一種藻體中腐殖酸大孔徑樹脂分級方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及腐殖酸分離提取技術，具體涉及一種藻體中腐殖酸大孔徑樹脂分級方法。
【背景技術】
[0002]腐殖酸又名胡敏酸(humic acid)是由動植物及其殘體經過復雜的物理、化學、生物過程形成的大分子有機混合物，它廣泛存在于土壤、水體、沉積物等環(huán)境介質中。腐殖酸能溶于堿性和中性溶液，不溶于酸。腐殖酸中含有大量活性官能團如羧基、酚羥基、羰基、氨基和巰基，從而具有很高的反應活性。例如在天然環(huán)境中，腐殖酸能與環(huán)境中的有毒重金屬離子和有機污染物(如重金屬、農藥、PPCPs、PAHs等)發(fā)生相互作用，形成化學和生物穩(wěn)定性的溶于水和不溶于水的物質，從而改變其迀移、轉化規(guī)律和生物有效性。
[0003]—般認為，腐殖酸來自于動植物殘體的降解，但研究表明海洋藻體中含有大量腐殖酸。水生生物中，特別是藻體中腐殖酸的提取對研究水體中腐殖酸來源和歸趨具有重要意義。現(xiàn)代儀器分析技術的發(fā)展，為腐殖酸的研究提供了先進的手段，取得大量突破性創(chuàng)新。人們已經熟知腐殖酸的含碳量、紅外特征、紫外特征等基本理化性質。但是由于腐殖酸的組成和結構極其復雜，它的元素組成、分子量、芳香度及官能團含量等結構隨著時空不同而發(fā)生變化。為了更近一步的研究腐殖酸的結構和組成，前人將腐殖酸進行分級分離，從而減小其異質性，取得一些列成果。但針對于藻體腐殖酸的分級分離尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種藻體中腐殖酸大孔徑樹脂分級方法，該方法能夠克服現(xiàn)有技術對褐藻生物體腐殖酸分離及腐殖酸分級提取過程的不足，獲得純度較高的腐殖酸各級亞組分。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開的技術方案為:一種藻體中腐殖酸大孔徑樹脂分級方法，所述分級提取方法包括如下步驟:
步驟a、藻體預處理:
取風干后的藻體，剔除雜物，在3050°C下烘干，碾磨后過篩，得到藻體粉末；
步驟b、藻體索氏提取:
將藻體粉末置于索式提取器中，依次用乙醚、丙酮、95%乙醇、二氧雜環(huán)己烷作為提取液進行索提；索提過程中，當采用其中一種索提液索提時，則每隔5h，在220nm波長的紫外可見光下測定索提液的吸光度，當測得的索提液的吸光度大于或等于0.01時，則繼續(xù)該索提過程；當測得的吸光度小于0.01時，更換下一個索提液進行索提；
步驟C、藻體的氯化鈣處理:
向去離子水索提藻體中加入氯化鈣溶液，使固液比達到1:10，在40-70°C條件下連續(xù)攪拌10-40 min后，離心棄去上層清液，得到氯化媽處理藻體I ;
向氯化鈣處理藻體I中加入氯化鈣溶液，使固液比達到1:10，在40-70°C條件下連續(xù)攪拌10-40 min后，離心棄去上層清液，得到氯化鈣處理藻體2 ;
向氯化鈣處理藻體2中加入去離子水，使固液比達到1:10，連續(xù)攪拌10-60 min后，離心棄去上層清液，得到去離子水處理藻體；
向去離子水處理藻體中加入鹽酸，使固液比達到1:10，連續(xù)攪拌10 -60 min后，離心棄去上層清液，得到鹽酸處理藻體I ;
向鹽酸處理藻體I中加入鹽酸，使固液比達到1: 10，連續(xù)攪拌10-60 min后，離心棄去上層清液，得到鹽酸處理藻體2 ;
向鹽酸處理藻體2中加入鹽酸，使固液比達到1: 10，連續(xù)攪拌10 -60 min后，離心棄去上層清液，得到鹽酸處理藻體3 ;
向鹽酸處理藻體3中加入去離子水，使固液比達到1:10，連續(xù)攪拌10 min后，離心棄去上層清液，得到水洗鹽酸處理藻體；
步驟d、藻體的碳酸鈉處理:
向水洗鹽酸處理藻體中加入碳酸鈉溶液，使固液比達到1:10，在40-70°C條件下連續(xù)攪拌30-60 min后，離心所得固體標記為碳酸鈉處理藻體I ;
向碳酸鈉處理藻體I中加入碳酸鈉溶液，使固液比達到1:10，在40-70°C條件下連續(xù)攪拌30-60 min后，離心所得固體標記為碳酸鈉處理藻體2 ;
向碳酸鈉處理藻體2中加入去離子水，使固液比達到1:10，連續(xù)攪拌10 -60 min后，離心所得固體標記為水洗碳酸鈉處理藻體；
步驟e、藻體的堿液提取:
氮氣保護條件下，向水洗碳酸鈉處理藻體中加入氫氧化鈉和焦磷酸鈉，并用去離子水稀釋，使溶液中氫氧化鈉和焦磷酸鈉的濃度均為0.1 mol/L，且溶液中固液比為1:10，攪拌溶液4-6 h，靜置20-28 h后，離心得到上層清液I和藻體殘渣I ;
氮氣保護條件下，向上層清液I中加入6mol/L鹽酸，使溶液pH =1.0，攪拌30-60 min,靜置20-28h后，離心得固體標記為腐殖酸I ;
氮氣保護條件下，向藻體殘渣I中加入氫氧化鈉和焦磷酸鈉，并用去離子水稀釋，使溶液中氫氧化鈉和焦磷酸鈉的濃度均為0.1 mol/L，且溶液中固液比為1:10，攪拌4-6 h，靜置20-28 h后，離心得到上層清液2和藻體殘渣2 ;
氮氣保護條件下，向上層清液2中加入6mol/L鹽酸，使其pH =1.0，攪拌30-60 min，靜置20-28 h后，離心得固體標記為腐殖酸2 ;
將腐殖酸I和腐殖酸2合并，標記為粗提腐殖酸；
步驟f、藻體腐殖酸除硅:
氮氣保護條件下，用含有0.lmol/L氫氧化鈉和0.3 mol/L氯化鈉的溶液將步驟e中的粗提腐殖酸溶解，使其濃度為1-2 g/L，攪拌30 -60 min，高速離心分離，得到上層清液3;
將上層清液3用6 mol/L鹽酸酸化至pH=l.0，再加入濃氫氟酸，使氫氟酸濃度為0.3mol/L,持續(xù)攪拌4-6 h，靜置20-28h后，高速離心分離得固體標記為無硅腐殖酸；
步驟g、藻體腐殖酸除富里酸:
向步驟f中的無娃腐殖酸中加入0.lmol/L鹽酸溶液，使其固液比為1:10，持續(xù)攪拌4_6h，并靜置20-28h后，離心得到上層清液4及純化腐殖酸；
步驟h、藻體腐殖酸的亞組分分級: 在氮氣保護條件下，用氫氧化鈉將步驟g中的純化腐殖酸溶解，加入去離子水使溶液中的腐殖酸濃度在1-2 g/L,用鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)溶液pH=2后，以15倍柱體積/h的速度流過XAD-8樹脂柱，流出液棄去；
以5柱體積/h的速度，依次用pH=3、pH=5和pH=7的0.lmol/L焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，分別收集流出液并立即酸化至pH 1，攪拌4 h后，離心得到固體三份分別標記為粗提藻體腐殖酸亞組分I一一粗提藻體腐殖酸亞組分3 ;
在氮氣保護下，以5柱體積/h的速度，依次用pH=9、pH= 11和pH=13的0.lmol/L焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，分別收集流出液并立即酸化至pH 1，攪拌4 h后，離心得到固體三份分別標記為粗提藻體腐殖酸亞組分4一一粗提藻體腐殖酸亞組分6 ;
步驟1、藻體腐殖酸亞組分除鹽及固化:
在氮氣保護下，用0.1 mol/L的氫氧化鈉分別溶解粗提藻體腐殖酸亞組分I至粗提藻體腐殖酸亞組分6，用鹽酸調節(jié)每份溶解液的pH=5-9，并使每份溶解液的固液比均為1:2，共計得到六份腐殖酸亞組分溶液；
將六份腐殖酸亞組分溶液分別置入6個7000道爾頓透析袋，并將每個透析袋置于超純水中，組成透析體系，攪拌12 h，鹽分通過透析袋進入超純水，將每個透析袋中的腐殖酸亞組分溶液冷凍干燥得到六份腐殖酸亞組分固體，命名為藻體腐殖酸亞組分1、藻體腐殖酸亞組分2、藻體腐殖酸亞組分3、藻體腐殖酸亞組分4、藻體腐殖酸亞組分5、藻體腐殖酸亞組分
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[0006]優(yōu)選的，所述步驟g中，所得上層清液4用溶解有機碳測定儀器測定其溶解有機碳含量，如果上層清液4中溶解有機碳T0C>5mg/L，則重復步驟g，直到測得T0C〈5 mg/L后，再進行步驟h。
[0007]優(yōu)選的，所述步驟h中，當以某一 pH值的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱時，每收集2-50 ml流出液，即用特定波長紫外/可見波長進行測定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時，停止該pH值的焦磷酸鈉緩沖液的淋洗。優(yōu)選的，步驟h中，用550η波長的紫外/可見波長進行測定流出液的吸光值。
[0008]優(yōu)選的，所述步驟i中，每個透析袋的透析體系攪拌12h后，先用鉬酸銨分光光度法和硝酸銀法分別測定步驟i中去離子水中總磷的含量和氯離子含量，如果總磷含量>0.01 mg/L或者有氯化銀存在，則多次更換透析體系中的超純水，每次加入去離子水，攪拌12 h后，再次測定，直到測得的總磷含量〈0.01 mg/L且檢測不到氯離子。
[0009]優(yōu)選的，還包括步驟j:取少量步驟i所得的六