一種全人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體及其衍生物制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及中和破傷風(fēng)毒素的基因重組全人源單克 隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 破傷風(fēng)（Tetanus)是由破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌（Clostridium tetani)感染所引起 的，是一種常見的且死亡率很高的人畜共患的嚴(yán)重疾病。破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌廣泛地存在 于土壤，灰塵和鐵銹等處，在多種動物的消化道和糞便中也都有發(fā)現(xiàn)，人群中的攜帶率最高 可達25%。破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌很容易通過創(chuàng)傷感染人體，例如一般性外傷、婦女生產(chǎn)時的 創(chuàng)傷等。當(dāng)人被破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌感染之后，在七天左右的潛伏期內(nèi)，破傷風(fēng)梭狀芽孢桿 菌在厭氧條件下于創(chuàng)口處大量生長繁殖并釋放毒素。破傷風(fēng)毒素通過破壞人體神經(jīng)細胞而 侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患者全身性肌肉強直性痙攣，形成破傷風(fēng)特有的牙關(guān)禁閉、角弓反 張等癥狀，嚴(yán)重者最后會死于室息及全身性衰竭，死亡率在40% -78%之間。產(chǎn)婦分娩感染 時，其病死率可高達90%以上。
[0003] 破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌為嚴(yán)格厭氧菌，其芽孢可抗高溫抗干燥，對大多數(shù)防腐劑有 抗性，但對碘的水溶液及中性戊二醛溶液很敏感，可在短時間內(nèi)被這些試劑殺滅。破傷風(fēng)梭 狀芽孢桿菌可以產(chǎn)生兩種外毒素：一種是具有溶血作用的破傷風(fēng)溶血毒素；另一種是破傷 風(fēng)痙攣毒素，即常說的破傷風(fēng)毒素。
[0004] 破傷風(fēng)毒素是由破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生并分泌至菌體外的一種蛋白質(zhì)，由1315 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為150kDa。破傷風(fēng)毒素在菌體內(nèi)表達后是單一的一條蛋白質(zhì) 鏈，在分泌過程中被蛋白酶裂解成由二硫鍵鏈接的輕鏈和重鏈。依據(jù)功能的不同，破傷風(fēng)毒 素分子分為A、B、C三個部分：破傷風(fēng)毒素的輕鏈片段為A片段，重鏈N端的一半為B片段， 另一半為C片段。破傷風(fēng)毒素的毒性過程一般分為結(jié)合、導(dǎo)入和作用三步。研究結(jié)果表明， 破傷風(fēng)毒素的C片段可以和破傷風(fēng)毒素的受體結(jié)合。破傷風(fēng)毒素的受體一般認為是神經(jīng)節(jié) 苷脂，破傷風(fēng)毒素的C片段具有逆行軸突運輸進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，已被用于研究亞 單位疫苗；B片段可以在人工磷脂膜上形成離子通道，將破傷風(fēng)毒素的活性片段導(dǎo)入到細 胞內(nèi)；破傷風(fēng)毒素的A片段分子是Zn蛋白酶，具有蛋白酶活性，它可以裂解神經(jīng)細胞膜上 的傳送神經(jīng)遞質(zhì)的蛋白質(zhì)-囊泡相關(guān)膜蛋白，從而抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使興奮的沖動不 停傳遞，導(dǎo)致患者產(chǎn)生強直性痙攣的臨床癥狀。
[0005] 破傷風(fēng)毒素是已知最毒的毒素之一，經(jīng)純化的破傷風(fēng)毒素對小鼠的致死劑量為 0. 1 ng/kg，對豚鼠的致死劑量為0. 3ng/kg，推測對人的致死劑量為0. 25ng/kg。破傷風(fēng)類 毒素疫苗作為主動免疫療法被應(yīng)用于破傷風(fēng)的預(yù)防。破傷風(fēng)類毒素是用破傷風(fēng)梭狀芽孢桿 菌菌種在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素，經(jīng)甲醛脫毒、精制并加入氫氧化鋁佐劑后可以 制成疫苗。雖然注射破傷風(fēng)疫苗可以完全預(yù)防破傷風(fēng)的臨床癥狀，但由于沒有接種疫苗或 免疫效應(yīng)過期從而導(dǎo)致破傷風(fēng)桿菌感染的情況依然非常普遍。
[0006]破傷風(fēng)毒素毒性極強，作用迅速。當(dāng)病人被確診為感染破傷風(fēng)桿菌后，由于此時體 內(nèi)已有大量細菌和毒素，使用抗菌素已來不及拯救病人生命。因此預(yù)防和治療方法破傷風(fēng) 的唯一有效的方法是及時注射抗破傷風(fēng)毒素的抗體，與毒素進行中和反應(yīng)而使毒素失活， 并通過抗體受體的介導(dǎo)將毒素從體內(nèi)清除。
[0007]抗破傷風(fēng)毒素的抗體主要分為破傷風(fēng)抗毒素（Tetanus antitoxin, TAT)和破傷風(fēng) 人血免疫球蛋白（Human tetanus immunoglobulin, HTIG)。目前，我國用于臨床的抗破傷風(fēng) 毒素的抗體絕大部分為動物抗血清（主要為馬的抗破傷風(fēng)毒素抗血清）。馬的免疫血清，雖 然經(jīng)過了剪切純化精制，仍然保留很強的異源性，常導(dǎo)致過敏反應(yīng)的發(fā)生，即使在皮試陰性 者注射時也會發(fā)生過敏反應(yīng)。大量臨床資料顯示反應(yīng)率為5% -30%，其中0. 001 %的過敏 反應(yīng)嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。有關(guān)技術(shù)人員統(tǒng)計了某醫(yī)院自2000年1月至2002年8月120例 TAT使用者的過敏皮試情況，結(jié)果皮試陽性率為45%。
[0008]據(jù)對北京地區(qū)幾家醫(yī)院的TAT應(yīng)用情況的調(diào)查表明，一般每家醫(yī)院每天平均大約 有十幾至幾十人接受TAT的預(yù)防注射，幾乎所有醫(yī)院均不采用破傷風(fēng)毒素的主動免疫預(yù) 防，而且不管患者是否經(jīng)過破傷風(fēng)毒素的主動免疫，均一律給予TAT注射。其注射范圍也很 廣，幾乎所有外傷，甚至有些新鮮清潔傷口均一律注射TAT。對同一患者的反復(fù)應(yīng)用也較普 遍，由此增加了過敏反應(yīng)的發(fā)生率。
[0009] 從藥理學(xué)角度講，預(yù)防注射1500-3000IU的TAT，2-3天內(nèi)血清抗體能保持在 0. 3-0. 6IU/ml的水平。但由于TAT是異種蛋白，在體內(nèi)的半衰期短（2-14天），很快就被機 體排斥掉，十幾天后其抗體水平幾乎測不到，因而不利于預(yù)防作用。歐美發(fā)達國家已停止使 用馬血清TAT，而采用HTIG。
[0010] 據(jù)報道，在停止使用TAT前每年接受TAT注射的人數(shù)超過300萬，其中因過敏休克 病死率為1/5萬一 1/20萬，與受傷后不用TAT預(yù)防而患破傷風(fēng)的死亡率幾無差別。據(jù)我國 有關(guān)學(xué)者對幾十家醫(yī)院的調(diào)查來看，死于過敏的人數(shù)也與患破傷風(fēng)死亡人數(shù)相近。尤其是 若有大量人群已使用過破傷風(fēng)抗毒素，再次使用的可能性較大，因此產(chǎn)生血清過敏的風(fēng)險 更大。
[0011] 破傷風(fēng)人血免疫球蛋白（HITG)是從經(jīng)破傷風(fēng)疫苗或類毒素免疫、抗體滴度較高 的健康獻血者血清中分離制備出來的，具有較好的防治效果。它屬于人源性同種蛋白，較為 安全，幾乎不會發(fā)生血清病與過敏反應(yīng)（過敏反應(yīng)率很低，僅為0.2%)。而且，該免疫球蛋 白半衰期長，可達3 - 4周，大大提升了破傷風(fēng)的防治水平。在操作性方面，由于使用TAT 常發(fā)生過敏反應(yīng)，所以使用前必須先做過敏試驗，過敏反應(yīng)陽性者，須采取脫敏注射法。注 射期間需嚴(yán)密觀察，這對醫(yī)患雙方都很不方便。而HTIG則無需皮試，使用方便。
[0012] 但由于人血來源困難，供應(yīng)鏈存在較大風(fēng)險，且工業(yè)化生產(chǎn)復(fù)雜、易受病毒污染等 因素，使HITG的應(yīng)用受到了極大地限制。相對于臨床需要的上升趨勢，破傷風(fēng)人血免疫球 蛋白供不應(yīng)求（僅滿足不到1%的市場需求），價格也比普通免疫球蛋白高數(shù)倍。僅2012 年1-4月份，至少有574282瓶破傷風(fēng)免疫球蛋白通過中檢所及北京、四川等?。ㄊ校┘壦?品檢驗機構(gòu)的審核批準(zhǔn)上市，但正規(guī)醫(yī)院仍然集體缺貨。因此，目前主要還是由馬血清破傷 風(fēng)抗毒素這種亟待淘汰的產(chǎn)品占領(lǐng)著市場。
[0013] 近年來有一些關(guān)于發(fā)明和制備人-鼠嵌合或人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆專利和文 獻。這些抗體雖能與破傷風(fēng)毒素結(jié)合，但中和毒素的效價不高，且抗體的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)問題尚 未解決。
[0014] 在申請?zhí)枮?01110106518. X國專利申請中瞿愛東等公開了兩種人-鼠嵌合抗體 9B5和8C10。這些嵌合抗體是在小鼠的IgG2a抗體的基礎(chǔ)上，用人的IgGl恒定區(qū)替換小鼠 的抗體恒定區(qū)而獲得的?？墒?，人-鼠嵌合抗體在應(yīng)用于人體時會在兩周左右的時間內(nèi)誘 發(fā)人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗小鼠抗體的抗抗體，因此其安全性和長期的有效性是非常值得懷疑 的。而且，根據(jù)該專利申請的記載這兩種抗體的效價都不高。9B5經(jīng)2. 5倍稀釋后（最高有 效稀釋倍數(shù)）治療的小鼠其死亡時間處于96~120h，和對照組小鼠的死亡時間基本相同， 因此9B5的效價為1. 25IU/ml (抗體濃度為10mg/ml，即0. 125IU/mg)。同樣，8C10經(jīng)5倍稀 釋后（最高有效稀釋倍數(shù)）治療的小鼠其死亡時間處于96~120h，和對照組小鼠的死亡時 間基本相同，因此8C10的效價為2. 5IU/ml (抗體濃度為10mg/ml，即0. 25IU/mg)。
[0015] 申請?zhí)枮?01010512416.3的中國專利申請中公開了另外兩種人-鼠嵌合抗體 6D12 和 8D9,效價分別為 1. OIU/mg 和〈0? 25IU/mg。
[0016] 申請?zhí)枮?00610144981. 2的中國專利申請中公開了從人的外周血B細胞中克隆 到人源抗破傷風(fēng)抗體，由此得到的抗體粗制品的效價約31IU/mg。研究者稱"本試驗使用的 抗體是利用含有牛血清培養(yǎng)液生產(chǎn)的，蛋白質(zhì)粗制備物中含有大量的非特異免疫球蛋白。 所以本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體真實的中和效價應(yīng)是31IU/mg的至少若干倍，效價相 當(dāng)高。"在該報道中，研究者給小鼠注射〇. 4mg/kg的抗體，能完全保護小鼠。按每只小鼠20g 計算，8yg抗體能完全保護小鼠。在本發(fā)明的實驗中，500ng即0. 5yg抗體能完全保護小 鼠不死。按標(biāo)準(zhǔn)抗毒素與標(biāo)準(zhǔn)毒素混合后注射的小鼠于72~120h內(nèi)全部死亡為標(biāo)準(zhǔn)，定 義抗毒素效價為〇. 5IU/ml x 0. 4ml (注射的抗體體積）即0. 2IU。
[0017] 申請?zhí)枮?00410070711. 2的中國專利申請中公開了采用噬菌體展示技術(shù)獲得人 源抗破傷風(fēng)抗體HTAT-Fab。但是，該Fab抗體是在大腸桿菌中表達，活性和產(chǎn)量都很成問 題。該工作沒有顯示任何毒素中和活性和小鼠存活的數(shù)據(jù)（所有4個圖和表格都只是與 分子克隆和蛋白鑒定有關(guān)），而且在僅僅是文字描述的動物實驗部分，研究者先給小鼠注射 HTAT-Fab抗體，然后再注射破傷風(fēng)毒素以顯示中和作用。但是這種"具有很強的中和破傷 風(fēng)外毒素"的HTAT-Fab，經(jīng)十多年至今未見市場化。
[0018]因此，利用先進的技術(shù)，尋找更加高效的、安全的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體在本 領(lǐng)域中具有非常重要的意義。采用基因工程方法制備完全人源的破傷風(fēng)毒素中和抗體，不 僅可解決異種蛋白的過敏問題，而且用國際產(chǎn)業(yè)界通用的中國倉鼠卵巢細胞（CHO)來大量 生產(chǎn)，可大大降低成本并避免血源制品的病毒污染問題。目前國際和國內(nèi)抗破傷風(fēng)基因工 程抗體的研究僅限于實驗室階段，尚未見到臨床應(yīng)用的報告。據(jù)不完全統(tǒng)計，國內(nèi)需要TAT 和HTIG累計達1000萬人份/年以上，國際需要為1. 2億人份/年以上，市場空間廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 針對全人源破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的需要，本發(fā)明的主要目的在于提供一種高 效、安全的抗破傷風(fēng)毒素的完全人源單克隆抗體的可變區(qū)序列及三種不同形式的重組抗 體：即含有全長的重鏈（H)和輕鏈（L)的單克隆抗體；L-P2A-H型單克隆抗體和ScFv單鏈 抗體。
[0020] -種全人源抗破傷風(fēng)病毒單克隆抗體，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序 列為SEQ ID N0:3所示，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:4所示。
[0021] 在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的重鏈的氨基酸 序列為SEQ ID N0:1所示；所述單克隆抗體的輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID N0:2所示；優(yōu)選 地，編碼所述單克隆抗體的重鏈的DNA序列為SEQ ID N0:5所示，編碼所述單克隆抗體的輕 鏈的DNA序列為SEQ ID N0:6所示。
[0022] 在根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案中，所述單克隆抗體的重鏈和輕鏈通過自 剪切序列連接，所述自剪切序列選自2A肽段。自剪切序列2A肽段源于口蹄疫病毒 (foot-and-mouth disease viruses, FMDV)。所述 2A 肽段或 2A 類似肽段均由 18 ~22 個氨基酸組成，C末端序列高度保守：一 DxE xNPGP -。在核糖體翻譯至該序列時，因 發(fā)生"跳躍"而實現(xiàn)無需蛋白酶的自動斷裂（自剪切）。自剪切發(fā)生在C末端G - PS 基之間。（參閱"基于2A肽策略構(gòu)建多基因表達載體的研究進展"，China Biotechnolo gy, 20