pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性提高的突變體內(nèi)切葡聚糖酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體設(shè)及抑穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性提高的 突變體內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 0-葡聚糖廣泛存在于大麥、小麥、黑麥，燕麥，水稻和高梁等谷類經(jīng)濟(jì)作物的糊粉 層和胚乳細(xì)胞壁中，屬于植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，具有線型的空間結(jié)構(gòu)。0-葡 聚糖是由D型葡萄糖W不同比例的0-1，3和0-1，4糖巧鍵連接而形成的長鏈多糖聚合 物。0-葡聚糖鏈通過分子內(nèi)和分子間氨鍵的緊密排列形成不可溶的纖維素微絲。
[0003] 0-內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶系中的一個重要組成部分，它作用于纖維素分子內(nèi) 部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解0 -1，4-糖巧鍵，將長鏈纖維素分子降解產(chǎn)生小分子葡聚糖或葡 萄糖。0-葡聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用十分廣泛，如啤酒釀造、動物飼料添加及食品加工等。 其中酸性葡聚糖酶主要應(yīng)用于飼料行業(yè)，0 -葡聚糖作為一種非淀粉粘性多糖，在腸道內(nèi)吸 收較多的水分后，具有較高的粘度，阻止腸道消化液與食糜充分接觸，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的 吸收，成為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。動物飼料中添加P-葡聚糖酶可W幫助動物分解麥類成份（大 麥、小麥及燕麥），提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，促進(jìn)動物的消化吸收和生長發(fā)育。
[0004] 在飼料工業(yè)中，動物胃腸道是酸性環(huán)境，而且在飼料的加工過程中，有一個短時的 高溫過程，因此研究挖掘耐高溫、耐酸堿及高比活的酶將具有更高的商業(yè)價值及競爭性。而 自然界分離得到的酶很難滿足工業(yè)需求，因此通過分子改良的方法，理性設(shè)計提高酶的穩(wěn) 定性是目前學(xué)術(shù)及產(chǎn)業(yè)界持續(xù)努力的目標(biāo)。5家族內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1是一種高溫酸性 酶，最適溫度75°C，最適抑5. 0,不具備胃蛋白酶抗性，但其應(yīng)用于飼料行業(yè)中時需要在酸 性（PH2.0)條件下具有高酶活且能保持穩(wěn)定，具有胃蛋白酶抗性。為了使其更好地應(yīng)用于 飼料行業(yè)，需要對該酶進(jìn)行分子工程改造，W提高其嗜酸、耐酸性質(zhì)，從而具備胃蛋白酶抗 性。本發(fā)明通過定點突變的方法設(shè)計突變體來改良EG5AP1的抑穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性，進(jìn)而 有效地提高其在工業(yè)上的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供抑穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性提高的突變體內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1。
[0006]本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述突變的內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1的基因。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述突變的內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1的基因工程 方法。
[0010] 本發(fā)明的另一目的提供上述突變的內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1的應(yīng)用。 陽011]本發(fā)明對內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1 (其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，核巧酸序列 如SEQIDNO. 2所示）進(jìn)行定點突變，分別將177、261、288、333位谷氨酷胺突變?yōu)楣劝彼帷?陽01引 內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示：
[0013] MKASTIICA化PLALAVPNARRASGFVCMFP化LFIAEADGEIGFGS肥SGAEFGETKLPGVLGTDYIW PDASTIKTLHDAGMNIFRVAFRME化IPDKMTGTPDATYMNDLKATVNA口化GAYAVIDPHNYGRYYGNIISSTDD FAAFWKTVAAQFASNDHVIFDTNNEYHDMDETLVLNLNQAAINAIRAAGATSQYIFVEGNSWSGAWTWTNVNDNLKA LTDPQDKIVYEMHQYLDSDGSGTSATCVSSTIG犯RVQSATQWLKTNGKKGIIGEFAGGPNSVCQSAVTGMLD化SA NSDVWMGAAWWAAGPWWADYMFSMEPPSGTGYQNYLSLLKPYFVGGSGGNPPTTTTTTTSKPTTTTTTAGNPGGTGV AQHWGQCGGIGWKGPTACATPYTCQKLNDYYSQ化
[0014] 內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1的基因序列如SEQIDNO. 2所示：
[0015] atgaaggcttcgactattatctgtgcacttctcccccttgctttggcggtgccgaatgcgaggcgggct tctgggtttgtttgtatgtttccctttcttctcttcatcgcagaagctgacggtgagatagggtttggaagtaacga gtctggcgccgagtttggagagaccaagctcccgggcgtgctggggacggattatatctggcccgatgcgtcgacta tc過過g過ctctgc過tg過tgccggg過tg過過C過tcttccgtgttgcgttccggstggsgsggctcstcccggstssgstg acggggactccagatgcgacgtacatgaatgatctcaaggcgactgtcaatgcgattacgagtctgggggcgtatgc ggtgattgatccccataactatggaagatactacgggaacatcatctcgtcgactgacgactttgctgcgttctgga agaccgtggctgcccagtttgcgtccaatgaccatgtcatttttgacaccaacaatgagtaccatgatatggaccag acgctcgttctcaacctcaaccaggctgccatcaacgccatccgtgctgcaggcgccacctcgcagtacatttttgt Cgagggcaactcgtggtccggcgcgtggacctggaccaacgtcaacgacaacctcaaggccctcaccgaccctcagg ataagatCgtCtacgagatgcaccagtatCtGgactcagacgggtccggcacgtGggccacctgcgtgagetccacc 過tcggcc過gg過gcgcgtgc過gtccgcc過C過C過gtggttg過過g過CC過過tggt過過g過過過ggt過tc過t過ggcg過gttcgc tggaggccccaacagcgtgtgccagtCCgCtgtcacaggcatgcttgactacttgtCtgccaactCggatgtgtgga tgggcgcagcatggtgggccgctggtccctggtgggcagattatatgttcagcatggagccgccgtctggcactggc tatcagaactatctctcgttgttgaagccgtatttcgtcggtggttcgggtggtaaccctccaacgaccaccacgac 過過Ct過CC過gC過過gCCt過Ct過Cg過CC過Ct過CC過Cggctggg過過CCCtggCggC過CCgg過gtCgC過CSgCSCtggggCC agtgtggtggaattggatggaagggtCCgactgeetgcgccacgccatatacctgccagaagctgaacgactactac tctcaatgcctgtag
[0016] 所述構(gòu)建方法為，設(shè)計各突變引物，W編碼內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1基因的野生型質(zhì) 粒PPIC9 丫 -e巧APl為模板依次進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。純化得到含有突變密碼子的質(zhì)粒，并將 其轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞GSl15中進(jìn)行表達(dá)，得到重組突變體蛋白。
[0017] 所述的pPIC9 丫-e巧APl的構(gòu)建方法為，W化osartoiyafischeriPl的cDNA 為模板，W引物EG5-F和EG5-R對EG5AP1基因進(jìn)行擴(kuò)增。電泳純化PCR產(chǎn)物中的目的 條帶，用EorRI和NotI將PCR產(chǎn)物和PPIC9 丫質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，T4連接酶連接后得到 PPIC9 丫 -e巧APl重組質(zhì)粒，使該核巧酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控。
[0018] 所述構(gòu)建PPIC9 丫 -e巧APl的引物是：
[0019] EG5-F:5' -GCCGAATTCATGAAGGCTTCGACTATTAT-3'(沈QNO. 3)
[0020] EG5-R:5'-GCCGCGGCCGCCTACAGGCATTGAGAGTAGTA-3'(SEQNO. 4)
[0021] 所設(shè)計的用于定點突變的引物為：
[0022] Q177E-F:5' -CATGATATGGACGAGACGCTCGTTCTC-3'(SEQNO. 5)
[0023] Q177E-R:5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'（SEQNO. 6)
[0024] Q261E-F:5'-CAGGAGCGCGTGGAGTCCGCCACACAG-3'(SEQNO. 7) 陽O巧]Q261E-R:5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(沈QNO. 8)
[0026]Q288E-F:5'-CATGATATGGACCAGACGCTCGTTCTC-3'（SEQNO. 9)
[0027]Q288E-R:5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'(SEQNO. 10)
[0028] Q333E-F:5'-CAGGAGCGCGTGCAGTCCGCCACACAG-3'(沈QNO. 11)
[0029]Q333E-R:5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(SEQNO. 12) W30] 本發(fā)明通過PCR的方式引入突變，獲得突變體內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1W及編 碼基因。本發(fā)明還提供了包含上述內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1基因的重組載體，命名為 PPIC9 丫-e巧API。將本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶基因e巧APl插入到表達(dá)載體合適的限制性酶 切位點之間，使其核巧酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選 的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1插入到質(zhì)粒PPIC9 丫上的EorRI和 NotI限制性酶切位點之間，使該核巧酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重 組質(zhì)粒pPIC9 丫 -e巧API。
[0031] 本發(fā)明還提供了包含上述PPIC9 丫-e巧API基因的重組菌株，優(yōu)選重組菌株為 GS115/e巧API。 陽03引本發(fā)明還提供了一種制備內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1的方法，包括W下步驟：
[0033] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0034] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組纖維素酶表達(dá)；
[0035] 3)回收并純化所表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1。
[0036] 其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞，優(yōu)選 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞（Pichiapasto;ris)GS115,得到重組菌株GS115/eg5APl。
[0037] 本發(fā)明還提供了上述內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1的應(yīng)用。
[0038] 內(nèi)切葡聚糖酶EG5AP1具有最適溫度為75°C，最適抑為5. 0的性質(zhì)，但不具備胃蛋 白酶抗性，在飼料行業(yè)中的應(yīng)用受到限制。而本發(fā)明中設(shè)計的突變體在酸性條件下（pH2. 0) 能保持穩(wěn)定，具有胃蛋白酶抗性，且具有更好的耐熱性，因此更適于應(yīng)用在飼料行業(yè)。
【附圖說明】
[0039] 圖1-1~圖1-4顯示突變前后的內(nèi)切葡聚糖酶的基本性質(zhì)測定結(jié)果；
[0040] 圖2顯示野生酶及突變酶胃蛋白酶抗性實驗測定；
[0041] 圖3顯示野生酶與突變酶的酶活及Tm測定。<