利用pcr技術(shù)鑒定紅木中闊葉黃檀的方法、引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及木材材種鑒定的分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說涉及對闊葉黃檀的分子鑒定方法及其所使用的引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002]紅木是我國高端、名貴家具用材的統(tǒng)稱。國家根據(jù)密度等指標(biāo)對紅木進(jìn)行了規(guī)范，把紅木規(guī)范為:二科、五屬、八類、三十三種。
[0003]闊葉黃檀emargina ta屬于豆科蝶形花亞科，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的樹種，它主要用于制作高級家具和裝飾材料以及醫(yī)藥用途等。闊葉黃檀的主產(chǎn)地為:印度，印度尼西亞，爪哇島中、西部，屬《紅木》國標(biāo)五屬八類里的黑酸枝類，所以市場上也俗稱印尼黑酸枝。
[0004]近年來，由于紅木家具受到越來越多消費者的喜愛，促進(jìn)了紅木家具制造業(yè)的繁榮，因此紅木木材的進(jìn)口量也隨之逐年增加。但是，長期以來由于受利益驅(qū)使，紅木市場良莠不齊，摻假造假情況突出:一方面用較次的紅木冒充較好的紅木，另一方面用非紅木冒充紅木等。
[0005]傳統(tǒng)的紅木鑒定主要依賴于形態(tài)鑒定方法，它必須建立在所檢紅木有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，這就為紅木鑒定工作帶來了一定的局限性。同時，相近種屬紅木易出現(xiàn)材質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似，給紅木鑒定的準(zhǔn)確性帶來困難。近年來研究工作者開發(fā)了基于數(shù)字圖像處理的木材圖像識別技術(shù)，大大提高了木材識別的準(zhǔn)確性，推動了木材識別技術(shù)的發(fā)展。但是，基于計算機(jī)圖像檢索的識別技術(shù)依然沒有脫離對木材本身的形態(tài)結(jié)構(gòu)及特征的依懶性。
[0006]為紅木建立起以DNA的分子鑒定技術(shù)，一方面杜絕紅木制品的摻假造假行為，對于保護(hù)消費者權(quán)益，提高品牌價值，規(guī)范紅木市場具有重要的意義，另一方面，為檢驗檢疫、農(nóng)林、工商的快速篩查和鑒定提供技術(shù)方法，促進(jìn)物種資源的保護(hù)和利用，具有非常重要的社會意義。然而，目前對闊葉黃檀的鑒定依然采用傳統(tǒng)的木材鑒定手段，即解剖切片觀察木材的構(gòu)造以及形態(tài)特征從而得出判定結(jié)果。因此建立起分子鑒定方法，實現(xiàn)闊葉黃檀的簡單、快速、準(zhǔn)確、客觀的鑒定是目前急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種用于闊葉黃檀的PCR鑒定用的引物、探針，所述引物和探針序列包括:
KYHT Primer-F:5’-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3’
KYHT Primer-R:5’-GGTCGCGCGCATGACT-3’
KYHT Primer Probe:5’-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3’。
[0008]進(jìn)一步地，所述引物和探針的PCR反應(yīng)條件為:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40個循環(huán)。
[0009]進(jìn)一步地，所述引物和探針的使用濃度比為:KYHT Primer-FiKYHTPrimer-R:KYHT Primer Probe=1: 1:20
[0010]本發(fā)明還提供了一種闊葉黃檀的PCR鑒定方法，包括如下步驟:
(1)木材樣本的預(yù)處理；
(2)提取經(jīng)(I)處理后的木材樣本中的DNA;
(3)利用引物KYHT Primer-F 和 KYHT Primer-R，以及探針 KYHT Primer Probe 對(2)中提取的DNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；
(4)木材種類的確定；
所述引物和探針序列包括:
KYHT Primer-F:5’-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3’
KYHT Primer-R:5’-GGTCGCGCGCATGACT-3’
KYHT Primer Probe:5' -VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3’。
[0011]進(jìn)一步地，所述的熒光PCR擴(kuò)增條件為:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40個循環(huán)。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果:實時熒光定量PCR技術(shù)(real timequantitative PCR, RQ-PCR)具有較高的靈敏度和特異性，而且能對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時檢測。而MGB探針法，既保證了反應(yīng)的特異性，同時很好的控制了成本，該法綜合生物學(xué)、酶學(xué)和熒光化學(xué)于一體，從擴(kuò)增到結(jié)果分析均在PCR反應(yīng)管封閉狀態(tài)下進(jìn)行，解決了 PCR產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結(jié)果用拷貝數(shù)表示，實現(xiàn)了對PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，具有特異度好，靈敏度高，線性關(guān)系好，操作簡單，自動化程度高、防污染，有較大的線性范圍等優(yōu)點。
[0013]本發(fā)明在對闊葉黃檀大量基因信息進(jìn)行分析比較的基礎(chǔ)上設(shè)計闊葉黃檀種屬特異引物和探針，建立了闊葉黃檀特異性的熒光定量PCR鑒定檢測方法。本發(fā)明并不需要木材有完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，只需從木料上取極少量木材樣本，即可滿足檢測要求，操作簡單。并且通過木材特有的DNA信息做出判斷，鑒定過程客觀、準(zhǔn)確。克服了傳統(tǒng)鑒定方法主要依賴于形態(tài)鑒定方法，并必須建立在木材有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上的技術(shù)局限性。本發(fā)明很好地滿足各相關(guān)部門對闊葉黃檀快速篩查和鑒定的要求，能有效杜絕闊葉黃檀制品的摻假造假行為，對于保護(hù)消費者權(quán)益，提高品牌價值，規(guī)范市場，促進(jìn)物種資源的保護(hù)和利用具有重要的意義。
【附圖說明】
[0014]圖1是紅木中闊葉黃檀和15個對照組樹種DNA提取效果實驗。
[0015]圖2是本發(fā)明方法的特異性實驗結(jié)果。
[0016]圖3是本發(fā)明方法的靈敏度實驗結(jié)果。
[0017]圖4是取自針對經(jīng)不同處理方式得到的木材樣本的檢測結(jié)果。
[0018]圖5是取自木材不同部位樣本的檢測實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但并不因此將本發(fā)明限制在所述的具體實施例中。實施例中未說明的條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照商品說明書建議的步驟和條件。
[0020]實施例1檢測闊葉黃檀的引物、探針和檢測試劑盒
利用NCBI等資源信息，找出闊葉黃檀與其他木材的基因差異位點，篩選出一對特異性擴(kuò)增引物對(KYHT Primer-F和KYHT Primer-R),并在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域設(shè)定了一條特異性的探針(KYHT Primer Probe)。所述擴(kuò)增引物對和探針序列分別是:
KYHT Primer-F:5’-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3’
KYHT Primer-R:5’-GGTCGCGCGCATGACT-3’
KYHT Primer Probe:5' -VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3’。
一種檢測闊葉黃檀的試劑盒，所述試劑盒包括樣品DNA抽提試劑、qPCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
[0021]其中所述qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:20μ1的體系包括:
SYBR Prmix Taq II (2Χ )ΙΟμΙ
ROX Referance Dye II (50Χ ) 0.4μ1 KYHT Primer Probe0.4μ1
KYHT Primer-F (20μΜ)0.2μ1
KYHT Primer-R (20μΜ)0.2μ1
DNA樣品模板8.8μ1
其中所述引物和探針序列分別為:
KYHT Primer-F:5’-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3’
KYHT Primer-R:5’-GGTCGCGCGCATGACT-3’
KYHT Primer Probe:5' -VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3’。
[0022]陽性對照品:含有本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增片段的質(zhì)粒溶液。
[0023]陰性對照品:不含本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增片段的質(zhì)粒溶液。
[0024]空白對照品:2 μ I生理鹽水或不加任何物質(zhì)的ddH20。
[0025]實施例2:實時熒光PCR的鑒定方法
(I)木材樣本的預(yù)處理:
用75%的乙醇對木材表面進(jìn)行徹底的消毒，經(jīng)無菌水沖洗并用擦干木材。切除待測木材表面部分以避免其他職務(wù)組織的污染。取一定量的木材樣本，在預(yù)冷的研缽中加入液氮和石英砂研磨成粉末備用。當(dāng)不立即使用時，樣品DNA溶液在_20°C下保存待用。
[0026](2)木材樣本DNA提取:
采用植物基因組提取試劑盒(Plant Ge