一種脂環(huán)化合物修飾的高分子材料及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高分子化學(xué)、有機(jī)合成以及生物材料技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種脂環(huán)化 合物修飾的高分子材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因轉(zhuǎn)染是指將外源基因?qū)爰?xì)胞,從而獲得新的遺傳性狀的過(guò)程。基因轉(zhuǎn)染載 體是基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的核心,理想的基因轉(zhuǎn)染載體應(yīng)具備如下特點(diǎn):高轉(zhuǎn)染效率,低細(xì)胞毒 性,生物安全性好,價(jià)格低廉等。當(dāng)前使用的基因轉(zhuǎn)染載體主要包括病毒類(lèi)載體和非病毒類(lèi) 載體。主要的應(yīng)用研究仍采用轉(zhuǎn)染效率高的病毒類(lèi)載體,但病毒類(lèi)載體存在攜帶基因能力 有限以及安全性隱患等問(wèn)題。因此,很多非病毒基因載體成為新的研究熱點(diǎn),包括陽(yáng)離子蛋 白質(zhì),多肽,脂質(zhì)體,納米金屬顆粒等。
[0003] 高分子基因載體的轉(zhuǎn)染效率與多個(gè)因素相關(guān),包括核酸結(jié)合能力、血清穩(wěn)定性,細(xì) 胞攝入效率、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和核酸釋放能力等。
[0004]聚酰胺-胺樹(shù)形高分子(polyamidoamine,PAMAM)是TomaliaD.A?于 1985 年首 次報(bào)道的具有幾何分支的橢圓形結(jié)構(gòu)的樹(shù)形大分子,其高效低毒安全的特點(diǎn)已經(jīng)在基因轉(zhuǎn) 染中被廣泛研究和應(yīng)用,得到了人們的廣泛關(guān)注。聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物于1995年首次 作為基因載體應(yīng)用,由于高密度的胺結(jié)構(gòu)存在,使其能與核酸緊密結(jié)合形成納米顆粒,利于 細(xì)胞內(nèi)吞,現(xiàn)已廣泛作為基因轉(zhuǎn)染載體。近年來(lái),將高分子表面氨基進(jìn)行化學(xué)修飾成為主要 的修飾方式之一,例如在表面氨基上共價(jià)連接環(huán)糊精、氨基酸、PEG等修飾基團(tuán),可以獲得相 對(duì)較好的基因轉(zhuǎn)染效果;另一類(lèi)修飾方式是在高分子表面氨基上修飾生物素、糖基、多肽片 段或蛋白質(zhì)等基團(tuán),可以使高分子作為載體時(shí)具有靶向轉(zhuǎn)染效果。上述修飾方式可以?xún)?yōu)化 增強(qiáng)高分子的基因轉(zhuǎn)染效果同時(shí)提高其細(xì)胞相容性。
[0005]由于脂質(zhì)體的疏水相互作用與細(xì)胞膜內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu),使得脂環(huán)化合物修飾的高 分子具有相當(dāng)好的膜融合能力。以聚酰胺-胺樹(shù)形高分子或支化聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物 為基礎(chǔ),表面氨基修飾鏈烷烴的基因載體,由于脂質(zhì)體的疏水相互作用,細(xì)胞攝入能力得到 提高,進(jìn)而其基因轉(zhuǎn)染效率得到提高,且隨著烷基鏈的長(zhǎng)度的增加(十二烷基鏈最佳),細(xì) 胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)相應(yīng)地提高。同時(shí),脂質(zhì)體的疏水相互作用能穩(wěn)定陽(yáng)離子脂質(zhì)體和核酸形成 的復(fù)合物。然而,這種鏈烷烴與陽(yáng)離子高分子形成的共價(jià)化合物雖然具有較高的基因轉(zhuǎn)染 效率,但是其仍然具有一定的不可忽視的細(xì)胞毒性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)普遍存在的鏈烷烴修飾的高分子材料作為基因轉(zhuǎn)染載體的 缺陷,創(chuàng)新地提出了一種脂環(huán)化合物修飾的高分子材料,利用一系列的陽(yáng)離子高分子作為 骨架,由脂環(huán)化合物修飾,共價(jià)連接到高分子表面,形成含有脂環(huán)化合物功能基團(tuán)的陽(yáng)離子 高分子聚合物。同樣作為脂質(zhì)體,脂環(huán)化合物利用其疏水相互作用在提高細(xì)胞攝入能力、增 加基因轉(zhuǎn)染效率的同時(shí),表現(xiàn)出優(yōu)于鏈烷烴修飾的高分子材料的生物相容性,彌補(bǔ)鏈烷烴 修飾的高分子作為基因轉(zhuǎn)染載體的不足。本發(fā)明的脂環(huán)化合物修飾的高分子材料可作為易 于合成、高轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定、高效、安全、價(jià)格低廉,同時(shí)細(xì)胞毒性小,生物相容性高 的基因轉(zhuǎn)染載體進(jìn)行應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供一種高分子材料,S卩脂環(huán)化合物修飾的高分子材料,其包括高分子骨 架和脂環(huán)化合物功能基團(tuán);所述高分子骨架為陽(yáng)離子高分子骨架;所述脂環(huán)化合物功能基 團(tuán)與所述高分子骨架表面共價(jià)連接,即所述高分子的伯胺基團(tuán)與脂環(huán)化合物通過(guò)化學(xué)反應(yīng) 共價(jià)相連。
[0008] 其中,所述高分子材料的結(jié)構(gòu)如式(1)所示:
[0009] R-(Y_S)X 式(1)
[0010] 式(1)中,Y為NHCONH,NHCSNH,NHCH0HCH2,NHCH2CH0H,NH或NHC0 基團(tuán);
[0011] S為所述脂環(huán)化合物功能基團(tuán);
[0012] R為所述陽(yáng)離子高分子骨架;
[0013]x為 1-1024 的整數(shù)。
[0014] 其中,所述S為如式(2)所示的環(huán)戊烷、如式(3)所示的環(huán)己烷、如式(4)所示的 環(huán)庚烷、如式(5)所示的環(huán)辛烷、如式(6)所示的環(huán)壬烷、如式(7)所示的金剛烷、如式(8) 所示的環(huán)十一烷或如式(9)所示的環(huán)十二烷:
[0015]
[0016] 其中,所述S作為脂環(huán)化合物,優(yōu)選地,為環(huán)戊烷(式2)、環(huán)庚烷(式4)、金剛烷 (式7)或環(huán)十二烷(式9)。
[0017] 其中,所述R為聚酰胺-胺樹(shù)形高分子、聚丙烯亞胺樹(shù)形高分子、聚賴(lài)氨酸樹(shù)形高 分子、支化聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物或線(xiàn)性聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物,即,所述R為如式 (10)所示的聚酰胺-胺樹(shù)形高分子、式(11)所示的聚丙烯亞胺樹(shù)形高分子、式(12)所示的 聚賴(lài)氨酸樹(shù)形高分子、如式(13)所示的支化聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物或如式(14)所示的 線(xiàn)性聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物;
[0018]
[0019] 其中,在式(10)、式(11)及式(12)中,M為高分子材料的核心,包括氨、乙二胺、丁 二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1,12-十二烷二胺;n為1-10的整數(shù);m為2-4的整數(shù)。
[0020] 在式(13)中,n為支化單元重復(fù)數(shù)量,所述支化聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物的分子 量為 600-100000 ;
[0021] 在式(14)中,n代表乙烯亞胺的重復(fù)數(shù)量,所述線(xiàn)性聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物的 分子量為600-100000。
[0022] 優(yōu)選地,所述R為聚酰胺-胺樹(shù)形高分子或支化聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物。
[0023] 本發(fā)明還提出了一種如式(1)所示的脂環(huán)化合物修飾的高分子材料的制備方法, 將所述脂環(huán)化合物和所述高分子溶解于水或有機(jī)溶劑,充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)后,除去未反應(yīng)的脂 環(huán)化合物以及相關(guān)溶劑,即得到所述的基于高分子和脂環(huán)化合物的高分子材料。
[0024] 由本發(fā)明的制備方法得到的高分子材料的結(jié)構(gòu)如式(1)所示:
[0025] R-(Y-S)X 式(1),
[0026] 式(1)中,
[0027]Y為NHCONH,NHCSNH,NHCH0HCH2,NHCH2CH0H,NH或NHC0基團(tuán);
[0028] S為脂環(huán)化合物功能基團(tuán);
[0029] R為陽(yáng)離子高分子骨架;
[0030] x為 1-1024 的整數(shù)。
[0031] 本發(fā)明的制備方法將脂環(huán)化合物共價(jià)連接到高分子骨架的表面上,即高分子的伯 胺基團(tuán)與脂環(huán)化合物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)相連,從而制備得到如式(1)所示的可以作為基因轉(zhuǎn)染 材料的脂環(huán)化合物修飾的高分子材料。
[0032] 本發(fā)明的制備方法中,所述高分子骨架R為聚酰胺-胺樹(shù)形高分子、聚丙烯亞胺樹(shù) 形高分子、聚賴(lài)氨酸樹(shù)形高分子、支化聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物或線(xiàn)性聚乙烯亞胺陽(yáng)離子 聚合物。其中,
[0033] 其中,所述R為陽(yáng)離子高分子,優(yōu)選地,為聚酰胺-胺樹(shù)形高分子(式10)或支化 聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物(式13)。
[0034] 其中,所述高分子表面為伯胺基團(tuán)。
[0035] 本發(fā)明制備方法中,所述脂環(huán)化合物功能基團(tuán)S為環(huán)戊烷、環(huán)庚烷、環(huán)辛烷、環(huán)壬 烷、金剛烷、環(huán)癸烷或環(huán)十二烷。優(yōu)選地,為環(huán)戊烷、環(huán)庚烷、金剛烷或環(huán)十二烷作為與高分 子反應(yīng)的主要單體。
[0036] 本發(fā)明制備方法中,將所述脂環(huán)化合物S和所述高分子R溶解于水或有機(jī)溶劑,充 分?jǐn)嚢璺磻?yīng),然后分離提純,得到所述高分子材料。所述有機(jī)溶劑為甲醇,乙醇,二甲亞砜, N,N-二甲基甲酰胺,或四氫呋喃等。
[0037] 本發(fā)明還提出了如式(1)所示的基于脂環(huán)化合物修飾的高分子材料作為生物大 分子的輸送載體的應(yīng)用。例如,如式(1)所示的基于脂環(huán)化合物修飾的高分子材料作為 基因轉(zhuǎn)染材料在體外作為核酸分子的輸送載體。其中,所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、 microRNA或修飾的核酸。
[0038] 本發(fā)明還提出了一種新的復(fù)合物,其包括如式(1)所示的基因轉(zhuǎn)染材料即基于脂 環(huán)化合物修飾的高分子材料和生物大分子。所述生物大分子優(yōu)選為核酸,由如式(1)所示 的基因轉(zhuǎn)染載體即基于脂環(huán)化合物修飾的高分子材料攜帶所述核酸。所述核酸包括DNA、 siRNA、shRNA、microRNA或修飾的核酸。例如,在室溫下,將所述基因轉(zhuǎn)染載體和熒光素酶 siRNA形成復(fù)合物,在該復(fù)合物中,由所述基因轉(zhuǎn)染載體攜帶核酸。
[0039] 基于穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的Hela細(xì)胞即Hela-luci細(xì)胞系,以熒光素酶基因作為 報(bào)告基因,以焚光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)焚光素酶(fireflyluciferase) 的活性這一報(bào)告系統(tǒng),利用本發(fā)明如式(1)所示的高分子材料輸送熒光素酶的干擾 RNA(siRNA),通過(guò)比較熒光素酶的活性,來(lái)評(píng)估高分子材料基因轉(zhuǎn)染的效果。本發(fā)明如式 (1)所示的高分子