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      編碼黃酮合酶的基因的制作方法

      文檔序號(hào):551295閱讀:228來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:編碼黃酮合酶的基因的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及通過(guò)基因工程技術(shù)控制和利用黃酮的生物合成,黃酮對(duì)植物中花的顏色,防紫外線的保護(hù)作用,與微生物的共生等有影響。更具體地,本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的基因及其應(yīng)用,所述蛋白質(zhì)具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
      發(fā)明
      背景技術(shù)
      五彩繽紛的不同花色是生活中令人愉快的事情,它能豐富人們的思想和內(nèi)心世界。通過(guò)與微生物共生而加速植物生長(zhǎng),或通過(guò)增加豆科固氮細(xì)菌的數(shù)目從而使土壤中氮含量的增加而改良植物生產(chǎn)能力,希望可增加糧食產(chǎn)量以迎合將來(lái)人口增加的需求。要想獲得更加符合環(huán)保要求的農(nóng)業(yè),需要消除或降低農(nóng)藥的使用,這就需要通過(guò)上述生物學(xué)方法改良土壤,并需要植物對(duì)微生物感染具有較高的抗性。另一個(gè)想達(dá)到的目標(biāo)是得到防紫外線保護(hù)性功能較強(qiáng)的植物以保護(hù)植物免受臭氧層遭破壞的影響。
      “類黃酮”是具有C6-C3-C6碳骨架的一組化合物的通稱,它們廣泛分布于植物細(xì)胞中。已知類黃酮具有吸引昆蟲(chóng)和其它傳粉者的功能,可保護(hù)植物免受紫外線的侵襲,并參與與土壤微生物的相互作用(BioEssays,16(1994),Koes等,p123;Trends in Plant Science,1(1997),Shirley,B.W.,p.377)。
      在類黃酮中,黃酮在植物與微生物的相互作用中起著重要作用,尤其是在豆科植物中更是如此,其中它們參與了與豆科細(xì)菌共生的起始步驟(植物細(xì)胞,7(1995),Dixon和Paiva,p.1085;植物病理學(xué)年評(píng),33(1995),Spaink,p.345)?;ò曛械狞S酮在被昆蟲(chóng)識(shí)別方面起作用并可用作輔色素而與花青苷形成復(fù)合物(Gendai Kagaku,(May,1998),Honda和Saito,p.25;Prog.Chem.Org.Natl.Prod.,52(1987),Goto,T.,p.114)。已知當(dāng)黃酮與花青苷形成復(fù)合物時(shí),花青苷的吸光度最大值往較長(zhǎng)的波長(zhǎng)偏移,即往藍(lán)色方向偏移。
      已廣泛研究了類黃酮的生物合成途徑(植物細(xì)胞,7(1995),Holton和Cornish,p.1071),已分離出參與花青素3-葡糖苷和黃酮醇生物合成的所有酶的基因。然而,尚未分離出參與黃酮生物合成的基因。合成黃酮的酶包括屬于雙加氧酶家族并依賴于2-氧化戊二酸的酶(黃酮合酶I)和屬于細(xì)胞色素P450家族的單加氧酶(黃酮合酶II)。這些酶是沒(méi)有結(jié)構(gòu)同源性的完全不同的酶。
      據(jù)報(bào)道,在歐芹中,依賴于2-氧化戊二酸的雙加氧酶催化由柚苷配基(一種黃烷酮)生產(chǎn)芹菜苷配基(一種黃酮)的反應(yīng)(Z.Naturforsch.,36C(1981),Britsch等,p.742;Arch.Biochem.Biophys.,282(1990),Britsch,p.152)。已知其它類型的黃酮合酶II存在于金魚(yú)草(Z.Naturforsch.,36C(1981),Stotz和Forkmann,p.737)和大豆(Z.Naturforsch.,42C(1987),Kochs和Grisebach,p.343;Planta,171(1987),Kochs等,p.519)中。最近,有人報(bào)道了大丁草花瓣中的基因座和黃酮合酶II活性之間的相關(guān)性(植物化學(xué),49(1998),Martens和Forkmann,p.1953)。然而,無(wú)人報(bào)道已分離出黃酮合酶I和II的基因或已高度純化了黃酮合酶II。
      研究了細(xì)胞色素P450蛋白的特性,該蛋白質(zhì)具有甘草二酮-合成活性,當(dāng)用誘發(fā)劑處理經(jīng)培養(yǎng)的甘草(Glycyrrhiza echinata)細(xì)胞時(shí)可誘導(dǎo)該活性。據(jù)信該蛋白質(zhì)可催化甘草根亭配基(其為5-脫氧黃烷酮)第2位的羥化,接著非酶促打開(kāi)半縮醛環(huán),產(chǎn)生甘草二酮(植物生理學(xué),105(1994),Otani等,p.1427)。為了克隆甘草二酮合酶,由經(jīng)誘導(dǎo)劑處理的甘草培養(yǎng)細(xì)胞制備cDNA文庫(kù),克隆出8個(gè)編碼細(xì)胞色素P450的基因片斷(植物科學(xué),126(1997),Akashi等,p.39)。
      由這些片斷得到2個(gè)不同的全長(zhǎng)cDNA序列,各編碼細(xì)胞色素P450,直至那時(shí)它們?nèi)允俏粗摹>唧w地說(shuō),它們是CYPGe-3(細(xì)胞色素P450 No.CYP81E1)和CYPGe-5(細(xì)胞色素P450 No.CYP93B1,下文稱之為CYP93B1)(植物生理學(xué),115(1997),Akashi等,p.1288)。通過(guò)在使用培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞的系統(tǒng)中進(jìn)一步表達(dá)CYP93B1 cDNA,證實(shí)該基因編碼的蛋白質(zhì)可催化由甘草根亭配基(一種黃烷酮)合成甘草二酮的反應(yīng),和由柚苷配基(一種黃烷酮)生產(chǎn)2-羥基柚苷配基的反應(yīng)。
      通過(guò)用10%鹽酸進(jìn)行酸處理(室溫,2小時(shí))使2-羥基柚苷配基轉(zhuǎn)變?yōu)榍鄄塑张浠?一種黃酮)。通過(guò)使圣草酚與表達(dá)CYP93B1的酵母的微粒體反應(yīng),接著進(jìn)行酸處理可將圣草酚轉(zhuǎn)變?yōu)樘冱S菌素(一種黃酮)。由此闡明細(xì)胞色素P450基因編碼黃烷酮2-羥化酶活性的功能(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等.,p.287)。這里,由柚苷配基生產(chǎn)芹菜苷配基需要CYP93B1以及另一個(gè)未知的酶,由此得出的結(jié)論是總共需要兩種酶。
      然而,目前尚未鑒定出具有不經(jīng)酸處理直接由黃烷酮(如柚苷配基)合成黃酮(如芹菜苷配基)之活性的酶。因此,盡管黃酮在植物中具有多種功能,但控制植物中的黃酮生物合成和改善黃酮參與的生物功能,如花的顏色的技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道。與將參與由黃烷酮合成黃酮的兩種酶的基因?qū)胫参锛?xì)胞相比,本身可催化由黃烷酮合成黃酮的酶的發(fā)現(xiàn),該酶基因的獲得,以及將該基因?qū)胫参镏芯哂懈鼜?qiáng)的可操作性和工業(yè)實(shí)用性。
      發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的目的是提供黃酮合酶基因,優(yōu)選為黃酮合酶II基因,更優(yōu)選為具有直接由黃烷酮合成黃酮之活性的黃酮合酶的基因??蓪⑺命S酮合酶基因?qū)胫参镏胁⑦^(guò)量表達(dá)以改變花的顏色。
      另外,在天然含有大量黃酮的花瓣中,預(yù)期通過(guò)反義方法或共抑制法控制黃酮合酶基因的表達(dá)也能改變花的顏色。另外,根據(jù)黃酮的抗細(xì)菌活性及其與土壤微生物的相互作用而在適當(dāng)器官中表達(dá)黃酮合酶基因可增加植物抗細(xì)菌活性并因促進(jìn)了與根際微生物的共生關(guān)系而改善豆科植物的固氮能力,并能獲得防紫外線和光照的保護(hù)作用。
      因此,本發(fā)明提供了編碼可直接由黃烷酮合成黃酮的蛋白質(zhì)的基因,該基因具體為編碼黃酮合酶II的基因,黃酮合酶II可通過(guò)單個(gè)酶反應(yīng)催化由黃烷酮合成黃酮的反應(yīng)(下文稱之為“黃酮合酶II”)。
      更具體地,本發(fā)明提供了編碼P450蛋白的基因,所述蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列,并具有由黃烷酮合成黃酮的活性,還提供了編碼具有經(jīng)修飾的氨基酸序列但仍具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)的基因,其中所述修飾是通過(guò)在上述氨基酸序列中添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或用不同氨基酸取代完成的。
      本發(fā)明還提供了編碼具有與序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少有55%同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因,所述蛋白質(zhì)具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
      本發(fā)明還提供了編碼具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)的基因,該基因在5×SSC,50℃的條件下可與序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的全部或部分雜交。
      本發(fā)明還提供了載體,尤其是表達(dá)載體,其含有上述任一種基因。
      本發(fā)明還提供了被上述載體轉(zhuǎn)化的宿主。
      本發(fā)明還提供了由上述任一種基因編碼的蛋白質(zhì)。
      本發(fā)明還提供了生產(chǎn)上述蛋白質(zhì)的方法,所述方法的特征在于培養(yǎng)上述宿主并從宿主中收集具有黃酮合成活性的蛋白質(zhì)。
      本發(fā)明還提供了其中導(dǎo)入了上述任一種基因的植物,或表現(xiàn)出相同特性的植物后代或其組織,如切花。
      本發(fā)明還提供了使用上述基因改變類黃酮的量和組成的方法;使用上述基因改變黃酮量的方法;使用上述基因改變花的顏色的方法;使用上述基因使花的顏色變藍(lán)的方法;使用上述基因使花的顏色更紅的方法;使用上述基因修飾植物的光敏性的方法;使用上述基因控制植物和微生物之間的相互作用的方法。
      實(shí)施本發(fā)明的具體方案由甘草CYP93B1基因編碼的黃烷酮2-羥化酶由底物黃烷酮產(chǎn)生了2-羥基黃烷酮,通過(guò)酸處理將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮。本發(fā)明人認(rèn)為通過(guò)使用得自甘草的cDNA CYP93B1篩選例如含有大量黃酮的花的cDNA文庫(kù),從而得到編碼具有直接由底物黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)的cDNA,即可得到編碼黃酮合酶II的基因(這是本發(fā)明的目的之一)。
      根據(jù)本發(fā)明,使用得自甘草的cDNA CYP93B1為探針篩選含有大量黃酮的紫蘇的cDNA文庫(kù),可得到編碼新細(xì)胞色素P450的cDNA(見(jiàn)實(shí)施例1)。
      在酵母中表達(dá)得自紫蘇的cDNA并與底物柚苷配基(一種黃烷酮)反應(yīng),結(jié)果無(wú)需經(jīng)酸處理即可產(chǎn)生黃酮芹菜苷配基而不是2-羥基柚苷配基(見(jiàn)實(shí)施例2)。換句話說(shuō),該酶可直接由黃烷酮產(chǎn)生黃酮,而無(wú)需經(jīng)酸處理,經(jīng)證實(shí),其基因?yàn)橐郧皬奈纯寺∵^(guò)的黃酮合酶II基因。
      本發(fā)明的基因可以是例如編碼序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的基因。然而,已知其氨基酸序列經(jīng)添加或缺失多個(gè)氨基酸和/或被不同氨基酸取代而被修飾的蛋白質(zhì)可保持與原始蛋白質(zhì)相同的酶活性。因此,具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列,但其中的氨基酸序列經(jīng)添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或被不同氨基酸取代而被修飾的蛋白質(zhì),以及編碼所述蛋白質(zhì)的基因也包含在本發(fā)明中,只要它們保持直接由黃烷酮生產(chǎn)黃酮之活性即可。
      本發(fā)明還涉及具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列和編碼本文所述氨基酸序列之核苷酸序列,或在例如5×SSC,50℃的條件下可與所述核苷酸序列的部分雜交的基因,條件是它們能編碼具有由黃烷酮生產(chǎn)黃酮之活性的蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)碾s交溫度隨核苷酸序列和核苷酸序列長(zhǎng)度的不同而不同,例如,當(dāng)所用探針是含有編碼6個(gè)氨基酸的18個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA片斷時(shí),優(yōu)選溫度不超過(guò)50℃。
      所述雜交選擇的基因可以是天然的,例如得自如金魚(yú)草,蝴蝶草或紫蘇的植物基因;也可以是另一種植物的基因,如龍膽,馬鞭草,菊,鳶尾草等的基因。雜交所選擇的基因可以是cDNA或基因組DNA。
      本發(fā)明還涉及編碼具有與序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少有55%,優(yōu)選至少70%,如80%或以上甚至90%或以上同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因,所述蛋白質(zhì)具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
      通過(guò)如實(shí)施例所述篩選cDNA文庫(kù)可得到具有天然核苷酸序列的基因。可使用具有天然核苷酸序列的DNA作為起始物質(zhì),通過(guò)常規(guī)的定點(diǎn)誘變或PCR法合成編碼具有經(jīng)修飾的氨基酸序列的酶的DNA。例如,通過(guò)用限制性酶處理天然cDNA或基因組DNA,然后用作定點(diǎn)誘變或PCR(使用的引物中導(dǎo)入了所需的突變)的模板,即可得到其中導(dǎo)入所需修飾的DNA片斷。然后可將已導(dǎo)入突變的DNA片斷與編碼靶酶另一部分的DNA片斷連接。
      或者,為了得到編碼由縮短的氨基酸序列組成的酶的DNA,例如,可用所需的限制性核酸內(nèi)切酶切割編碼長(zhǎng)于目的氨基酸序列的氨基酸序列(如全長(zhǎng)氨基酸序列)的DNA,如果所得DNA片斷不編碼完整的靶氨基酸序列,可將該片斷與含有其余序列的合成DNA連接。
      可在使用大腸桿菌或酵母的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所得的基因,檢測(cè)其酶活性以證實(shí)所得基因編碼黃酮合酶。通過(guò)表達(dá)基因,也可得到黃酮合酶蛋白作為基因產(chǎn)物?;蛘?,甚至可以使用SEQ ID NO2所示的全部或部分氨基酸序列的抗體來(lái)得到黃酮合酶蛋白,可使用這種抗體克隆另一種生物中的黃酮合酶基因。
      因此,本發(fā)明還涉及含有上述基因的重組載體,尤其是表達(dá)載體,并涉及被這些載體轉(zhuǎn)化的宿主。所用宿主可以是原核或真核生物。常用作宿主的原核生物的例子包括埃希氏菌屬的細(xì)菌,如大腸桿菌,和芽孢桿菌屬的微生物,如枯草芽孢桿菌。
      可以使用的真核宿主的例子包括低等真核生物,如真核微生物(如真菌門中的酵母和絲狀真菌)。至于酵母,可提及的是屬于糖酵母屬的微生物,如釀酒酵母,至于絲狀真菌,可提及的是屬于曲霉屬的微生物,如米曲霉和黑曲霉和青霉屬的微生物。也可使用動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞,動(dòng)物細(xì)胞可以是小鼠,倉(cāng)鼠,猴或人的細(xì)胞系。也可使用昆蟲(chóng)細(xì)胞,如家蠶細(xì)胞或成年家蠶本身。
      本發(fā)明的表達(dá)載體可包括表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū),如啟動(dòng)子和終止子,復(fù)制起點(diǎn)等,這取決于它們欲導(dǎo)入的宿主類型??梢允褂玫募?xì)菌表達(dá)載體啟動(dòng)子的例子包括常規(guī)的啟動(dòng)子,如trc啟動(dòng)子,tac啟動(dòng)子,lac啟動(dòng)子等??梢允褂玫慕湍竼?dòng)子的例子包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子,PH05啟動(dòng)子等。可以使用的絲狀真菌啟動(dòng)子的例子包括淀粉酶啟動(dòng)子,trpC等。可以使用的動(dòng)物細(xì)胞宿主啟動(dòng)子的例子包括病毒啟動(dòng)子,如SV40早期啟動(dòng)子,SV40晚期啟動(dòng)子等。
      根據(jù)常規(guī)方法,使用限制性核酸內(nèi)切酶,連接酶等可以制備表達(dá)載體。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主也可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。
      可以培養(yǎng),栽培或發(fā)酵被表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主,可根據(jù)常規(guī)方法,如過(guò)濾,離心分離,細(xì)胞破碎,凝膠過(guò)濾層析,離子交換層析等從培養(yǎng)產(chǎn)物中回收和純化靶蛋白質(zhì)。
      本說(shuō)明書(shū)全文討論了得自紫蘇的黃酮合酶II,該酶能直接由黃烷酮合成黃酮,已知細(xì)胞色素P450基因構(gòu)成了超家族(DNA和細(xì)胞生物學(xué),12(1993),Nelson等,p.1),相同家族中的細(xì)胞色素P450蛋白的氨基酸序列具有40%或更高的同一性,而亞家族中的細(xì)胞色素P450蛋白的氨基酸序列具有55%或更高的同一性,它們的基因能互相雜交(Pharmacogenetics,6(1996),Nelson等,p.1)。
      例如,首次從矮牽牛屬植物中分離出類黃酮3’,5’-羥化酶的基因,所述酶是細(xì)胞色素P450的一種并參與類黃酮合成途徑(自然,366(1993),Holton等,p.276),使用矮牽牛類黃酮3’,5’-羥化酶基因作為探針易于從龍膽(植物細(xì)胞生理學(xué),37(1996),Tanaka等,p.711),草原龍膽,風(fēng)鈴草(WO93/18155(1993),Kikuchi等),薰衣草,蝴蝶草和馬鞭草(Shokubutsu no Kagaku Chosetsu,33(1998),Tanaka等,p.55)中分離出類黃酮3’,5’-羥化酶基因。
      因此,本發(fā)明的能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶II基因的全部或部分可用作探針以從不同種植物中得到能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶II基因。另外,通過(guò)純化本說(shuō)明書(shū)中所述的能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶II,通過(guò)常規(guī)方法得到抗該酶的抗體,即可得到與抗體反應(yīng)的不同黃酮合酶II蛋白,并得到編碼這些蛋白質(zhì)的基因。
      因此,本發(fā)明并不僅限于能直接由黃烷酮合成黃酮的紫蘇黃酮合酶II基因,還涉及得自多種其它植物的能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II。除了本文所述的紫蘇外,所述黃酮合酶II基因的來(lái)源還可以是龍膽,馬鞭草,菊,鳶尾草,鴨跖草,矢車菊,鼠尾草,喜林草等,但本發(fā)明的范圍不限于這些植物。
      本發(fā)明還涉及通過(guò)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II基因使顏色被修飾的植物,以及植物的后代或其組織,所述組織也可以是切花的形式。通過(guò)使用本發(fā)明的黃酮合酶II或其已被克隆的基因,可以在只產(chǎn)生很少黃酮或根本不產(chǎn)生黃酮的植物種或變種中產(chǎn)生黃酮。通過(guò)在花瓣中表達(dá)一個(gè)或多個(gè)黃酮合酶II基因,可以增加花瓣中黃酮的量,從而使花的顏色往例如,藍(lán)色方向轉(zhuǎn)變。
      相反,通過(guò)抑制黃酮在花瓣中合成,可以使花的顏色往例如,紅色方向轉(zhuǎn)變。然而,黃酮對(duì)花色的作用很大,因此花色的改變并不局限于上述類型。就目前的技術(shù)水平而言,可以將基因?qū)胫参锊⒁越M成型或組織特異性的方式表達(dá)基因,但是,也可以通過(guò)反義法或共抑制法抑制靶基因的表達(dá)。
      可轉(zhuǎn)化的植物的例子包括玫瑰,菊,麝香石竹,金魚(yú)草,仙客來(lái),紅門蘭,草原龍膽,香雪蘭,扶郎花,唐菖蒲,滿天星,伽藍(lán)菜,百合,天竺葵,老鶴草,碧冬茄,蝴蝶草,郁金香,水稻,大麥,小麥,油菜子,馬鈴薯,番茄,白楊,香蕉,桉樹(shù),甜馬鈴薯,大豆,苜蓿,羽扇豆,玉米等,但并不限于這些植物。
      由于黃酮具有如上所述的多種生理學(xué)活性,它們可賦予植物新的生理學(xué)活性或經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如,通過(guò)在根中表達(dá)產(chǎn)生黃酮的基因,可以促進(jìn)對(duì)該植物有利的微生物的生長(zhǎng),從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。也可以合成在人,動(dòng)物或昆蟲(chóng)中表現(xiàn)出生理學(xué)活性的黃酮。
      下列實(shí)施例將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。除非特別說(shuō)明,可根據(jù)分子克隆(Sambrook等,1989)進(jìn)行分子生物學(xué)方法。
      實(shí)施例1.克隆紫蘇黃酮合酶II基因從紫蘇(Perilla frutescens)葉中提取RNA,通過(guò)Oligotex得到polyA+RNA。根據(jù)Gong等(植物分子生物學(xué),35(1997),Gong等,p.915)的方法,將polyA+RNA用作模板以使用λgt10(Stratagene)為載體來(lái)制備cDNA文庫(kù)。使用全長(zhǎng)CYP93B1 cDNA為探針篩選cDNA文庫(kù)。根據(jù)廠商推薦的方法,在低嚴(yán)緊條件下使用DIG-DNA-標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(Boehringer)進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選和檢測(cè)。
      具體地說(shuō),42℃下,使用雜交緩沖液(5×SSC,30%甲酰胺,50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0),1%SDS,2%阻斷試劑(Boehringer),0.1%月桂酰基肌氨酸,80微克/ml鮭精DNA)預(yù)雜交2小時(shí),然后加入DIG標(biāo)記的探針,將混合物放置過(guò)夜。65℃下,用含有1%SDS的5×SSC洗滌溶液將膜浸洗1.5小時(shí)。得到一個(gè)陽(yáng)性克隆,將其稱為噬菌體克隆#3。通過(guò)測(cè)定#3 cDNA之5’末端的核苷酸序列,預(yù)期#3 cDNA編碼與甘草CYP93B1編碼的黃烷酮2-羥化酶具有高同一性的序列,推測(cè)其編碼功能類似于黃烷酮2-羥化酶的P450。
      所得#3 cDNA編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸水平上與CYP93B1所編碼的黃烷酮2-羥化酶具有52%的同一性。紫蘇克隆#3 cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO.1,由其推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2。
      實(shí)施例2.在酵母中表達(dá)紫蘇黃酮合酶II基因進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)實(shí)施例1所得紫蘇cDNA#3編碼的蛋白質(zhì)的酶活性。將實(shí)施例1所得的噬菌體克隆#3用作PCR(使用λArm引物(Stratagene))模板。PCR條件是98℃1分鐘;98℃15秒,55℃10秒,74℃30秒共20個(gè)循環(huán);接著74℃10分鐘。將擴(kuò)增的DNA片斷亞克隆至pBluescript KS(-)的EcoRV位點(diǎn)。選擇在pBluescript KS(-)的SalI位點(diǎn)具有紫蘇#3 cDNA起始密碼子的克隆,將其稱為pFS3。測(cè)定pFS3 cDNA的核苷酸序列,進(jìn)行PCR以證實(shí)不存在錯(cuò)誤。
      將通過(guò)用SalI和XbaI消化pFS3得到的約1.8kb的DNA片斷與用XhoI和XbaI預(yù)消化的pYES2連接,產(chǎn)生質(zhì)粒pYFS3。然后將所得質(zhì)粒導(dǎo)入BJ2168酵母(Nihon Gene)。通過(guò)Akashi等(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等,p.287)所述的方法測(cè)定酶活性。30℃,在20ml選擇培養(yǎng)基(6.7mg/ml無(wú)氨基酸的酵母含氮堿基(Difco),20mg/ml葡萄糖,30微克/ml亮氨酸,20微克/ml色氨酸和5mg/ml酪蛋白氨基酸)中將轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。
      離心收集酵母細(xì)胞之后,30℃,在表達(dá)培養(yǎng)基(10mg/ml酵母提取物,10mg/ml蛋白胨,2微克/ml氯高鐵血紅素,20mg/ml半乳糖)中將收集的酵母細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。收集酵母細(xì)胞之后,通過(guò)懸浮在水中并收集細(xì)胞以進(jìn)行洗滌。用玻璃珠破碎細(xì)胞10分鐘,然后以8000g的轉(zhuǎn)速離心細(xì)胞10分鐘,以15,000g的轉(zhuǎn)速進(jìn)一步離心上清液10分鐘以得到粗酶級(jí)分。
      30℃下,將15微克(R,S)-柚苷配基(溶解于30微升2-甲氧乙醇中),1ml粗酶溶液和1mM NADPH的混合物(總反應(yīng)混合物體積1.05ml)反應(yīng)2小時(shí)。通過(guò)加入30微升醋酸終止反應(yīng)之后,加入1ml乙酸乙酯并混合。離心后,用蒸發(fā)器干燥乙酸乙酯層,將殘留物質(zhì)溶解于100微升甲醇中并用HPLC進(jìn)行分析。根據(jù)Akashi等(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等,p.287)所述的方法進(jìn)行分析。酸處理包括將蒸發(fā)器干燥的樣品溶解于150微升含有10%鹽酸的乙醇中,攪拌30分鐘。用1.3ml水稀釋,加入800微升乙酸乙酯,混合,離心,回收乙酸乙酯層,然后干燥,溶解于200微升甲醇中并用HPLC進(jìn)行分析。
      表達(dá)pYFS3的酵母由柚苷配基產(chǎn)生了芹菜苷配基,而無(wú)需用酸處理反應(yīng)混合物。這表明紫蘇pFS3 cDNA編碼具有黃酮合酶II活性的蛋白質(zhì)。
      工業(yè)實(shí)用性通過(guò)將本發(fā)明的cDNA與適當(dāng)植物表達(dá)載體連接,并將其導(dǎo)入植物中以表達(dá)或抑制黃酮合酶的表達(dá),即可改變花的顏色。另外,通過(guò)不僅在花瓣中還在整個(gè)植物或其適當(dāng)器官中表達(dá)黃酮合酶基因,可以增加抗植物微生物的抗性,或者通過(guò)促進(jìn)與根際微生物的關(guān)系而改善豆科植物的固氮能力,以及改善植物防紫外線和光照的保護(hù)性作用。
      序列表&lt;110&gt;SUNTORY LIMITED&lt;120&gt;編碼黃酮合成酶的基因&lt;130&gt;
      &lt;160&gt;2&lt;210&gt;1&lt;211&gt;1770&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;紫蘇&lt;220&gt;
      &lt;223&gt;編碼具有直接將黃烷酮轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮之活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列&lt;400&gt;1tgtcgacgga gcaagtggaa atg gca ctg tac gcc gcc ctc ttc ctc ctg tcc 53Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser1 5 10gcc gcc gtg gtc cgc tcc gtt ctg gat cga aaa cgc ggg cgg ccg ccc101Ala Ala Val Val Arg Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro15 20 25tac cct ccc ggg ccg ttc cct ctt ccc atc atc ggc cac tta cac ctc149Tyr Pro Pro Gly Pro Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu30 35 40ctc ggg ccg aga ctc cac caa acc ttc cac gat ctg tcc caa cgg tac197Leu Gly Pro Arg Leu His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr45 50 55ggg ccc tta atg cag ctc cgc ctc ggg tcc atc cgc tgc gtc att gct245Gly Pro Leu Met Gln Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala60 65 70 75
      gcc tcg ccg gag ctc gcc aag gaa tgc ctc aag aca cac gag ctc gtc293Ala Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val80 85 90ttc tcc tcc cgc aaa cac tcc acc gcc att gat atc gtc acc tac gat341Phe Ser Ser Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp95 100 105tca tcc ttc gct ttc tct ccc tac ggg cct tac tgg aaa ttc atc aag389Ser Ser Phe Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys110 115 120aaa tta tgc acc tac gag ctg ctc ggg gcc cga aat ctc gcc cac ttt437Lys Leu Cys Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe125 130 135cag ccc atc agg act ctc gaa gtc aag tct ttc ctc caa att ctt atg485Gln Pro Ile Arg Thr Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met140 145 150 155cgc aag ggt gaa tcg ggg gag agc ttc aac gtg act gag gag ctc gtg533Arg Lys Gly Glu Ser Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val160 165 170aag ctg acg agc aac gtc ata tcg cat atg atg ctg agc ata cgg tgt581Lys Leu Thr Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys175 180 185tca gag acg gag tcg gag gcg gag gcg gcg agg acg gtg att cgg gag629Ser Glu Thr Glu Ser Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu190 195 200gtc acg cag ata ttt ggg gag ttc gac gtc tcc gac atc ata tgg ctt677Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu205 210 215tgt aag aac ttc gat ttc caa ggt ata agg aag cgg tcc gag gat atc725Cys Lys Asn Phe Asp Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile220 225 230 235cag agg aga tat gat gct ctg ctg gag aag atc atc acc gac aga gag773Gln Arg Arg Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg Glu240 245 250aag cag agg cgg acc cac ggc ggc ggt ggc ggc ggc ggg gaa gcc aag821Lys Gln Arg Arg Thr His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Lys255 260 265
      gat ttt ctt gac atg ttc ctc gac ata atg gag agc ggg aaa gcc gaa 869Asp Phe Leu Asp Met Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala Glu270 275 280gtt aaa ttc acg agg gag cat ctc aaa gct ttg att ctg gat ttc ttc 917Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe285 290 295acc gcc ggc acc gac acg acg gcg atc gtg tgt gaa tgg gcg ata gca 965Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala300 305 310 315gaa gtg atc aac aat cca aat gtg ttg aag aaa gct caa gaa gag att1013Glu Val Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile320 325 330gcc aac atc gtc gga ttc gac aga att ctg caa gaa tcc gac gcc cca1061Ala Asn Ile Val Gly Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro335 340 345aat ctg ccc tac ctt caa gcc ctc atc aaa gaa aca ttc cgg ctc cac1109Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His350 355 360cct cca atc cca atg ctg gcg agg aaa tcg atc tcc gac tgc gtc atc1157Pro Pro Ile Pro Met Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile365 370 375gac ggc tac atg att ccg gcc aac acg ctg ctc ttc gtc aac ctc tgg1205Asp Gly Tyr Met Ile Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp380 385 390 395tcc atg ggg cgg aac cct aaa atc tgg gac tac ccg acg gcg ttc cag1253Ser Met Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln400 405 410ccg gag agg ttt ctg gag aag gaa aag gcc gcc atc gat gtt aaa ggg1301Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly415 420 425cag cat ttt gag ctg cta ccg ttc gga acg ggc agg aga ggc tgc cca1349Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro430 435 440ggg atg ctt tta gcc att cag gag gtg gtc atc ata att ggg acg atg1397Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met445 450 455
      att caa tgc ttc gat tgg aag ctg ccc gac ggc tcc ggc cat gtt gat1445Ile Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp460 465 470 475atg gca gaa cgg cca ggg ctc acg gca ccg cga gag acc gat ttg ttt1493Met Ala Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe480 485 490tgc cgt gtg gtg ccg cga gtt gat ccg ttg gtt gtt tcc acc cag1538Cys Arg Val Val Pro Arg Val Asp Pro Leu Val Va1 Ser Thr Gln495 500 505tgatcacccc ctttaaattt attaatgata tatttttatt ttgagaaaaa ataaaaatgc 1598taattgtttt gtttcatgat gtaattgtta attagtttct attgtgcgct gtcgcgtgtc 1658gcgtggctta agataagatt gtatcattgg tacctaggat gtattttcat tttcaataaa 1718ttattttgtg ctgtgtatat taaaaaaaaa aaagaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1770&lt;210&gt;2&lt;211&gt;
      &lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;紫蘇&lt;220&gt;
      &lt;223&gt;具有直接將黃烷酮轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮之活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列&lt;400&gt;2Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser Ala Ala Val Val Arg1 5 10 15Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro Tyr Pro Pro Gly Pro20 25 30Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Arg Leu35 40 45His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Met Gln50 55 60Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala Ala Ser Pro Glu Leu65 70 75 80Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val Phe Ser Ser Arg Lys85 90 95His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe100 105 110
      Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr115 120 125Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe Gln Pro Ile Arg Thr130 135 140Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met Arg Lys Gly Glu Ser145 150 155 160Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn165 170 175Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Thr Glu Ser180 185 190Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe195 200 205Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu Cys Lys Asn Phe Asp210 215 220Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg Tyr Asp225 230 235 240Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg Glu Lys Gln Arg Arg Thr245 250 255His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Lys Asp Phe Leu Asp Met260 265 270Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala Glu Val Lys Phe Thr Arg275 280 285Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp290 295 300Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala Glu Val Ile Asn Asn305 310 315 320Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Ala Asn Ile Val Gly325 330 335Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu340 345 350Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met355 360 365Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile Asp Gly Tyr Met Ile370 375 380Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn385 390 395 400Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln Pro Glu Arg Phe Leu405 410 415
      Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu420 425 430Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Ala435 440 445Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met Ile Gln Cys Phe Asp450 455 460Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp Met Ala Glu Arg Pro465 470 475 480Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe Cys Arg Val Val Pro485 490 495Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln500 50權(quán)利要求
      1.基因,其編碼具有序列表之SEQ ID NO2所示氨基酸序列并顯示出由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì),或編碼具有下述氨基酸序列之一種并具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì),其中這些氨基酸序列已通過(guò)添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或用不同氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)取代而被修飾。
      2.權(quán)利要求1的基因,其編碼的氨基酸序列與序列表之SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少具有55%的同一性,并具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
      3.權(quán)利要求1或2的基因,其在5×SSC,50℃下,能與序列表之SEQID NO1所示核苷酸序列的全部或部分雜交,并且編碼具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)。
      4.載體,其含有權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因。
      5.由權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因編碼的蛋白質(zhì)。
      6.生產(chǎn)具有黃酮合成活性之蛋白質(zhì)的方法,其特征在于培養(yǎng)或生長(zhǎng)權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化的宿主并從所述宿主中回收所述蛋白質(zhì)。
      7.使用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因生產(chǎn)具有改變的類黃酮組成和/或類黃酮量的植物的方法。
      8.使用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因生產(chǎn)具有改變的黃酮量的植物的方法。
      9.使用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因生產(chǎn)具有改變的花顏色的植物的方法。
      10.使用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因生產(chǎn)花顏色變藍(lán)的植物的方法。
      11.使用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因生產(chǎn)花顏色變紅的植物的方法。
      12.使用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因生產(chǎn)具有改變的光敏性的植物的方法。
      13.使用權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的基因控制植物和微生物的相互作用的方法。
      全文摘要
      從例如紫蘇中得到的編碼可直接將黃烷酮轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮的酶的DNA及其用途;DNA和所編碼酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO1&2。將該基因?qū)胫参镏锌衫绺淖冎参锏幕ㄉ?br> 文檔編號(hào)C12N15/82GK1624136SQ20041010007
      公開(kāi)日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月19日
      發(fā)明者水谷正子, 田中良和, 久住高章, 綾部真一, 明石智義 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社, 三得利花業(yè)株式會(huì)社
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