苯噻菌酯免疫復(fù)合體特異性結(jié)合的多肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及具有與苯噻菌酯免疫復(fù)合體特異性結(jié)合的多肽， 包括所述多肽在檢測苯噻菌酯中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯噻菌酯（benzothiostrobin)是由華中師范大學(xué)研發(fā)的一種新型Strobilurins 類殺菌劑。苯噻菌酯具有殺菌譜廣，殺菌活性高，施用量低，持效期長等優(yōu)點(diǎn)，具有保護(hù)及治 療作用，對作物白粉病、霜霉病均表現(xiàn)出優(yōu)越的防效，具有良好的市場開發(fā)前景。為預(yù)防苯 噻菌酯應(yīng)用存在的潛在風(fēng)險，需要一種靈敏、快速、選擇性的殘留檢測方法。
[0003] 目前，對苯噻菌酯的殘留檢測包括儀器分析方法和免疫分析法。免疫檢測方法具 有快速、廉價、簡便、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，在大量樣品快速篩選和現(xiàn)場監(jiān)測中顯示出獨(dú)特優(yōu) 勢。免疫分析通常分為競爭模式和非競爭模式。由于農(nóng)藥等小分子化學(xué)品（包括苯噻菌 酯）為單抗原決定簇分析物，整個分子只能和一個抗體結(jié)合，通常選擇競爭模式來建立免 疫分析方法。非競爭分析模式一般需要抗原含有兩個或兩個以上不重疊抗原決定簇，但是 絕大多數(shù)農(nóng)藥與抗體結(jié)合之后都會被抗體的結(jié)合位點(diǎn)包裹起來，不能直接被第二種抗體所 識別，因此無法建立非競爭分析模式。但是，也有研究者們利用一些新穎的技術(shù)或手段建立 了小分子化合物的非競爭免疫分析，并且顯示非競爭性免疫分析具有更好的敏感性和特異 性。所采用的方法有制備抗免疫復(fù)合體抗體、開放夾心分析法（Open Sandwich Assay)和 篩選抗免疫復(fù)合體噬菌體展示多肽。
[0004] 自從噬菌體展示技術(shù)第一次報道至今，已經(jīng)作為一種強(qiáng)大的工具運(yùn)用在不同的研 究中，包括篩選抗體和酶的配體；篩選小分子的受體；抗體工程等。其原理是將多肽或蛋白 質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確 且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合 蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨(dú) 立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。利用免疫復(fù)合體（抗體抗原結(jié)合 物）對噬菌體展示隨機(jī)多肽庫進(jìn)行生物淘選，可篩選出能夠與免疫復(fù)合體特異性結(jié)合的噬 菌體展示多肽，可用于建立非競爭免疫分析方法。一些研究結(jié)果表明，非競爭檢測模式由于 形成了抗原、抗體和多肽的三元復(fù)合機(jī)構(gòu)，能夠顯著提高檢測方法的敏感性和特異性。雖然 非競爭分析模式具有優(yōu)勢，但是該技術(shù)還處于研發(fā)初期階段，在建立該分析方法中存在的 最大挑戰(zhàn)是抗免疫復(fù)合體多肽的篩選。目前為止，尚未見具有與苯噻菌酯免疫復(fù)合體特異 性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的研究和報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供與苯噻菌酯免疫復(fù)合體特異性結(jié)合的多肽，及相關(guān)多肽在苯 噻菌酯檢測中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0007] (1)將蛋白A柱純化的苯噻菌酯抗體包被在酶標(biāo)板上，用3% BSA封閉酶標(biāo)板，將 苯噻菌酯加入形成苯噻菌酯免疫復(fù)合體；隨后，將噬菌體展示隨機(jī)環(huán)八肽庫加入酶標(biāo)板中 進(jìn)行親和淘選，淘選過程按照"吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增"的循環(huán)進(jìn)行，一般經(jīng)過3輪的淘 選，每輪淘選降低包被抗體和苯噻菌酯的濃度；
[0008] (2) 3輪淘選后，挑選48個噬菌體克隆進(jìn)行ELISA初步鑒定，39個陽性克隆進(jìn)行擴(kuò) 增、質(zhì)粒提取、測序，共發(fā)現(xiàn)3種序列，其序列如SEQ ID NO 1~3所示序列：Cys Pro Asn lie Trp Pro Glu Ser Trp Cys,Cys Leu His Ser Lys His Thr Tyr Glu Cys,Cys Pro Asp lie Trp Pro Thr Ala Trp Cys ;所述多肽由10個氨基酸組成，包含一個環(huán)狀肽區(qū)域；該環(huán) 肽區(qū)域由多肽兩端的半胱氨酸殘基形成的二硫鍵而被環(huán)化。
[0009] 本發(fā)明所述的多肽可與苯噻菌酯免疫復(fù)合體組合，建立非競爭ELISA，用于苯噻菌 酯在環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品中的殘留檢測。
[0010] 本發(fā)明具有以下有益效果：（1)新穎：與苯噻菌酯免疫復(fù)合體特異性結(jié)合的多肽 為國內(nèi)外首次報道；（2)實(shí)用：利用本發(fā)明提供的噬菌體展示多肽可以快速建立高敏感性 的非競爭ELISA;(3)特異性強(qiáng)：利用本發(fā)明提供的噬菌體展示多肽實(shí)現(xiàn)的非競爭ELISA 與苯噻菌酯類似物的交叉反應(yīng)均小于0.03% ;(4)準(zhǔn)確度高：利用本發(fā)明提供的噬菌體 展示多肽實(shí)現(xiàn)的非競爭ELISA在農(nóng)產(chǎn)品中的添加回收率為70. 4-125.0%，變異系數(shù)低于 11. 5%，符合殘留分析標(biāo)準(zhǔn)；（5)靈敏度高：利用本發(fā)明提供的噬菌體展示多肽實(shí)現(xiàn)的非競 爭ELISA的飽和信號中濃度（SC 5。）為2. 27ng/mL，檢測限（SC1Q，L0D)為1. llng/mL。
【附圖說明】
[0011] 圖1是挑選的48個噬菌體克隆P-ELISA檢測的結(jié)果；橫坐標(biāo)為噬菌體克隆，縱坐 標(biāo)為〇D 45。值；
[0012] 圖2是非競爭P-ELISA檢測苯噻菌酯，0D值與苯噻菌酯濃度的曲線；橫坐標(biāo)為苯 噻菌酯的濃度，單位為ng/mL;縱坐標(biāo)為0D45。值。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑及配方如下：
[0014] 主要實(shí)驗(yàn)材料：
[0015] 蛋白A柱純化苯噻菌酯單克隆抗體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)藥殘留與 環(huán)境毒理實(shí)驗(yàn)室制備；噬菌體展示隨機(jī)環(huán)八肽庫由美國加州大學(xué)-戴維斯分校，Hammock實(shí) 驗(yàn)室提供。
[0016] 主要試劑：
[0017]蛋白胨（0X0ID)、酵母提取物（0X0ID)、瓊脂（Amresco)、瓊脂糖（Amresco)、四甲基 聯(lián)苯胺（Sigma)、IPTG (Amresco)、Xgal (Amresco)、PEG8000 (Sigma)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的 抗Ml3單克隆抗體（GE)
[0018] 主要試劑配方：
[0019] 1、LB培養(yǎng)基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl。高壓滅菌，室溫貯存；
[0020] 2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培養(yǎng)基+15g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低于70°C時， 加入lmL IPTG/Xgal，混勻倒平板。平板4°C避光貯存；
[0021] 3、頂層瓊脂：每升含lOg蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g瓊脂粉，高壓滅菌，固 體培養(yǎng)基室溫貯存，用時微波爐融化；
[0022] 4、四環(huán)素貯液：以20mg/mL的濃度溶于50%乙醇中，-20°C避光貯存，用前搖勻；
[0023] 5、LB-Tet平板：LB培養(yǎng)基+15g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低于70°C時，加入 lmL四環(huán)素貯液，混勻倒平板，平板4°C避光貯存；
[0024] 6、封閉液：含有 3% BSA，0. 15M，pH 7. 4PBS，過濾除菌，4°C保存；
[0025]7、PEG/NaCl : 20 % (w/v) PEG-8000，2. 5M NaCl，高壓滅菌，室溫貯存；
[0026] 8、IPTG/Xgal 配方：將 1. 25g IPTG (isopropyl 0-D-thiogalactoside)和 lg Xgal 溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20°C避光貯存；
[0027] 9、顯色液（四甲基聯(lián)苯胺-H202底物溶液）：25mL 0? 1M，pH 5. 5檸檬酸鹽緩沖液 中加入0. 4mL，6mg/mL四甲基聯(lián)苯胺，0. lmL 1 % H202。
[0028] 實(shí)施例1苯噻菌酯免疫復(fù)合體特異性結(jié)合多肽的淘選和制備
[0029] 1、與苯噻菌酯免疫復(fù)合體特異性結(jié)合的噬菌體克隆的淘選
[0030] 按照"吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增"的循環(huán)進(jìn)行，經(jīng)過3輪的淘選，具體操作如下：
[0031] (1)取100 y L 10 y g/mL蛋白A柱純化的苯噻菌酯抗體加入酶標(biāo)板中，4°C包被過 夜，共三個孔；
[0032] (2)取少量大腸桿菌ER2738涂在LB+Tet平板上，37°C過夜培養(yǎng)；
[0033] (3)將步驟（1)的酶標(biāo)板用PBST洗滌5遍，加入300 y L 3 % BSA，37°C孵育1小 時，用PBST洗滌5遍，存放于4°C備用；
[0034] (4)取10 y g/mL的苯噻菌酯加入步驟⑶的酶標(biāo)板中，室溫輕微震蕩1小時，用 PBST洗滌5遍；
[0035] (5)將酶標(biāo)板每孔加入2 X 1011的噬菌體（100 y L)，室溫輕微震蕩1小時；
[0036] (6)取20mL LB培養(yǎng)基加入250mL三角瓶中，加入ER2738單菌落，37°C培養(yǎng)至(me。。 為 0.01 至 0.05 ;
[0037] (7)將步驟（5)的微孔用PBST洗滌10遍，加入100 y L 0. 2M，pH 2. 2甘氨酸鹽酸 緩沖液，室溫輕微震蕩15分鐘；
[0038] (8)收集步驟（7)中的洗脫緩沖液，并用1M，pH 9. 1的Tris-HCl中和，4°C保存；
[0039] (9)取少量中性洗脫液測定噬菌體的滴度（操作方法見滴度測定）；
[0040] (10)剩余的洗脫緩沖液用于擴(kuò)增，將剩余的洗脫緩沖液加入步驟（6)中的三角瓶 中，37°C搖床培養(yǎng)4至4. 5小時；
[0041] (11)將擴(kuò)增的噬菌體移入50mL的離心管中，4°C 12000g離心10分鐘，取上清。重 復(fù)離心一次；
[0042] (12)取上層80%的上清放入離心管中，加入上清1/6體積的20% PEG-8000/2. 5M NaCl，混勻，4°C靜置過夜；
[0043] (13)將（12)步驟的混合液4°C 12000g離心15分鐘，去上清，重復(fù)一次；
[0044] (14)取400 y L PBS溶解步驟（13)的沉淀物用于下一輪的淘選，也可放于4°C短 期（大約三周不會影響滴度）保存，或者加入甘油，放于-20°C長期保存；
[0045] (15)步驟（1)到（14)為一輪淘選和擴(kuò)增，第二輪和第三輪的淘選和擴(kuò)增步驟同 上；第二輪，步驟（1)中使用的苯噻菌酯抗體濃度和步驟（4)中苯噻菌酯濃度分別為5 yg/ mL和1 y