鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗菌肽的提取方法，具體涉及鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽具有廣譜、高效的抗微生物活性，還能促進動物生長，誘導動物的獲得性免疫。而且其獨特的抗菌機理不會使微生物產(chǎn)生耐藥性，在機體內(nèi)無殘留，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景，抗菌肽的應(yīng)用可能會帶來一場抗微生物戰(zhàn)略的新革命。
[0003]鴕鳥適應(yīng)環(huán)境能力強，能在45 °(:的高溫和_35°C的低溫環(huán)境下生長、繁殖。其抗病力極強，除3月齡以下的幼鳥會因營養(yǎng)不良造成死亡外，其它極少病亡，至目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)傳染病造成鴕鳥大批死亡的報告。其傷口愈合能力、抗病力明顯強于其它動物。
[0004]有關(guān)研究確認，在鴕鳥異嗜白細胞中存在較強的抗菌肽，其對金黃色葡萄球菌、雞大腸桿菌和白色念珠菌具有較強的抑制作用；抗菌肽具有陽離子性質(zhì)；熱穩(wěn)定性良好，最小抑菌濃度極低。因此開發(fā)研究從鴕鳥異嗜白細胞中提取、純化抗菌肽的成熟方法，可以一舉多得。而目前在國內(nèi)外還未見有從鴕鳥異嗜白細胞提取抗菌肽的技術(shù)方法和產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于，提供鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的制備方法，解決目前國內(nèi)沒有從鴕鳥異嗜白細胞中提取抗菌肽的技術(shù)方法和產(chǎn)品的問題。
[0006]本發(fā)明提供的鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟:
(1)鴕鳥白細胞的采集:采集新鮮鴕鳥血液，加入10%的檸檬酸鈉抗凝，經(jīng)6層紗布過濾除去血塊和雜質(zhì)，用0.83%氯化銨裂解紅細胞，玻璃棒緩慢攪拌30 min后，2 000 r/min離心15 min，棄上清，收集白細胞；重復以上操作5?6次，至上清無色為止，然后對收集物染色鏡檢，以保證其中不含紅細胞；
(2)萃取:將白細胞中加入10%的醋酸，用料理機進行攪打破碎，60Hz超聲波破碎細胞4X60 s后染色鏡檢白細胞是否破碎，若未破碎，重復進行破碎，至鏡檢無完整細胞；4°C、15000 r/min離心20min，收集上清液即為異嗜性粒細胞胞楽內(nèi)的顆粒組份；4°C下攪拌過夜，萃取得醋酸提取物；
(3)脫酸:將以上方法萃取得到的醋酸提取物，經(jīng)4°C、15000r/min離心20mi，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去醋酸和部分水分后，真空冷凍干燥得鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽粗品，密封包裝后在-20°C保存；
(4)抗菌肽的純化:將凍干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱，同時打開柱的下端出口，收集特征峰洗脫液再真空冷凍干燥得抗菌肽，_20°C保存。
[0007]如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30mino
[0008]如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)所述的層析柱是葡聚糖凝膠SephadexG250
[0009]如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)所述的特征峰洗脫液是指在280nm處有吸收峰的洗脫液。
[0010]如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)、(4)所述的真空冷凍干燥得溫度為-50?_60°C，冷凍干燥的時間為24h-48h。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明提供的鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的提取方法，進行詳細的說明。
實施例
[0012]參照本實施例的鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟:
1)鴕鳥白細胞的采集:采集新鮮鴕鳥血液，加入10%的檸檬酸鈉抗凝，經(jīng)6層紗布過濾除去血塊和雜質(zhì)，用0.83%氯化銨裂解紅細胞，玻璃棒緩慢攪拌30 min后，2 000 r/min離心15 min，棄上清，收集白細胞。重復以上操作5?6次，至上清無色為止，然后對收集物染色鏡檢，以保證其中不含紅細胞；
2)萃取:將白細胞中加入10%的醋酸，用料理機進行攪打破碎，60Hz超聲波破碎細胞4X60 s后染色鏡檢白細胞是否破碎，若未破碎，重復進行破碎，至鏡檢無完整細胞。4°C、15000 r/min離心20min，收集上清液即為異嗜性粒細胞胞漿內(nèi)的顆粒組份。4°C下攪拌過夜，萃取得醋酸提取物；
3)脫酸:將以上方法萃取得到的醋酸提取物，經(jīng)4°C下15000r/ min離心20min，收集上清液，并于55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min除去醋酸和部分水分后，-60°C真空冷凍干燥得抗菌肽粗品，密封包裝后在一 20°C保存。
[0013]4)抗菌肽的純化:將凍干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱葡聚糖凝膠S印hadexG25，同時打開柱的下端出口，用部分收集器收集洗脫液，將在280nm處有吸收的溶液收集，再真空冷凍干燥得抗菌肽，_20°C保存。
【主權(quán)項】
1.鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的制備方法，其特征在于:它包括以下具體步驟: (1)鴕鳥白細胞的采集:采集新鮮鴕鳥血液，加入10%的檸檬酸鈉抗凝，經(jīng)6層紗布過濾除去血塊和雜質(zhì)，用0.83%氯化銨裂解紅細胞，玻璃棒緩慢攪拌30 min后，2 000 r/min離心15 min，棄上清，收集白細胞；重復以上操作5?6次，至上清無色為止，然后對收集物染色鏡檢，以保證其中不含紅細胞； (2)萃取:將白細胞中加入10%的醋酸，用料理機進行攪打破碎，60Hz超聲波破碎細胞4X60 s后染色鏡檢白細胞是否破碎，若未破碎，重復進行破碎，至鏡檢無完整細胞；4°C、15000 r/min離心20min，收集上清液即為異嗜性粒細胞胞楽內(nèi)的顆粒組份；4°C下攪拌過夜，萃取得醋酸提取物； (3)脫酸:將以上方法萃取得到的醋酸提取物，經(jīng)4°C、15000r/min離心20mi，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去醋酸和部分水分后，真空冷凍干燥得鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽粗品，密封包裝后在-20°C保存； (4)抗菌肽的純化:將凍干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱，同時打開柱的下端出口，收集特征峰洗脫液再真空冷凍干燥得抗菌肽，_20°C保存。2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30mino3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)所述的層析柱是葡聚糖凝膠SephadexG2504.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)所述的特征峰洗脫液是指在280nm處有吸收峰的洗脫液。5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)、(4)所述的真空冷凍干燥得溫度為-50?_60°C，冷凍干燥的時間為24h-48h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了鴕鳥異嗜白細胞抗菌肽的制備方法，它包括以下具體步驟：（1）鴕鳥異嗜白細胞的采集；（3）萃?。?）脫酸；（4）抗菌肽的純化。本發(fā)明方法實現(xiàn)了從鴕鳥異嗜白細胞提取具有較強抗菌活性的多肽物質(zhì)，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個新的途徑和方法。
【IPC分類】C07K1/16, C07K1/14
【公開號】CN105153272
【申請?zhí)枴緾N201510676168
【發(fā)明人】紀經(jīng)國, 鄧小玲, 寧成勇
【申請人】重慶都好生物科技有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年10月19日