共表達SAL-2和hLYZ雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及構(gòu)建重組腺病毒的方法，具體說，是共表達SAL-2和hLYZ雙抑菌基因 重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛乳房炎又被稱為奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到外界刺激或致病菌感染時所發(fā) 生的一種炎癥反應(yīng)。其不僅會引起奶牛產(chǎn)乳量的下降，縮短奶牛的更替周期，嚴重時甚至?xí)?造成患病奶牛泌乳能力的完全喪失。因此，奶牛乳房炎的臨床防治卻是一直困擾奶牛養(yǎng)殖 業(yè)的一大難題。目前該病的防治主要通過提過規(guī)范化養(yǎng)殖管理及使用抗生素和化療藥物， 但由于不同地區(qū)致病菌的差異以及抗生素等的長期不規(guī)范使用，在治療過程中產(chǎn)生的細菌 耐藥性等問題常常給地區(qū)性奶牛乳房炎的治療帶來困難。因此，臨床上亟需一種新的研究 策略來防治奶牛乳房炎，應(yīng)對以上問題。
[0003] 目前，隨著基因療法的日益興起，使用基因藥物代替常規(guī)抗生素預(yù)防和治療奶牛 乳房炎，已成為應(yīng)對抗生素濫用導(dǎo)致的細菌耐藥性增強等一系列問題的研究重點和熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種共表達SAL-2和hLYZ雙抑菌基因重組 腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用。將SAL-2對金黃色葡萄球菌的廣譜抑菌效果、 hLYZ廣泛高效抑菌且不會損傷哺乳動物細胞的特性和腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源 基因的優(yōu)勢結(jié)合起來，構(gòu)建出可以共表達上述基因的重組腺病毒，最終檢驗在腺病毒介導(dǎo) 下SAL-2和hLYZ對奶牛乳房炎主要致病菌的聯(lián)合抑菌作用。為進一步利用重組腺病毒在 體內(nèi)外抑制奶牛乳房炎致病菌的生長及研制奶牛乳房炎治療和預(yù)防疫苗奠定實驗基礎(chǔ)。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種共表達SAL-2和hLYZ雙 抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0006] 1)從金黃色葡萄球菌噬菌體基因組DNA和人乳體細胞總RNA中分別擴增出SAL-2 基因序列GI:NC_009875 和hLYZ基因序列GI:NM_000239 ;
[0007] 所述的SAL-2基因和hLYZ基因的擴增包括：以SAL-FSEQIDNO: 1和SAL-RSEQ IDN0 :2為引物，以金黃色葡萄球菌噬菌體基因組DNA為模版，擴增SAL-2基因序列；以 LYZ-FSEQIDN0:3和LYZ-RSEQIDN0:4為引物，以人乳體細胞總RNA為模版，擴增hLYZ 基因序列；以rSAL-FSEQIDN0:5和rSAL-RSEQIDN0:6為引物，以金黃色葡萄球菌噬 菌體基因組DNA為模版，擴增兩端為不同限制性酶切位點的SAL-2基因序列；
[0008] 2)將獲得的目的基因分別克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭載體中，線性化重 組穿梭載體后與骨架載體pAdeasy-1共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞，使其在BJ5183 內(nèi)進行同源重組，構(gòu)建了包含目的基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SAL-LYZ;
[0009] 3)將重組腺病毒質(zhì)粒由PacI酶切后，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝獲得 重組腺病毒Ad-SAL-LYZ。
[0010] 所述的構(gòu)建共表達SAL-2和hLYZ基因重組腺病毒的方法制備的重組腺病毒。
[0011] 所述的構(gòu)建共表達SAL-2和hLYZ基因重組腺病毒的方法制備的重組腺病毒在防 治乳房炎小鼠模型中細菌性疾病生物制品方面的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：SAL-2對金黃色葡萄球菌的廣譜抑菌效果、hLYZ廣泛抑菌 且不會損傷動物細胞的特性和腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的優(yōu)勢結(jié)合起來，構(gòu) 建出可以共表達上述基因的重組腺病毒，檢驗在腺病毒介導(dǎo)下SAL-2和hLYZ基因?qū)δ膛?乳房炎小鼠模型主要致病菌的聯(lián)合抑菌作用。通過檢測重組腺病毒在J1EK293細胞中表達 蛋白對大腸桿菌（K88)、金黃色葡萄球菌（CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌（ATCC12228)、 停乳鏈球菌（ATCC9809)和無乳鏈球菌等多株乳房炎致病菌的抑菌活性和最小抑菌濃度 (MIC)，綜合評價了重組腺病毒對奶牛乳房炎小鼠模型主要致病菌的抑菌作用，研究結(jié)果顯 示重組腺病毒在體外表達的目的蛋白可以有效抑制除K88之外的其他菌株，且葡萄球菌最 為敏感。本發(fā)明最終研制出一種針對乳房炎動物模型細菌性疾病的廣譜疫苗。
【附圖說明】
[0013] 圖1是SAL-2和hLYZ基因PCR/RT-PCR擴增結(jié)果（M:DL250bpDNA分子質(zhì)量標準； 1 :SAL-2基因PCR擴增產(chǎn)物；2 :hLYZ基因RT-PCR擴增產(chǎn)物）。
[0014] 圖2是腺病毒穿梭載體的PCR擴增結(jié)果（M:DL250bpDNAMarker;1 :SAL-2基因 PCR擴增產(chǎn)物；2 :hLYZ基因PCR擴增產(chǎn)物；3 :SAL-LYZPCR擴增產(chǎn)物）。
[0015] 圖3是腺病毒穿梭載體雙酶切鑒定結(jié)果（M:DLlkbDNAMarker;1 :pShuttle-LYZ 經(jīng)SeaI和XhoI的雙酶切產(chǎn)物；2 :pShuttle_SAL經(jīng)SeaI和XhoI的雙酶切產(chǎn)物；3: pShuttle-SAL-LYZ經(jīng)BglII和XhoI的雙酶切產(chǎn)物；4:pShuttle-SAL-LYZ經(jīng)SeaI和Xho I的雙酶切產(chǎn)物；5 :pShuttle-SAL-LYZ經(jīng)BglII和NotI的雙酶切產(chǎn)物）。
[0016] 圖4是重組腺病毒質(zhì)粒的電泳結(jié)果（M:DL1KbDNAMarker;1:重組腺病毒質(zhì)粒 pAd-SAL;2:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-LYZ;3:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SAL-LYZ;4:重組腺病毒質(zhì) 粒pAd-GFP)〇
[0017] 圖5是重組腺病毒質(zhì)粒的PacI酶切鑒定結(jié)果（M:DL1KbDNAMarker;1:重組腺 病毒質(zhì)粒pAd-SAL的PacI酶切產(chǎn)物；2:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-LYZ的PacI酶切產(chǎn)物；3: 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SAL-LYZ的PacI酶切產(chǎn)物；4:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GFP的PacI酶 切產(chǎn)物）。
[0018] 圖6是重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞產(chǎn)生CPE圖（10X)(A:正常HEK293細胞 圖；B:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SAL轉(zhuǎn)染HEK293細胞CPE圖；C:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-LYZ轉(zhuǎn)染 HEK293細胞CPE圖；D:重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SAL-LYZ轉(zhuǎn)染HEK293細胞CPE圖；E:重組腺病 毒質(zhì)粒pAd-GFP轉(zhuǎn)染HEK293細胞CPE圖）。
[0019] 圖7是重組腺病毒感染HEK293細胞熒光檢測圖（20X)(A:重組腺病毒Ad-SAL感 染HEK293細胞后24h熒光圖；B:重組腺病毒Ad-LYZ感染HEK293細胞后24h熒光圖；C:重 組腺病毒Ad-SAL-LYZ感染HEK293細胞后24h熒光圖；D:重組腺病毒Ad-GFP感染HEK293 細胞后24h熒光圖）。
[0020] 圖8是重組腺病毒感染HEK293細胞后經(jīng)RT-PCR檢測目的基因的結(jié)果圖（M:DL 250bpDNAMarker; 1 :重組腺病毒Ad-LYZ感染后RT-PCR檢測hLYZ基因；2 :重組腺病 毒Ad-SAL感染后RT-PCR檢測SAL-2基因；3 :重組腺病毒Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR檢 測SAL-2基因；4 :重組腺病毒Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR檢測hLYZ基因；5 :重組腺病毒 Ad-SAL-LYZ感染后RT-PCR檢測SAL-LYZ基因）。
[0021] 圖9是Westernblotting檢測重組腺病毒感染HEK293細胞后各目的蛋白的表達 情況。
[0022] 圖10是BCA定量方法測定重組腺病毒感染HEK293細胞后蛋白提取物濃度所繪制 的標準曲線。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明：
[0024] 隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，基因治療現(xiàn)已成為疾病防治 研究的熱點。目前，腺病毒（adenovirus，Ad)載體療法是基因治療中最有前景的基因轉(zhuǎn)移 方法之一，它能有效的將外源基因傳遞到各種靶細胞或組織中，載體的構(gòu)建和操作簡單，宿 主范圍廣，感染性強，可經(jīng)不同途徑進入不同組織，還能感染分化后的非分裂期細胞。
[0025] 大量研究結(jié)果表明，內(nèi)溶素（virolysin)是噬菌體感染宿主菌后實現(xiàn)裂解功能的 主要成分，其通過在感染后期水解宿主菌細胞壁成分間的連接鍵而達到裂解細菌的目的， 對無細胞壁機構(gòu)的機體細胞無損傷作用。內(nèi)溶素對細菌存活所必須的細胞壁糖基有著較高 的親和力，在快速高效殺滅細菌的同時，細菌很難對內(nèi)溶素產(chǎn)生抗性，因此，內(nèi)溶素應(yīng)用于 細菌性疾病的防治擁有快速、高效、安全且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。SAL-2是由短尾病毒科 的金黃色葡萄球菌噬菌體SAP-2的第14個開放閱讀框編碼的內(nèi)溶素蛋白，研究表明其