專利名稱：酮還原酶介導(dǎo)的產(chǎn)生α氯代醇的立體選擇性途徑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及工程化的多肽和其用于從α -氯代酮制備α _氯代醇的用途。2.對序列表、表格或計算機程序的引用根據(jù)37C. F. R. 1. 821以計算機可讀形式(CRF)通過EFS-Web使用文件名 CX2-012W01_ST25.txt同時電子提交的序列表通過引用被并入本文。電子版的序列表創(chuàng)建于2010年6月22日，其文件大小為143千字節(jié)。3.背景立體選擇性還原α -鹵代-酮為其相應(yīng)的手性鹵代-醇是見于許多有用的合成途徑中的轉(zhuǎn)化。例如，形成抗病毒化合物阿扎那韋(atazanavir)的合成途徑包括還原來源自 L-苯丙氨酸的Boc-氯-酮為相應(yīng)的手性Boc- (S)-氯-醇。進行這一轉(zhuǎn)化的標準化學技術(shù)產(chǎn)生需要進一步拆分的期望中間產(chǎn)物的非對映體混合物，增加了阿扎那韋生產(chǎn)的成本和降低效率。因此，能夠更有效地立體選擇性還原α-鹵代-酮為手性鹵代-醇的方法和組合物將是期望的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)屬于酮還原酶(KRED)或羰基還原酶類(EC1. 1. 1. 184)的某些酶可用于立體選擇性轉(zhuǎn)化前-立體異構(gòu)的醛或酮底物為相應(yīng)的手性醇產(chǎn)物。KRED通常將酮或醛底物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇產(chǎn)物，但是還可以催化逆反應(yīng)，即醇底物被氧化為相應(yīng)的酮/醛產(chǎn)物。酶例如KRED對酮和醛的還原以及醇的氧化需要輔因子，其中最常見的為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)以及用于氧化反應(yīng)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。NADH和NADPH充當電子供體，而NAD和NADP充當電子受體。KRED正日益被用于立體選擇性轉(zhuǎn)化酮和醛為用于關(guān)鍵藥物化合物生產(chǎn)的手性醇化合物。使用KRED來產(chǎn)生有用的化合物的實例包括4-氯乙?；宜狨サ牟粚ΨQ還原(Zhou, J.Am. Chem. Soc. 1983 105 :5925-5926 ；Santaniello, J.Chem. Res. (S) 1984 132-133 ；美國專利第5，559, 030號；美國專利第5，700，670號和美國專利第5，891，685 號)、二氧代羧酸的還原(例如美國專利第6，399，339號)、(S)氯_5_羥基-3-氧代己酸叔丁基酯的還原(例如美國專利第6，645，746號和WO 01/40450)、基于吡咯并三嗪的化合物的還原(例如美國申請第2006/(^86646號)、取代苯乙酮的還原(例如美國專利第 6，800，477號)和酮噻吩烷(ketothiolanes)的還原(W0 2005/054491)。在另一個方法中， 如本文證明的，酮還原可在醇諸如異丙醇的存在下進行，以提供逆反應(yīng)(醇脫氫)的底物。 以這種方式，酮還原反應(yīng)中消耗的NADH/NADPH通過逆向、氧化反應(yīng)再生。美國專利第7，083，973號公開了一種通過利用紅球菌屬(Iihodococcus)和短桿菌屬(Brevikicterium)的某些物種還原含相應(yīng)酮基團的化合物，制備(3S，2R)_1_鹵代-2-羥基-3-(保護的)氨基-4-取代的丁烷的立體選擇性方法。‘973專利公開，僅紅球菌屬和短桿菌屬的選定物種催化該還原以形成高量和對映體產(chǎn)率的期望的(3S， 2R)-1-鹵代-2-羥基-3-(保護的)氨基-4-取代的丁烷。‘973專利公開，將來自150g 紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 4277細胞的IOmL細胞提取物加載于
9IOmg (1 -[N-(1-芐基-2-氧-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁基酯底物、葡萄糖脫氫酶(35單位)、0· 7mM NAD+和200mg葡萄糖(反應(yīng)在pH 6. 0、150RPM攪動和30°C進行)以95%產(chǎn)率和>98%非對映體純度產(chǎn)生(1S，2R)-[N-(1-芐基-2-羥基-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁
基酯產(chǎn)物。因此，能夠以高產(chǎn)率和高的非對映體純度立體選擇性轉(zhuǎn)化α-鹵代-酮為鹵代-醇的分離的KRED多肽將是期望的。同樣，利用KRED多肽進行大規(guī)模手性鹵代_醇的制備的改進方法將是期望的。4.概述本公開內(nèi)容提供能夠立體選擇性地轉(zhuǎn)化α -鹵代-酮為手性鹵代-醇的酮還原酶多肽，和在合成方法中利用這些多肽來制備化學化合物的方法，所述化學化合物諸如生產(chǎn)活性藥物成分諸如抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物阿扎那韋中的中間產(chǎn)物。在某些實施方案中，本公開內(nèi)容提供能夠轉(zhuǎn)化式(I)化合物N-保護的(S)-3_氨基-1-氯-4-苯基丁 -2-酮(其中R1是保護基)為相應(yīng)的立體異構(gòu)醇式(II)產(chǎn)物N-保護的OR，3S) -3-氨基-1-氯-4-苯基丁 -2-醇的酮還原酶多肽，如以下方案1所示。方案權(quán)利要求
1. 一種工程化的酮還原酶多肽，所述工程化的酮還原酶多肽能夠以SEQ ID N0:2活性的至少約1. 2倍的相對活性轉(zhuǎn)化( -叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯為叔丁基OS，3R) -4-氯-3-羥基-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯，其中所述多肽包括與 SEQ ID NO 2至少約70%相同的氨基酸序列，并包括一種或多種下述特征對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸2的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸觀的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸34的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸47的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸50的殘基是選自賴氨酸和精氨酸的堿性氨基酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸81的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸90的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸91的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性氨基酸，選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的芳香族氨基酸，或選自賴氨酸和精氨酸的堿性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸94的殘基是堿性氨基酸精氨酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸112的殘基是選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的芳香族氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸117的殘基是選自天冬氨酸和谷氨酸的酸性氨基酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸143的殘基是選自賴氨酸和精氨酸的堿性氨基酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸144的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸145的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸的非極性氨基酸，或選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸的脂肪族氨基酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸148的殘基是選自脯氨酸和組氨酸的受限制的氨基酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸150的殘基是選自亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸152的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸153的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族氨基酸，或選自組氨酸和脯氨酸的受限制的氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸158的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺和絲氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸190的殘基是選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸198的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺和蘇氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸199的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性氨基酸，或選自天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸200的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和甘氨酸的非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸217的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸225的殘基是選自纈氨酸、亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸231的殘基是選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的芳香族氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸232的殘基是選自亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸233的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸244的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性氨基酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸沈0的殘基是選自酪氨酸和色氨酸的芳香族氨基酸；且對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸沈1的殘基是選自天冬酰胺、谷氨酰胺和蘇氨酸的極性氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述氨基酸序列包括相對于SEQIDNO :2的一種或多種以下氨基酸取代:P2L ；V28A ；A34S ；A47V ；E50K ；D81N ；S90V ；I91L ；I91W ；I91R ；I91K ； K94R ；D112Y ；G117D ；S143R ；V144T ；G145A ；R148H ；A150G ；F152L ；N153G ；N153V ；N153H ； T158S ；G190A ；S198N ；I199M ；I199L ；I199N ；M200I ；A217T；I225V ；P231F ；A232V ；E233Q ； D244G ；F260Y 和 S261N。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的氨基酸序列SEQ ID NO :4、6、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、50、52、54、56、60、62、65、66、 68、70、72、74、76、78 和 80。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述相對活性是SEQID NO :2活性的至少約1.5倍。
5.如權(quán)利要求4所述的酮還原酶，其中所述多肽包括選自以下組成的組的氨基酸序列SEQ ID NO :6、18、22、30、38、40、50、52、54 和 56。
6.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述相對活性是SEQID NO 2活性的至少約3倍。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的氨基酸序列SEQ ID NO :6,50,52 和 56。
8.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述氨基酸序列包括一種或多種下述特征 對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸91的殘基選自亮氨酸、色氨酸、精氨酸和賴氨酸組成的組；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸144的殘基是蘇氨酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸145的殘基是丙氨酸； 對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸150的殘基是甘氨酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸153的殘基選自甘氨酸、纈氨酸和組氨酸組成的組； 對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸190的殘基是丙氨酸；對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸199的殘基選自甲硫氨酸、亮氨酸和天冬酰胺組成的組；且對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸沈0的殘基是酪氨酸。
9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的氨基酸序列SEQ ID NO :16、18、22、24、26、28、30、32、34、38、40 和 52。
10.如權(quán)利要求10所述的多肽，其中所述氨基酸序列包括一種或多種下述特征 對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸91的殘基是精氨酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸145的殘基是丙氨酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸153的殘基選自甘氨酸和組氨酸組成的組；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸190的殘基是丙氨酸；且對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸沈0的殘基是酪氨酸。
11.如權(quán)利要求10所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的氨基酸序列 SEQ ID NO :18、22、30、38、40 和 52。
12.如權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述相對活性是SEQID NO :2活性的至少約3倍， 且其中對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸145的殘基是丙氨酸。
13.如權(quán)利要求12所述的多肽，其中所述多肽包括SEQID NO :52的氨基酸序列。
14.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽能夠在M小時內(nèi)以至少70%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化包含初始濃度為至少10g/L的(S)-叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯的反應(yīng)混合物為叔丁基OS，3R) -4-氯-3-羥基-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯。
15.如權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述多肽能夠在M小時內(nèi)達到至少95%的轉(zhuǎn)化率。
16.如權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述多肽能夠轉(zhuǎn)化(S)-叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯為至少97 %非對映體過量的叔丁基OS，3R) -4-氯-3-羥基苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯。
17.如權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述反應(yīng)混合物包含少于約5g/L的所述多肽。
18.如權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述反應(yīng)混合物包含初始濃度為至少100g/L的 (S)-叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯。
19.一種工程化的酮還原酶多肽，所述多肽能夠以比參考多肽SEQ IDNO :2大至少2倍的活性氧化異丙醇(IPA)為丙酮，其中所述多肽包含與選自SEQ ID N0:6、56、60、62、64、 66、68、70、72、74、76、78和80的序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。
20.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸序列與選自SEQIDN0:6、56、60、62、 64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列具有至少95%同一性。
21.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸序列包括至少一種下述特征對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸144的殘基是半胱氨酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸145的殘基選自丙氨酸和纈氨酸組成的組；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸150的殘基選自異亮氨酸、絲氨酸和色氨酸組成的組；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸190的殘基選自谷氨酰胺、脯氨酸和纈氨酸組成的組；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸199的殘基選自甘氨酸和亮氨酸組成的組；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸200的殘基是異亮氨酸；對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸204的殘基是苯丙氨酸；且對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸225的殘基是纈氨酸。
22.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含與SEQIDNO 2相比的至少一種以下取代V144C、A150I、A150S、A150W、G190P、G190V、M200I 和 V204F。
23.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含與SEQIDNO 2相比的至少一種以下組的氨基酸取代G145A 和 I199L ；和 G145A 和 I225V。
24.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述活性比參考多肽SEQID NO :2大至少5倍， 且其中所述氨基酸序列包含與SEQ ID N0:2相比的至少一種以下取代A150W、M200I和 G190V。
25.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQID NO :6、56、60、62、64、 66、68、70、72、74、76、78 和 80。
26.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-25任一項的多肽。
27.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1-25任一項的多肽。
28.—種表達載體，所述表達載體包含可操作地連接于能夠指導(dǎo)編碼的多肽在宿主細胞中表達的控制序列的權(quán)利要求27的多核苷酸。
29.如權(quán)利要求觀所述的表達載體，其中所述控制序列包含分泌信號。
30.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求27或觀任一項的表達載體。
31.如權(quán)利要求30所述的宿主細胞，其中編碼多肽的所述多核苷酸的密碼子已被優(yōu)化以在所述宿主細胞中表達。
32.—種制備權(quán)利要求1至25任一項的工程化的酮還原酶多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求30的宿主細胞，并從所述宿主細胞分離所述多肽。
33.一種制備大于約95%非對映體過量的式(II)化合物的方法，所述方法包括
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中R1是選自以下組成的組的氮保護基甲?；?三苯甲基、甲氧基三苯甲基、甲苯磺酰基、鄰苯二甲酰亞氨基、乙?；?、三氯乙?；?、氯乙酰基、溴乙?；?、碘乙?；⑵S氧羰基(Cbz)、9_芴基甲氧羰基(FMOC)、2_三甲硅烷基乙氧羰基(Teoc)U-甲基-1-(4-聯(lián)苯基)乙氧羰基(Bpoc)、叔丁氧羰基(BOC)、烯丙氧基羰基 (Alloc)、三鹵代乙酰基、芐基、苯甲?；拖趸交阴；?。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中R1是叔丁氧羰基。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括約6.5至約9. 5的pH。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括約9.O的pH。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括從約25°C至約60°C的溫度。
39.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括約45°C的溫度。
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括含水共溶劑系統(tǒng)。
41.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括包含從約90 10(v/v)至約 10 90 (ν/ν)的有機溶劑與水的比例的含水共溶劑系統(tǒng)。
42.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括包含從約5%至約40%異丙醇的含水共溶劑系統(tǒng)。
43.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括包含約10%異丙醇的含水共溶劑系統(tǒng)。
44.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述反應(yīng)條件包括包含約pH9.0和約10%異丙醇的含水共溶劑系統(tǒng)。
45.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述多肽的濃度少于約5g/L。
46.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述多肽的濃度少于約lg/L。
47.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述式(I)化合物的濃度是至少約100g/L。
48.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述式(I)化合物的濃度是至少約150g/L。
49.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述多肽是大致上純的多肽。
50.如權(quán)利要求33所述的方法，所述方法還包括選自以下組成的組的輔因子再生系統(tǒng)葡萄糖脫氫酶和葡萄糖、甲酸脫氫酶和甲酸、亞磷酸脫氫酶和亞磷酸、以及異丙醇和仲醇脫氫酶。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述輔因子再生系統(tǒng)是仲醇脫氫酶。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述仲醇脫氫酶是所述工程化的酮還原酶多肽。
53.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述非對映體過量是大于約97%。
54.如權(quán)利要求33所述的方法，其中在少于約M小時內(nèi)至少約95%的所述式(I)化合物被轉(zhuǎn)化為所述式(II)化合物。
55.如權(quán)利要求33所述的方法，其中在少于約M小時內(nèi)至少約95%的所述式(I)化合物被轉(zhuǎn)化為所述式(II)化合物，其中所述式(I)化合物的濃度是至少約150g/L且所述多肽的濃度是少于約lg/L。
56.一種制備大于約95%非對映體過量的式(III)化合物的方法，所述方法包括
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中R1是選自以下組成的組的氮保護基甲酰基、 三苯甲基、甲氧基三苯甲基、甲苯磺?；?、鄰苯二甲酰亞氨基、乙?；⑷纫阴；?、氯乙?；?、溴乙?；⒌庖阴；⑵S氧羰基(Cbz)、9_芴基甲氧羰基(FMOC)、2_三甲硅烷基乙氧羰基(Teoc)U-甲基-1-(4-聯(lián)苯基)乙氧羰基(Bpoc)、叔丁氧羰基(BOC)、烯丙氧基羰基 (Alloc)、三鹵代乙?；⑵S基、苯甲?；拖趸交阴；?。
58.如權(quán)利要求56所述的方法，其中R1是叔丁氧羰基(BOC)。
59.如權(quán)利要求56所述的方法，其中進行將式(II)化合物與堿接觸的所述步驟而不純化和/或分離所述式(II)化合物。
60.如權(quán)利要求56所述的方法，所述方法還包括從所述有機溶劑萃取物結(jié)晶所述式 (III)化合物。
61.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述有機溶劑選自甲苯、異丙醇、MTBE、正丁醇和乙腈。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述有機溶劑是MTBE。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，所述方法還包括用結(jié)晶溶劑交換所述有機溶劑萃取物的有機溶劑，并從所述結(jié)晶溶劑結(jié)晶所述式(III)化合物。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述結(jié)晶溶劑是庚烷。
65.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述堿選自氫氧化鉀(KOH)、叔丁醇鉀、碳酸鉀和三乙胺。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述堿是氫氧化鉀(KOH)。
67.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述非對映體過量大于約97%。
全文摘要
本公開內(nèi)容涉及工程化的酮還原酶多肽和其用于從α-氯代酮制備α-氯代醇的用途。還提供了編碼工程化的酮還原酶多肽的多核苷酸和能夠表達工程化的酮還原酶多肽的宿主細胞。
文檔編號C12N15/53GK102482648SQ201080027481
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者亞加迪什·馬維納哈利, 史蒂文·詹姆斯·科利爾, 榮貴·彭, 邁克爾·沃格爾, 韋絲娜·米切爾 申請人:科德克希思公司