(duì)黃酮類化合 物進(jìn)行化學(xué)修飾的有效途徑之一，它可改善黃酮類化合物的水溶性、穩(wěn)定性、選擇性，提高 黃酮類化合物的藥效。
[0005] 黃酮醇-7-0葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，是一種依賴于尿苷二磷酸糖（UDPG)的糖基轉(zhuǎn)移酶 (UDP-glycosyltransferases，UGTs)。它能專一性的催化黃酮類化合物在A環(huán)的第7位輕 基糖苷化，高效的形成黃酮-7-0葡萄糖苷單糖苷，（圖1)。目前C環(huán)3位羥基糖苷化已經(jīng) 在茶樹(shù)，葡萄等植物中被鑒定，在大豆、葛根等植物中也發(fā)現(xiàn)異黃酮7-0葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的存 在，它能夠催化異黃酮A環(huán)的第7位羥基發(fā)生糖苷化，迄今為止，茶樹(shù)中編碼尿苷二磷酸葡 萄糖依賴的黃酮醇7-0葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因還沒(méi)有得到驗(yàn)證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] (一）解決的技術(shù)問(wèn)題
[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種從茶樹(shù)鮮葉中分離獲得的黃酮醇 7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12基因，通過(guò)構(gòu)建重組工程菌，得到重組蛋白，借助于酶反 應(yīng)方法，利用基因工程菌的重組蛋白作為催化酶，得到轉(zhuǎn)化率為85. 2%的高效轉(zhuǎn)化生成山 奈酚7-0-葡萄糖苷的反應(yīng)條件。驗(yàn)證了茶樹(shù)中編碼尿苷二磷酸葡萄糖依賴的黃酮醇7-0 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因。
[0008] (二）技術(shù)方案
[0009] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0010] 一種黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CSUGT75L12基因，該基因具有如SEQIDN0:1 所示的核苷酸序列。
[0011] 優(yōu)選的，所述黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CSUGT75L12基因應(yīng)用于黃酮醇第七位 羥基發(fā)生糖苷化，所述黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12基因應(yīng)用于單糖苷生物合 成。
[0012] -種黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移CsUGT75L12基因的編碼蛋白，所述編碼蛋白具有 如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
[0013] -種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒含有所述黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12 基因SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
[0014] -種重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，將黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12基因連接 到pMal-c2X載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建獲得，命名為pMal-c2X-CsUGT75L12。
[0015] -種轉(zhuǎn)基因工程菌，所述轉(zhuǎn)基因工程菌含有所述重組質(zhì)粒，或其基因組中整合有 所述的黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列，具有如SEQIDNO:1所 示的核苷酸序列。
[0016] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因工程菌為含有所述重組質(zhì)粒的大腸桿菌Novablue (DE3)菌 株，或其基因組中整合有所述的黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列 的大腸桿菌Novablue (DE3)菌株。
[0017] -種重組蛋白，所述重組蛋白為含有所述的黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 CsUGT75L12基因的編碼蛋白，具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
[0018] 優(yōu)選的，所述重組蛋白作為催化酶，通過(guò)建立最適酶反應(yīng)條件，得到黃酮醇 7-0-葡萄糖苷。
[0019] 優(yōu)選的，所述最適酶反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系PH為8. 5~9. 5,反應(yīng)溫度為30~ 37°C，反應(yīng)時(shí)間為35~42min，酶加入量為0~25ug。
[0020] (三）有益效果
[0021] 本發(fā)明提供了一種黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT75L12基因及其編碼蛋白和 應(yīng)用，首次克隆并驗(yàn)證了黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因CsUGT75L12功能，本發(fā)明還提供 了含有CsUGT75L12基因的重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)基因工程菌和重組蛋白，提供一種利用工程菌生產(chǎn) 黃酮醇-7-0葡萄糖苷的方法。本發(fā)明與傳統(tǒng)的分離提取、化學(xué)合成等方法比較而言，本方 法的優(yōu)點(diǎn)在于原料簡(jiǎn)單易得，方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，試劑用量少，產(chǎn)率高達(dá)85. 2%等優(yōu)勢(shì)。 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)黃酮醇7-0糖苷商品化生產(chǎn)提供了代謝工程基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為黃酮醇7-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化流程圖與化學(xué)結(jié)構(gòu)式，以山奈酚為糖 受體，UDP-葡萄糖為糖供體，經(jīng)過(guò)rCsUGT75L12催化生成山奈酚7-0-葡萄糖苷和UDP。
[0023] 圖2為CsUGT75L12重組蛋白（rCsUGT75L12)的SDS-PAGE蛋白電泳分析圖；其中， M為蛋白Marker;1為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)前；2為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后；3為誘導(dǎo)后破碎后上清；4為 誘導(dǎo)后破碎后沉淀；5為純化后蛋白。
[0024] 圖3為HPLC分析rCsUGT75L12催化的酶活產(chǎn)物結(jié)果圖，其中，圖3-A~3-C以 UDP-葡萄糖為糖供體，以黃酮醇化合物（山奈酚，芹菜素和柚皮素）作為糖受體的HPLC圖 譜；
[0025] 圖4為重組CsUGT75L12蛋白催化合成黃酮醇7-0-葡萄糖苷產(chǎn)物的一級(jí)質(zhì)譜和二 級(jí)質(zhì)譜分析圖譜；其中，圖4-A~4-C分別是山奈酚7-0-葡萄糖苷，芹菜素7-0-葡萄糖苷 和柚皮素7-0-葡萄糖苷的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜分析圖譜；
[0026] 圖5為反應(yīng)在不同的酶反應(yīng)條件下的HPLC圖譜，A-C分別代表了酶反應(yīng)的不同條 件。
[0027] 圖6為pMal_c2X質(zhì)粒圖譜
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例 及實(shí)施例附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。 實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未 注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。其中幾種常見(jiàn)的黃酮和黃酮類化合 物及結(jié)構(gòu)式如表1所示。
[0029] 表1幾種常見(jiàn)的黃酮和黃酮醇類化合物及結(jié)構(gòu)式
[0030]
[0031] 一、材料
[0032] 1、茶樹(shù)品種：農(nóng)抗早（Camelliasinensis(L.)0?Kuntze.var.sinensiscultivar Nongkangzao)，采集茶樹(shù)鮮葉，迅速用液氮冷凍，儲(chǔ)存于-80°C冰箱中備用；
[0033] 2、pMal_c2X載體，其中pMal_c2X質(zhì)粒圖譜如圖6所示；
[0034] 3、大腸桿菌Novablue (DE3)表達(dá)宿主菌：購(gòu)于上海北諾生物科技有限公司；
[0035] 4、LB培養(yǎng)基：稱取IOg的NaCl，5g的酵母提取物，IOg的胰蛋白胨，加入950mL去 超純水?dāng)嚢枞芙?，用lmol/L的NaOH調(diào)pH至7.0,加水定容至lOOOmL，高壓蒸汽滅菌15min， 即獲得LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基為在LB液體培養(yǎng)基中加入15g的瓊脂粉即可；
[0036] 5、質(zhì)量比為40%的葡萄糖溶液：稱取40g葡萄糖，加入超純水溶解攪拌均勻，定容 至IOOmL，110°C滅菌IOmin;
[0037] 6、氨節(jié)青霉素母液（Amp+，lOOmg/mL):稱取Ig氨節(jié)青霉素Amp，溶于IOmL滅菌水， 過(guò)濾除菌，分裝小管，-20°C保存；
[0038] 7、lmol/L的IPTG(異丙基硫代-f3 -D-半乳糖苷）：稱取2. 383gIPTG，溶于滅菌 超純水，定容至10mL，過(guò)濾除菌，分裝并于-20°C保存；
[0039] 8、蛋白純化緩沖液：上柱緩沖液：稱取0?37gEDTA，11. 67gNaCl，2. 42gTris， 0. 15gDTT于足量純水中，攪拌使其充分混勻。用稀鹽酸調(diào)其PH至7. 4,定容至1L，即得上 柱緩沖液。洗脫緩沖液：IL上柱緩沖液中加入3. 60g麥芽糖，溶解攪拌均勻。
[0040] 9、IOOmM的pH7. 5的Tris-HCL緩沖溶液：稱取I. 1214gTris加水至90mL攪拌溶 解均勻，加稀HCL調(diào)pH至7. 5,補(bǔ)水定容至IOOmL ;
[0041] 10、體積比為1 %的乙酸：用移液管量取IOmL色譜級(jí)乙酸溶液于IL容量瓶中，用 超純水定容至1L。
[0042]二、CsUGI75L12基因的克?。?br>[0043]1、設(shè)計(jì)帶有表達(dá)載體pMal_c2X載體的多克隆酶切位點(diǎn)的特異引物，其引物序列 如SEQIDNO:3 和SEQIDNO:4 所示：
[0044] SEQ ID NO :3:正向引物：5' -TCTAGAATGCAAGCGGAGAAAGCTAGGC-3'
[0045]SEQIDNO:4 :反向引物：5' -CTGCAGCTATAAGCAATCTCCTCCAACC-3' ；
[0046] 2、按照TaKaRaRNAiso試劑盒和RNAisoPlus試劑盒說(shuō)明書，提取茶樹(shù)品種農(nóng)抗 早鮮葉RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0047] 3、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò) 增程序?yàn)?4°C預(yù)變性30s，94°C變性10s，62°C退火20s，72°C延伸50s，30個(gè)循環(huán)，72°C繼續(xù) 延伸10min，獲得的PCR產(chǎn)物置于16°C保存。
[0048] 4、將PCR產(chǎn)物利用PCR純化試劑盒純化，并連接到pMD19-TSimpleVector后進(jìn) 行菌落PCR驗(yàn)證，獲得陽(yáng)性菌落，提取菌落質(zhì)粒，獲得含有CsUGT75L12基因的T載體，同時(shí) 將菌液送至深圳華大公司進(jìn)行測(cè)序。
[0049] 三、CsUGI75L12基因的原核表達(dá)及功能驗(yàn)證
[0050] 本實(shí)施例中所用到的原核表達(dá)和及其功能驗(yàn)證技術(shù)手段為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人