20(R)-人參皂苷Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及了一種20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物及 其制備方法和應(yīng)用，屬于藥品保健品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參皂巧Rg3是原人參二醇型四環(huán)S祗皂巧，分子式為C4出72化3，相對(duì)分子質(zhì)量為 784.30,化學(xué)名為20(R)-達(dá)瑪燒締二醇-3-O-0-D-葡萄化喃糖基（1-2)-0-0-葡萄化喃糖。人 參皂巧Rg3主要有巧巾常見構(gòu)型，20(R)-Propanaxadiol和20(S)-Propanaxadiol，其中20 (R)-Propanaxadiol為優(yōu)勢(shì)構(gòu)型。20(R)-人參皂巧Rg3(20(R)-ginsenosides Rg3)是中國(guó)第 一個(gè)中藥單體抗癌新藥，是人參皂巧中起抗腫瘤作用的有效成分之一，可W有效抑制腫瘤 新生血管增長(zhǎng)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移等，對(duì)前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌等癌癥具有較好 的治療效果。單獨(dú)使用R的的缺點(diǎn)是水溶性和脂溶性都很低，因此，其生物利用度低。
[0003] 脂質(zhì)體作為一種非病毒載納米載體材料具有適合體內(nèi)降解、毒性低和免疫原性、 提高藥物生物利用度、降低藥物毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。其作為藥物載體已有30多年的歷史，脂質(zhì) 體作為給藥載體可W有效的實(shí)現(xiàn)藥物的祀向，提高藥物的局部保存濃度，延長(zhǎng)藥物作用時(shí) 間，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷力，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用等。
[0004] 目前，抗腫瘤藥物的祀向細(xì)胞遞送受到廣泛關(guān)注，大量研究結(jié)果表明，多數(shù)腫瘤細(xì) 胞表面上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細(xì)胞，并且葉酸(folic acid,FA)對(duì)葉 酸受體具有高度親和性。因此可將抗腫瘤藥物與FA偶聯(lián)，經(jīng)葉酸受體介導(dǎo)祀向遞送到運(yùn)些 腫瘤細(xì)胞中，而且FA作為祀向分子具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如相對(duì)分子質(zhì)量小、無(wú)免疫原性、 價(jià)廉易得、穩(wěn)定性好、與藥物分子或載體之間的化學(xué)鍵合簡(jiǎn)單易行，祀向應(yīng)用范圍廣泛等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類 月旨/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的復(fù)合脂質(zhì)體藥物毒性低，具有 祀向性，能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝入率，有效提高其生物利用度。
[0006] 發(fā)明構(gòu)思是:本發(fā)明W20(R)-人參皂巧Rg3、氨基甲酸型陽(yáng)離子類脂為主要材料， 輔W膽固醇制備脂質(zhì)體，采用薄膜分散超聲方法實(shí)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)20(R)-人參皂巧RgS 的有效包封，經(jīng)過(guò)葉酸祀向修飾制備成祀向脂質(zhì)體藥物。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[000引一種20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物組成包括20(R)-人參皂巧Rg3、陽(yáng)離子類脂、膽固醇和葉酸，其中陽(yáng)離子類脂與膽固醇摩爾比為1:1~6:1;陽(yáng) 離子類脂與20(R)-人參皂巧R的的質(zhì)量比為5:1~15:1;葉酸的終濃度為10~40iig/mL。
[0009] 優(yōu)選的，所述的陽(yáng)離子類脂與膽固醇摩爾比為3:1。
[0010] 優(yōu)選的，所述的步驟(3)葉酸的終濃度為20yg/mL。
[0011]優(yōu)選的，所述陽(yáng)離子類脂為氨基甲酸脂型陽(yáng)離子類脂，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如I所示：
[oou] 其中，Ri為（C出）iiC出；
[0014] R2 為 C出、C出 C出；
[0015] X 為 Cl、Br、I。
[0016] 進(jìn)一步的，Ri為（C出）IiC出，R2為C出，X為I。
[0017]采用上述氨基甲酸脂型陽(yáng)離子類脂制備的脂質(zhì)體屬于抑敏感型，抑= 7-7.5穩(wěn)定， 抑=4-5易降解進(jìn)而釋放藥物。本發(fā)明是基于腫瘤組織間質(zhì)處的抑值比正常組織低，細(xì)胞內(nèi) 的溶酶體酶抑=4.5左右的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的一種具有細(xì)胞內(nèi)溶酶體祀向和控制藥物釋放作用 的脂質(zhì)體。
[0018] 本發(fā)明第二個(gè)目的是請(qǐng)求保護(hù)上述20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉 酸脂質(zhì)體藥物的制備方法，包括W下步驟：
[0019] (1)將陽(yáng)離子類脂溶于氯仿中，加入膽固醇，震蕩使其充分混合均勻，用氮?dú)饬鞔?干形成均勻薄膜，放置真空干燥箱中過(guò)夜，制備空白脂質(zhì)體；
[0020] (2)將20(R)-人參皂巧Rg3預(yù)先溶解在無(wú)水乙醇中配制成20(R)-人參皂巧Rg3溶 液，按脂藥比5:1~15:1向步驟（1)中空白脂質(zhì)體加入20(R)-人參皂巧R的溶液和雙蒸水浸 泡，在45~55°C下反復(fù)超聲振蕩使膜溶解至澄清，制得20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì)體；
[0021] (3)加入葉酸溶液復(fù)合20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì)體，在常溫下超聲振蕩至澄清，審U 得葉酸祀向性修飾的20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟(2)20(R)-人參皂巧R的溶液濃度為2mg/mL。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟(2)20(R)-人參皂巧R的溶液和雙蒸水的體積比為2:8。
[0024] 本發(fā)明另一個(gè)目的是請(qǐng)求保護(hù)上述20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉 酸脂質(zhì)體藥物在抗癌、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明提供一種能同時(shí)裝載藥物和復(fù)合葉酸的復(fù)合祀向脂質(zhì)體藥物，本發(fā)明的復(fù) 合脂質(zhì)體采用新型陽(yáng)離子類脂，較好的降低了構(gòu)建脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化陽(yáng) 離子類脂與膽固醇的配比得到20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì)體，減小了 20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì) 體的粒徑，同時(shí)增強(qiáng)了脂質(zhì)體藥物的穩(wěn)定性;再經(jīng)過(guò)葉酸對(duì)包封20(R)-人參皂巧Rg藥物脂 質(zhì)體祀向修飾后，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的祀向藥物遞送。
[0026] 本發(fā)明的20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體對(duì)藥物具有高包 封率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì)體包封率可W達(dá)到90% W上，本發(fā)明 的復(fù)合脂質(zhì)體20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/葉酸脂質(zhì)體藥物的制備方法簡(jiǎn)單、 高效，制備出的復(fù)合脂質(zhì)體細(xì)胞毒性低、具有緩釋性，延長(zhǎng)藥物的療效，在物理學(xué)表征和體 外生物學(xué)研究中均已得到了良好的評(píng)價(jià)效果，安全高效、祀向性強(qiáng)、為抗癌藥物的研究開發(fā) 提供了新的途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為20(R)-人參皂巧R的標(biāo)準(zhǔn)品在203nm處液相圖譜；
[00%]圖2為20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì)體方法專屬性試驗(yàn)色譜圖；其中，A為空白脂質(zhì)體，B 為人參皂巧Rg3脂質(zhì)體；
[0029] 圖3為203nm波長(zhǎng)測(cè)定的包封率測(cè)定結(jié)果；
[0030] 圖4為脂質(zhì)體粒徑分布圖；
[0031 ]圖5為脂質(zhì)體電荷分布圖；
[0032] 圖6為透射電鏡(TEM)檢測(cè)結(jié)果圖，其中A為陽(yáng)離子類脂/膽固醇脂質(zhì)體TEM檢測(cè)分 析圖；B為20(R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/脂質(zhì)體TEM檢測(cè)分析圖；C為FA10-20 (R)-人參皂巧Rg3/陽(yáng)離子類脂/膽固醇/脂質(zhì)體TEM檢測(cè)分析圖；
[0033] 圖7為不同脂藥比的人參皂巧Rg3脂質(zhì)體作用于葉酸受體(FR)陽(yáng)性表達(dá)率較高的 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系化460)細(xì)胞毒性的測(cè)定結(jié)果;其中1為空白脂質(zhì)體，2為脂藥比5:1的 R的脂質(zhì)體，3為脂藥比10:1的Rg3脂質(zhì)體，4為脂藥比15:1的Rg3脂質(zhì)體。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，但不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，如無(wú)特 殊說(shuō)明，本發(fā)明所設(shè)及化學(xué)試劑及藥品均市售可得，如無(wú)特殊說(shuō)明，所設(shè)及的方法均為常規(guī) 方法。
[0035] 陽(yáng)離子類脂孤CTMA/膽固醇脂質(zhì)體制備及包封藥物
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 準(zhǔn)確稱取陽(yáng)離子類脂DDCTMA溶于氯仿中（Img/lmL)，加入膽固醇(類脂與膽固醇摩 爾比為1:1)，震蕩使其充分混合均勻。用氮?dú)饬鞔蹈尚纬删鶆虮∧?，放置真空干燥箱中過(guò) 夜，用于制備空白脂質(zhì)體。
[003引將20(R)-人參皂巧R的藥物預(yù)先溶解在無(wú)水乙醇中，配制成2mg/血的溶液，再按照 比例加入對(duì)應(yīng)體積量。按脂藥比5:1的比例分別加入人參皂巧Rg3無(wú)水乙醇和雙蒸水（比例 為2:8)浸泡約化，在55°C下反復(fù)超聲振蕩使膜溶解至澄清，制得藥物脂質(zhì)體20(R)-人參皂 巧Rg3脂質(zhì)體。
[0039] 加入葉酸溶液終濃度為10蛇/血、20蛇/111^30蛇/111^40蛇/血分別復(fù)合20(1〇-人參 皂巧Rg3脂質(zhì)體藥物，在常溫下超聲振蕩至澄清，制得葉酸祀向性修飾的藥物脂質(zhì)體。
[0040] 實(shí)施例2
[0041] 準(zhǔn)確稱取陽(yáng)離子類脂DDCTMA溶于氯仿中（Img/lmL)，加入膽固醇(類脂與膽固醇摩 爾比為3:1)，震蕩使其充分混合均勻。用氮?dú)饬鞔蹈尚纬删鶆虮∧?，放置真空干燥箱中過(guò) 夜，用于制備空白脂質(zhì)體。
[0042] 將20(R)-人參皂巧R的藥物預(yù)先溶解在無(wú)水乙醇中，配制成2mg/血的溶液，再按照 比例加入對(duì)應(yīng)體積量。分別按脂藥比10:1的比例分別加入人參皂巧Rg3無(wú)水乙醇和雙蒸水 (比例為2:8)浸泡約化，在55°C下反復(fù)超聲振蕩使膜溶解至澄清，制得藥物脂質(zhì)體20(R)-人 參皂巧Rg3脂質(zhì)體。
[0043] 加入葉酸溶液終濃度為10蛇/血、20蛇/111^30蛇/111^40蛇/血分別復(fù)合20(1〇-人參 皂巧Rg3脂質(zhì)體藥物，在常溫下超聲振蕩至澄清，制得葉酸祀向性修飾的藥物脂質(zhì)體FAlO-孤 CTMA-R 的、FA20-孤 CTMA-R 的、FA30-孤 CTMA-R 的、FA40-孤 CTMA-R 的。
[0044] 實(shí)施例3
[0045] 準(zhǔn)確稱取陽(yáng)離子類脂DDCTMA溶于氯仿中（Img/lmL)，加入膽固醇(類脂與膽固醇摩 爾比為6:1)，震蕩使其充分混合均勻。用氮?dú)饬鞔蹈尚纬删鶆虮∧ぃ胖谜婵崭稍锵渲羞^(guò) 夜，用于制備空白脂質(zhì)體。
[0046] 將20(R)-人參皂巧R的藥物預(yù)先溶解在無(wú)水乙醇中，配制成2mg/血的溶液，再按照 比例加入對(duì)應(yīng)體積量。按脂藥比15:1的比例分別加入人參皂巧R的無(wú)水乙醇和雙蒸水(比例 為2:8)浸泡約化，在55°C下反復(fù)超聲振蕩使膜溶解至澄清，制得藥物脂質(zhì)體20(R)-人參皂 巧Rg3脂質(zhì)體。
[0047] 加入葉酸溶液終濃度為10蛇/血、20蛇/111^30蛇/111^40蛇/血復(fù)合20(1〇-人參皂巧 R的脂質(zhì)體藥物，在常溫下超聲振蕩至澄清，制得葉酸祀向性修飾的藥物脂質(zhì)體。
[004引實(shí)施例4 20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì)體包封率測(cè)定
[0049] (11確定檢測(cè)波長(zhǎng):采用高效液相色譜法
[0050] 精密稱取20 (R)-人參皂巧R的標(biāo)準(zhǔn)品20化進(jìn)樣分析，記錄峰面積。見附圖1。
[0化1 ]間色譜條件
[0052]色譜柱:Agilent?〇DS Cis柱（4.6X250mm，5皿）；流動(dòng)相：乙臘：水(V:V = 45:55); 檢測(cè)波長(zhǎng):203nm;流速:0.7mL/min;進(jìn)樣量:柱溫:室溫。
[005引間方法專屬性試驗(yàn)
[0054]分別精密移取20(R)-人參皂巧Rg3標(biāo)準(zhǔn)品、空白脂質(zhì)體、實(shí)施例2制備所得20(R)-人參皂巧Rg3脂質(zhì)體適量20化進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果見附圖2，結(jié)果表明，空白脂質(zhì)體、 各輔料及溶劑對(duì)藥物測(cè)定無(wú)干擾。
[005引（4飽封率測(cè)定方法
[0056] 采用超濾離屯、法分離游離藥物來(lái)測(cè)定人參皂巧Rg3脂質(zhì)體的包封率。
[0057] ①取制備好的人參皂巧Rg3脂質(zhì)體溶液0.3mL，置于超濾離屯、管(截留分子量為10， 000)頂部套管內(nèi)。20000rpm離屯、lOmin。取下超濾離屯、管