一種聚（癸二?；视投ィ┰谥苽湟暰W(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞載體中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞載體及其制備方法領(lǐng)域，特別涉及一種聚（癸二?；视投ィ?在制備視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞載體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 老年性黃斑變性（AMD)和色素性視網(wǎng)膜炎（RP)是造成視神經(jīng)元退化變性進(jìn)而導(dǎo) 致視力缺陷的兩個(gè)主要因素。新發(fā)展的治療手段可將病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)元重建。由此發(fā)展 出多種治療方法，比如基因治療、生長(zhǎng)因子治療和小分子藥物療法。但這些治療方法只能延 緩病變惡化，不能從根本上治療疾病。近年來(lái)，數(shù)據(jù)顯示體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞元移植到 體內(nèi)替換病變組織的治療方法得到越來(lái)越多的關(guān)注。但尋找一種合適的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)作為 細(xì)胞的遞送載體成為這一治療方法突破的關(guān)鍵。聚（癸二?；视投ィPoly (sebacoyl diglyceride)，PSeD]是新近研制的功能化可降解聚酯，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的 應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供聚（癸二酰基甘油二酯）在制備視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì) 胞載體中的應(yīng)用，該發(fā)明中的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞遞送載體，具有良好的生物相容性，細(xì)胞的炎 癥表達(dá)和細(xì)胞凋亡因子低，而且具有優(yōu)異的促神經(jīng)分化功能。
[0004] 本發(fā)明的聚（癸二?；视投ィ┰谥苽湟暰W(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞載體中的應(yīng)用，視網(wǎng)膜 祖細(xì)胞RPCs在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞載體上進(jìn)行增殖、分化和迀移；其中，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞載體 的成分包括聚（癸二?；视投ィ㏄SeD。
[0005] 所述PSeD的分子式為
[0006] 所述PSeD的分子式中n = 10-300。
[0007] 所述PSeD的制備方法包括：將二縮水甘油癸二酸值單體、等摩爾量的癸二酸和催 化量的四丁基溴化銨溶解在DMF中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下的干燥的反應(yīng)管中150°C反應(yīng)24小時(shí)，沉 淀純化，真空干燥，即得。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)RPCs的分離和培養(yǎng)、PSeD/PLGA對(duì)RPCs的增殖和分化作用、免疫細(xì)胞 化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡分析、總RNA分離及質(zhì)量控制、逆轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)、細(xì)胞 毒性分析、創(chuàng)傷愈合和統(tǒng)計(jì)分析來(lái)表征PSeD對(duì)RPCs行為的影響。
[0009] 有益效果
[0010] 本發(fā)明的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞遞送載體，具有良好的生物相容性，細(xì)胞的炎癥表達(dá)和 細(xì)胞凋亡因子低，而且具有優(yōu)異的促神經(jīng)分化功能，具有很大的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為實(shí)施例1中PSeD對(duì)RPCs的細(xì)胞毒性的表征；A :在增殖條件下，炎癥因子 (MCP-1)的表達(dá)和細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)通過(guò)qPCR分析；B :RPCs在PSeD和PLGA支架以及對(duì) 照組上培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡因子（Caspase-3)表達(dá)；C:增殖條件下培養(yǎng)三天，測(cè)量RPC細(xì)胞粘 附因子cadherin 4的表達(dá)；D :RPC細(xì)胞在PSeD和PLGA支架上培養(yǎng)對(duì)于通過(guò)乳酸脫氫酶釋 放試驗(yàn)（LDH assays)與對(duì)照組的比較；
[0012] 圖2為實(shí)施例1中PSeD對(duì)RPCs的分化影響；A為在分化條件下，RPCs在PSeD上 的生長(zhǎng)情況；B-D為qPCR分析；E-J為蛋白質(zhì)印跡分析；a中比例尺：100 ym ;b中比例尺： 50 u m ；
[0013] 圖3為實(shí)施例1中利用免疫染色分析對(duì)PSeD對(duì)RPC分化的影響；其中，生 長(zhǎng)在P S e D上RP C s中含視覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物包括：0 3-管蛋白 (A-D)，rhodopsin (E-H)，GFAP (I-L);比例尺為 100 y m;
[0014] 圖4為實(shí)施例1中創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)的效果數(shù)據(jù)；其中，A為創(chuàng)口愈合圖；B為創(chuàng)口愈 合程度數(shù)據(jù)；C為細(xì)胞的迀移速度；比例尺為200 y m。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] PSeD 的合成。
[0018] 二縮水甘油癸二酸酯單體、等摩爾量的癸二酸和催化量的四丁基溴化銨 (TCI，>99. 0% )溶解在DMF中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的干燥的反應(yīng)管中加熱（150°C )反應(yīng)24小時(shí)。 然后反應(yīng)液用乙醚沉淀純化三次，然后將沉淀物抽真空干燥獲得PSeD。
[0019] 通過(guò)RPCs的分離和培養(yǎng)、PSeD/PLGA對(duì)RPCs的增殖和分化作用、免疫細(xì)胞化學(xué)、 蛋白質(zhì)印跡分析、總RNA分離及質(zhì)量控制、逆轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)、細(xì)胞毒性分 析、創(chuàng)傷愈合和統(tǒng)計(jì)分析來(lái)表征PSeD對(duì)RPCs行為的影響。
[0020] 實(shí)施例中的NC表示無(wú)材料空白試驗(yàn)組。
[0021] (l)RPCs的分離和培養(yǎng)
[0022] 本發(fā)明所用動(dòng)物均依照視覺(jué)與眼科協(xié)會(huì)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照Schepens眼 科研究所動(dòng)物飼養(yǎng)使用委員會(huì)審批過(guò)的程序進(jìn)行。視網(wǎng)膜神經(jīng)祖細(xì)胞從出生1天的綠色熒 光蛋白呈陽(yáng)性（GFP+)的轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠身上獲得，合并視網(wǎng)膜經(jīng)過(guò)切碎及幾個(gè)周期 0. 1 %的I型膠原蛋白酶消化進(jìn)行分離。分離的RPCs用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾， 在轉(zhuǎn)速為800rpm下離心4min，將細(xì)胞在含有DMEM/F12 (Invitrogen)，1 % N2神經(jīng)供給物 (Invitrogen)，2mML_ 谷氨酰胺（Invitrogen)，100U/ml 青霉素-鏈霉素（Invitrogen)，and 20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子（EGF，Invitr〇gen)的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞種植在培養(yǎng)皿中 并每隔3-4天傳代一次。為了對(duì)細(xì)胞的分化情況進(jìn)行分析，將增殖培養(yǎng)液用分化培養(yǎng)液替 代，將其中表皮生長(zhǎng)因子（EGF)除去，并加入10%的胎牛血清（Invitrogen)。用于細(xì)胞培養(yǎng) 的聚合物樣品涂膜于聚苯乙稀組織培養(yǎng)板（Tissue culture-treated polystyrene, TCPS) 上。將濃度為lg/1的PSeD和PLGA(作為對(duì)照）的甲醇溶液分別加入到12孔聚苯乙烯組 織培養(yǎng)板（tissue culture-treated polystyrene, TCPS)中（80 yl/孔）。待甲醇揮發(fā)后， 置于真空中抽吸12小時(shí)進(jìn)一步去除溶劑獲得涂膜的組織培養(yǎng)板。將組織培養(yǎng)板置于紫外 光下30min進(jìn)行殺毒，然后用lml磷酸鹽緩沖液清洗三次，再用lml培養(yǎng)液潤(rùn)洗，接著種上 RPCs，進(jìn)行培養(yǎng)。
[0023] (2) PSeD/PLGA對(duì)RPCs的增殖和分化作用
[0024] RPCs在PSeD/PLGA的生長(zhǎng)情況分別在培養(yǎng)第1，3，5天時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)落射熒光顯微 鏡（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)進(jìn)行拍照觀察，其增殖情況通過(guò)CCK-8試劑盒 (cell counting kit-8, Do jindo, Kumamoto, Japan)進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)在 96 孔板， 濃度為1 X 104個(gè)細(xì)胞/孔，CCK8溶液在第一天，第二天，第三天直接加入孔板中，在37°C繼 續(xù)培養(yǎng)4h后，用ELISA讀板器（ELX800, BioTeK，USA)測(cè)量其在450nm處的吸光度，細(xì)胞活 性用A450值進(jìn)行表示。為了表征在分化條件下，生長(zhǎng)在PSeD上的RPCs細(xì)胞形態(tài)，在第三 天的時(shí)候用標(biāo)準(zhǔn)落射焚光顯微鏡（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)放大10倍和20 倍進(jìn)行拍攝。
[0025] (3)免疫細(xì)胞化學(xué)
[0026] RPCs在培養(yǎng)三天后（增殖條件下）或者七天后（分化條件下），RPC-PSeD，RPC-PLGA和RPC-glass復(fù)合物用磷酸緩沖液（PBS)潤(rùn)洗三次然后室溫下用多聚甲 醛（Invitrogen)固定15分鐘。磷酸緩沖液潤(rùn)洗三次后，細(xì)胞固定在固定液（磷酸緩沖 液包括10%常規(guī)羊血清（111￥；[1：1'(^611)，0.3%1'1'；[1:011父-100(31區(qū)1]13-八1(11'；[(311)和0.1% NaN3(Sigma-Aldrich))中1小時(shí)。4°C下與初級(jí)抗體培育過(guò)夜，然后細(xì)胞與二級(jí)抗體繼 續(xù)培育（Alexa Fluor546_goat anti-mouse/rabbit，BD，l:800)，繼續(xù)水洗。細(xì)胞核用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI ;Invitr0gen)染色。免疫細(xì)胞利用熒光顯微鏡（Olympus BX51，Japan)觀察，拍照。免疫活性細(xì)胞比例根據(jù)劃分由DAPI染色的細(xì)胞核數(shù)目確定。每組 隨機(jī)劃取區(qū)域分別觀測(cè)到共500至1000細(xì)胞。數(shù)據(jù)收集使用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD)0
[0027] 5_ 漠 _2_ 脫氧尿昔（BrdU)慘雜：在 10yM BrdU (Sigma-Aldrich, Poole, UK)存在 條件下培養(yǎng)8小時(shí)，室溫下用4%的多聚甲醛處理樣品15分鐘然后用封閉緩沖液（PBS含 有 10% 的 NGS，0. 3% riton X-100,和 100 y g/ml RNaseA)培育 60 分鐘。細(xì)胞隨后用 PBS 潤(rùn)洗，室溫下用2M HC1培育30分鐘，然后先用PBS再用漢克斯平衡鹽溶液（HBSS)室溫 下潤(rùn)洗。4°C下利用抗 BrdU 抗體在培育過(guò)夜（1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA，USA)，細(xì)胞用PBS潤(rùn)洗，和熒光共輒二級(jí)抗體（Alexa Fluor488-goat anti-mouse，1:800)室溫下培育1小時(shí)。細(xì)胞核利用DAPI染色。免疫活性細(xì)胞利用熒光顯 微鏡（Olympus BX51, Japan)觀察，拍照。
[0028] (4)蛋白質(zhì)印跡分析
[0029]使用 RIPA(Radioimmunopr