專利名稱：具有修飾的FcRn結(jié)合位點的抗體融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有經(jīng)修飾的Fcto結(jié)合位點的抗體融合蛋白和編碼其的核酸分子。 該抗體融合蛋白包括2條多肽鏈，其中第一條多肽鏈包括與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的生物學活性、優(yōu)選治療活性的分子。第二條多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。兩條多肽鏈之一在恒定區(qū)中包括突變，該突變導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的減少或喪失，但不引起所述抗體融合蛋白的血清半衰期的實質(zhì)性降低。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及相應(yīng)地構(gòu)建的Fc-IFNii融合蛋白。
背景技術(shù)：
將目的蛋白質(zhì)與免疫球蛋白恒定區(qū)連接的抗體融合蛋白具有所連接的蛋白質(zhì)的生物學活性以及與免疫球蛋白組分的存在相關(guān)的優(yōu)點。此類融合蛋白的產(chǎn)生可以幫助確保目的蛋白質(zhì)的有效生產(chǎn)和分泌。此外，這些融合蛋白通常顯示出具有顯著治療優(yōu)點的新性質(zhì)，例如增加的循環(huán)半衰期。在成年哺乳動物中，F(xiàn)cfoi也稱為新生兒Fc受體，通過充當結(jié)合且援救IgG同種型的抗體不受降解的保護性受體，在維持血清抗體水平中起關(guān)鍵作用。IgG分子被內(nèi)皮細胞內(nèi)吞，如果它們與Fcfoi結(jié)合，那么再循環(huán)進入循環(huán)內(nèi)。相比之下，不與Fcfoi結(jié)合的IgG分子進入細胞，靶向溶酶體途徑，在其中降解。His435突變成丙氨酸的變體IgGl導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的選擇性喪失和顯著減少的血清半衰期(Firan等人2001，International Immunology 13 993)。IgG分子的Fc部分包括2條相同的多肽鏈，其中每條多肽鏈通過其Fcfoi結(jié)合位點結(jié)合單個Fcfoi分子(Martin等人，1999, Biochemistry 38 :12639) 較早的研究指出， 每個Fc部分需要2個Fcfoi結(jié)合位點用于血清維持。與同二聚野生型Fc片段比較，包含野生型Fcfoi結(jié)合多肽鏈和突變型非Fcfoi結(jié)合多肽鏈的異二聚Fc片段具有顯著減少的血清半衰期(Kim等人，1994，Scand. T. Immunol. 40 :457-465)。包含僅一個Fcfoi結(jié)合位點的此類異二聚Fc片段，比同二聚野生型Fc片段，再循環(huán)效力低，并且優(yōu)先運輸至溶酶體進行降解CTesar等人，2006, Traffic 7:1127)。這些觀察與涉及Fcfoi結(jié)合配偶體(包括IgG抗體或其Fc部分)的治療劑的有效應(yīng)用具有直接關(guān)聯(lián)性。例如，美國專利號7，348，004描述了融合蛋白，其特別需要完整的Fcfoi結(jié)合、或甚至增強的Fcfoi結(jié)合用于其改善的生物學性質(zhì)，例如增加的血清半衰期和增強的生物利用度。更近期的研究已鑒定了 Fcfoi在吞噬細胞中表達，并且暗示Fcfoi在IgG介導(dǎo)的吞噬作用中的新作用(Vidarsson等人2006,Blood 108:3573)。IgG調(diào)理的病原體通過Fcfoi 內(nèi)化到吞噬體內(nèi)，從而提供了一種有效地標記病原體以便由吞噬細胞攝入和破壞的手段。 具有H435A突變的IgGl變體展示出顯著減少的調(diào)理活性。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)在組分免疫球蛋白恒定區(qū)多肽鏈之一中具有能夠減少或消除Fcfoi結(jié)合的突變的抗體融合蛋白展示出，與不含突變的相應(yīng)融合蛋白相當?shù)纳飳W性質(zhì)，例如延長的循環(huán)半衰期。此外，考慮到Fcfoi在IgG介導(dǎo)的吞噬中的作用，可以想到，具有減少Fcfoi結(jié)合的突變的抗體融合蛋白可以具有低調(diào)理活性，導(dǎo)致減少的免疫原性。本發(fā)明提供用于表達在Fcfoi結(jié)合位點中具有減少Fcfoi結(jié)合的突變的可溶性、生物學活性抗體融合蛋白的方法和組合物。融合蛋白包括2條多肽鏈。第一條多肽鏈包括與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的生物學活性分子，并且第二條多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。其中一條多肽鏈的該部分免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列，因包含在Fcfoi 結(jié)合位點中的突變，而不同于另一條多肽鏈的該部分免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列。該差異可以是氨基酸缺失、插入、置換或修飾。在一個實施方案中，差異是在免疫球蛋白恒定區(qū)內(nèi)的特定位置，例如386、388、400、415、433、435、436和439位置，上的氨基酸置換。在一個優(yōu)選實施方案中，氨基酸置換在位置H435上，優(yōu)選地H435A。本發(fā)明涉及將生物學活性部分與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的融合蛋白。生物學活性分子可以與免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基末端連接?？商娲兀飳W活性分子可以與免疫球蛋白恒定區(qū)的羧基末端連接。在一個進一步的實施方案中，融合蛋白可以包括與具有至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)的2條多肽鏈連接的2個生物學活性分子。本發(fā)明涉及包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白?？紤]該部分免疫球蛋白恒定區(qū)可以是Fc片段。在各種實施方案中，F(xiàn)c片段是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在另一個實施方案中，融合蛋白在至少一條多肽鏈中包括免疫球蛋白可變區(qū)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的Fc-融合蛋白是這樣的分子，其中Fc部分經(jīng)由其一條或兩條CH2-CH3鏈的C或 N末端與治療上有效的分子融合，所述治療上有效的分子優(yōu)選蛋白質(zhì)或多肽例如細胞因子、 生長因子或生長激素、其它治療上有效的多肽、小化學分子或核酸，其中僅一條CH2-CH3鏈突變以消除或減少相應(yīng)免疫球蛋白鏈和優(yōu)選地整個融合蛋白的Fcfoi結(jié)合。取決于融合蛋白的性質(zhì)，可能更有利的是突變與生物學活性分子融合的免疫球蛋白鏈，或可能有利的是突變裸免疫球蛋白鏈。本發(fā)明的這些Fc融合蛋白可以是同二聚體(在2個生物學活性分子與抗體Fc部分融合的情況下，抗體部分的每條重鏈各與一個分子融合)，或當僅一個生物學活性分子與抗體或Fc部分的2條重鏈之一融合時，它們可以是異二聚體。本發(fā)明考慮，任何生物學活性分子作為本發(fā)明的治療分子的應(yīng)用。例如，生物學活性分子可以是人干擾素，例如干擾素-β (IFNi3)。為了改善折疊和減少聚集，干擾素-β序列可以相應(yīng)于天然、成熟干擾素-β包括在位置17、50、57、130、131、136和140中的至少一個上的氨基酸改變。該改變可以是氨基酸置換。在一個實施方案中，氨基酸置換選自C17S、 C17A、C17V、C17M、F50H、L57A、L130A、H131A、K136A、H140A 和 H140T。在另一個實施方案中， 生物學活性分子是其它細胞因子或生長因子，例如人促紅細胞生成素。在一個優(yōu)選實施方案中，IFNii分子與Fcfoi突變的免疫球蛋白的Fc部分的N或C末端融合。一個特別優(yōu)選的實施方案是(二聚)Fc-IFNβ融合蛋白，其中一個任選修飾的IFNi3分子與第一條免疫球蛋白CH2-CH3鏈恒定區(qū)的C末端或任選地N末端，優(yōu)選地C末端融合，而第二條CH2-CH3 免疫球蛋白鏈缺乏IFNii，并且阻止或減少Fcfoi結(jié)合的突變位于第一條或第二條CH2-CH3 鏈，優(yōu)選裸露的那條鏈中，并且突變發(fā)生在位置435上，且特別是H435A。此類優(yōu)選的Fc融合分子是異二聚體。此外，進一步優(yōu)選的Fc-IFNii融合蛋白，除這些結(jié)構(gòu)特征外，還具有與 IgG2或IgG4的CH2-CH3區(qū)偶聯(lián)的IgGl鉸鏈區(qū)。本發(fā)明還提供用于編碼和表達本發(fā)明的融合蛋白的方法。例如，本發(fā)明的一個方面涉及編碼多肽鏈的核酸，所述多肽鏈包括生物學活性分子和包含減少Fcfoi結(jié)合的突變的至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。在另一個方面，本發(fā)明涉及編碼第一多肽鏈的第一核酸和編碼第二多肽鏈的第二核酸的組合物，其中第一多肽鏈包括生物學活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，并且所述第二多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。這些核酸序列之一包含在Fcfoi結(jié)合位點中的突變。在一個實施方案中，突變是在恒定區(qū)中的一個或多個位置(例如位置386、388、400、415、433、435、436和439)上的氨基酸置換，其中殘基的編號為根據(jù)Kabat的EU hdex的編號。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，氨基酸置換在位置435 上，且特別是H435A。在另一個方面，本發(fā)明的核酸分子或核酸組合物可以摻入可復(fù)制的表達載體內(nèi)，隨后可以引入宿主細胞內(nèi)，并且可以與宿主細胞基因組重組且整合到其內(nèi)?？蓮?fù)制的表達載體可以包括上述核酸或核酸組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋包含上述核酸或核酸組合物的宿主細胞。本發(fā)明在本文中提供包括上述融合蛋白和藥學上可接受的載體的藥物組合物。取決于預(yù)期用途或施用方式，可以在藥物組合物中采用固體或液體藥學上可接受的載體。本發(fā)明的再一方面涉及通過施用任何上述融合蛋白減輕疾病或病癥而治療哺乳動物的方法。在一個實施方案中，疾病或病癥是病毒感染。在另一個實施方案中，疾病或病癥是貧血，而在另外一個實施方案中，疾病或病癥是多發(fā)性硬化?？傊景l(fā)明涉及下述主題·包括2條多肽鏈的蛋白質(zhì)，其中第一條多肽鏈包括生物學活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，第二條多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，并且多肽鏈之一包括在Fcfoi結(jié)合位點中的突變。·包括第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域的抗體融合蛋白，其中每個結(jié)構(gòu)域各包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，其中所述第一或第二重鏈結(jié)構(gòu)域中的至少一個與生物學活性分子融合，并且所述第一或第二重鏈結(jié)構(gòu)域中的僅一個包括在恒定區(qū)內(nèi)的氨基酸序列突變，其中所述突變導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的部分或完全喪失，并且不引起融合蛋白的血清半衰期的減少或?qū)嵸|(zhì)性減少?？贵w融合蛋白的血清半衰期的實質(zhì)性減少根據(jù)本發(fā)明是指，該減少達到在一個或多個位置上，優(yōu)選在位置386、388、400、415、433、435、436、439和447上，且最優(yōu)選在位置435上不含F(xiàn)cfoi結(jié)合位點突變的融合蛋白的血清半衰期的10%以上，優(yōu)選5%以上，且最優(yōu)選3%以上。·相應(yīng)的蛋白質(zhì)或抗體融合蛋白，其中生物學活性分子與免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基末端或與免疫球蛋白恒定區(qū)的羧基末端連接?！は鄳?yīng)的蛋白質(zhì)或抗體融合蛋白，其中第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域包括生物學活性分子?！は鄳?yīng)的蛋白質(zhì)或抗體融合蛋白，其為抗體Fc片段，其中第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域是包括鉸鏈區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，且因此構(gòu)成所述Fc片段。·可替代地，抗體融合蛋白，其中第一和/或第二重鏈結(jié)構(gòu)域包括抗體可變結(jié)構(gòu)域，從而形成允許結(jié)合抗原靶的完整全抗體。 相應(yīng)的蛋白質(zhì)或抗體融合蛋白，其中免疫球蛋白是IgG，優(yōu)選IgGl、IgG2或IgG4?！?yōu)選的抗體融合蛋白，其為抗體Fc片段或部分，其中(i)第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域是包括鉸鏈區(qū)的IgG的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成Fc片段；(ii)第一重鏈結(jié)構(gòu)域經(jīng)由其C末端與生物學活性分子融合；和(iii)第二重鏈結(jié)構(gòu)域不與生物學活性分子融合，從而形成！^異源二聚體融合蛋白。在這個實施方案中，導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的喪失或減少的突變可以位于未與生物學活性分子融合的重鏈結(jié)構(gòu)域中，或它可以位于與生物學活性分子融合的重鏈結(jié)構(gòu)域中。·相應(yīng)的蛋白質(zhì)或抗體融合蛋白，其中生物學活性和治療上有效的分子是人干擾素，或細胞因子，例如干擾素或白細胞介素，生長因子例如促紅細胞生成素或生長激素例如人生長激素。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的是相應(yīng)的Fc融合蛋白，其包含僅與Fc分子的一條重鏈融合的，優(yōu)選與Fc分子的C末端融合的干擾素-β (IFNi3)分子?！は鄳?yīng)的抗體融合蛋白，優(yōu)選Fc融合蛋白，其中人IFNii的氨基酸序列相應(yīng)于天然成熟人IFN β在一個或多個位置上，優(yōu)選在位置17、50、57、130、131、136和140上是改變的，優(yōu)選是置換的。優(yōu)選地，該Fc-IFNii在IFNii序列內(nèi)的如下一個或多個位置上是置換的C17S、C17A、C17V、C17M、F50H、L57A、L130A、H131A、K136A、H140A 和 H140T?！は鄳?yīng)的Fc片段，其在未與天然或修飾的IFNii融合的重鏈中包括Fcfoi突變，或反之亦然，i^cfoi突變發(fā)生在與天然或修飾的IFNii融合的重鏈中，其中在此2種可選方案中，F(xiàn)c融合蛋白的鉸鏈區(qū)源自與該IgG重鏈不同的IgG，例如相應(yīng)的Fc融合分子，其中鉸鏈區(qū)源自IgGl，并且CH2-CH3重鏈源自IgG2或IgG4?！みm于制備如上文和下文所述的抗體融合蛋白的核酸組合物，其包括(i)編碼第一重鏈結(jié)構(gòu)域的核酸，所述第一重鏈結(jié)構(gòu)域包括與至少部分IgG恒定區(qū)融合的生物學活性分子，和(ii)編碼第二重鏈結(jié)構(gòu)域的核酸，所述第二重鏈結(jié)構(gòu)域包括不與生物學活性分子融合的至少部分IgG恒定區(qū)，其中所述IgG恒定區(qū)或其部分中僅一個包括導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的部分或完全喪失的突變?！ぐㄏ鄳?yīng)的蛋白質(zhì)或抗體融合蛋白，優(yōu)選地相應(yīng)的Fc融合蛋白，最優(yōu)選地如所述的Fc-IFNii融合蛋白，和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物?！は鄳?yīng)的蛋白質(zhì)或抗體融合蛋白，優(yōu)選地相應(yīng)的Fc融合蛋白，最優(yōu)選地如所述的 Fc-IFN^融合蛋白或所述的藥物組合物，用于在疾病例如病毒感染、貧血、癌癥或多發(fā)性硬化治療中的用途。附圖簡述

圖1A-1D示意性舉例說明一個生物學活性分子(圓圈)可以與抗體的Fc亞基如何連接，此處抗體的Fc亞基顯示為鉸鏈(小矩形)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域(大矩形)。 Fc亞基之一包括Fcfoi結(jié)合位點中的突變(菱形)。生物學活性分子可以與Fc亞基的N末端(圖IA和1B)或C末端(圖IC和1D)連接。圖2A-2F舉例說明2個生物學活性分子可以與抗體的Fc亞基連接的一些方式。Fc 亞基之一包括在Fcfoi結(jié)合位點中的突變。2個生物學活性分子可以是相同或不同的(黑色或白色圓圈)。圖3A-3H顯示一個生物學活性分子可以與包括重鏈的恒定區(qū)(矩形)和可變區(qū) (有點的矩形)的抗體如何連接?？贵w融合蛋白可以包括單個可變區(qū)(圖3A-3D)，或抗體融合蛋白可以包括2個可變區(qū)(圖3E-3H)。重鏈之一包括在Fcfoi結(jié)合位點中的突變。圖4A-4F顯示2個生物學活性分子可以與包括重鏈的恒定區(qū)(矩形)和可變區(qū) (有點的矩形)的抗體如何連接。2個生物學活性分子可以是相同或不同的(黑色或白色圓圈)。重鏈之一包括Fcfoi結(jié)合位點中的突變。圖5A-5D顯示一個生物學活性分子可以與完整免疫球蛋白例如IgG連接的一些方式。重和輕鏈的恒定區(qū)顯示為矩形，可變區(qū)顯示為有點的矩形。重鏈之一包括Fcfoi結(jié)合位點中的突變。生物學活性分子可以與重鏈(圖5A和5B)或輕鏈(圖5C和5D)連接。圖6A-6F舉例說明2個生物學活性分子可以與完整免疫球蛋白例如IgG如何連接。重鏈之一包括Fcfoi結(jié)合位點中的突變。生物學活性分子可以與重鏈(圖6A和6B)或輕鏈(圖6C和6D)連接?？商娲兀飳W活性分子之一可以與重鏈連接，而另一個生物學活性分子與輕鏈連接(圖6E和6F)。圖7A-7F舉例說明2個不同的生物學活性分子可以與完整免疫球蛋白例如IgG如何連接。重鏈之一包括Fcfoi結(jié)合位點中的突變。圖8顯示在還原(左圖)和非還原條件(中圖)下對細胞中瞬時共表達人 Fc y 4h 鏈和人 Fc y 4h-接頭-DI-IFN β 鏈而產(chǎn)生的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β 的 SDS-PAGE 分析。在左圖中，泳道2顯示Fcy 4h鏈和Fcy 4h-接頭-DI-IFN β鏈均被表達，而泳道1是顯示單獨Fc y 4h表達的對照。在中圖中，在非還原條件下分析人Fc y 4h鏈和Fc y 4h_接頭-DI-IFN β鏈的瞬時共表達。分析了 Fc γ 4h鏈(標記為Ia和Ib的2個泳道)或Fc γ 4h 鏈和Fc y 4h-接頭-DI-IFN β鏈的共表達(標記為加和2b的2個泳道)的一式兩份樣品。 右圖顯示，自2個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆(標記為3和4的2個泳道)的Fc和Fc-IL-2鏈共表達給出了裸Fc同源二聚體Fc/Fc-IL2異源二聚體Fc_IL2同源二聚體的正常和預(yù)期比。圖9顯示在非還原條件下對來自共表達Fc γ 4h鏈和Fc y 4h_接頭-DI-IFN β鏈的多個穩(wěn)定NSO克隆的條件培養(yǎng)基的SDS-PAGE分析。所有克隆都產(chǎn)生了 Fc y 4h同源二聚體和Fc y 4h/Fc y 4h-IFNi3異源二聚體，但幾乎沒有或沒有Fc y 4h_IFNi3同源二聚體。圖10顯示在致細胞病變效應(yīng)(CPE)抑制測定試驗中純化的 Fc y 4h-單-L-DI-IFN^ (方塊)和包含 H435A 置換的 Fc y 4h-單-L-DI-IFN^ 變體(三角)的生物學活性。人上皮肺癌細胞系A(chǔ)549用作腦心肌炎病毒(EMCV)的宿主。Rebif (圓圈)用作陽性對照。圖11比較靜脈內(nèi)施用的huFc γ 4h-單-L_DI_IFNi3 (菱形)和包含H435A置換的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β 變體(方塊)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 異源二聚體的形式)的藥代動力學曲線。小鼠(η = 3)用25yg總蛋白質(zhì)/小鼠靜脈內(nèi)注射。 在不同時間點的注射蛋白質(zhì)的血清濃度通過抗hu Fc ELISA測定。圖12比較靜脈內(nèi)施用的huFc y 4h-單-L_DI_IFNi3 (菱形)和包含H435A置換的 huFc4h-單-L-DI-IFN β 變體(方塊)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 異源二聚體的形式)的藥代動力學曲線。小鼠(η = 3)用25 μ g總蛋白質(zhì)/小鼠靜脈內(nèi)注射。在不同時間點的注射蛋白質(zhì)的血清濃度通過ELISA測定，所述ELISA由抗hu(H&L)捕獲和抗 hu IFN^檢測組成。圖13比較皮下施用的huFc y 4h-單-L-DI-IFN^ (菱形)和包含H435A置換的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β 變體(方塊)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 異源二聚體的形式)的藥代動力學曲線。小鼠(η = 3)用50 μ g總蛋白質(zhì)/小鼠皮下注射。在不同時間點的注射蛋白質(zhì)的血清濃度通過抗hu Fc ELISA測定。圖14比較皮下施用的huFc y 4h-單-L-DI-IFN^ (菱形)和的包含H435A置換的huFc y 4h-單-L-DI-IFN β 變體(方塊)(以 huFc y 4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 異源二聚體的形式)的藥代動力學曲線。小鼠(11 = 3)用5048總蛋白質(zhì)/小鼠皮下注射。 在不同時間點的注射蛋白質(zhì)的血清濃度通過由抗hu(H&L)捕獲和抗hu IFN^檢測組成的 ELISA測定。圖15比較在加強注射后用huFc y 4h-單-L-DI-IFN β (圓圈)或包含Η435Α置換的11砂(^411-單-1^-01-0^^變體(菱形)免疫接種的小鼠的抗體滴度。小鼠抗體滴度通過ELISA測定。圖16是在還原條件下對來自靜脈內(nèi)藥代動力學研究的小鼠血清樣品的蛋白質(zhì)印跡分析。左上用抗hu Fc探測的huFc γ 4h-單-L-DI-IFNii ；左下用抗hu Fc 探測的包含H4!35A置換的huFc y 4h-單-L-DI-IFN β變體；右上用抗hu IFN β探測的huFc y 4h-單-L-DI-IFN^ ；右下用抗hu IFN0探測的包含H4!35A置換的 huFcγ4h-單-L-DI-IFNβ 變體。圖17是在還原條件下對來自皮下藥代動力學研究的小鼠血清樣品的蛋白質(zhì)印跡分析。左上用抗hu Fc探測的huFc γ 4h-單-L-DI-IFNii ；左下用抗hu Fc 探測的包含H4!35A置換的huFc y 4h-單-L-DI-IFN β變體；右上用抗hu IFN β探測的huFc y 4h-單-L-DI-IFN^ ；右下用抗hu IFN0探測的包含H4!35A置換的 huFcγ4h-單-L-DI-IFNβ 變體。發(fā)明詳述定義本文考慮的治療劑或組合物的“有效量”或“藥學有效量”是足以產(chǎn)生所需效應(yīng)， 例如減少疾病癥狀的嚴重性的量。藥學有效量將取決于待治療的受試者和疾病病癥、受試者的重量和年齡、疾病病癥的嚴重性、施用方式等而改變。例如，本發(fā)明的特定組合物可以以足夠的量施用，以產(chǎn)生適用于該治療的合理利益/風險比。如本文使用的，術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈形式的包含至少2個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。DNA可以為例如質(zhì)粒DNA、預(yù)凝聚的 DNA(pre-condensed DNA)、PCR產(chǎn)物、載體(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色體)、表達盒、染色體 DNA或這些的衍生物和組合。RNA可以是mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、vRNA及其組合。核酸包括包含已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接的核酸，其可以是合成、天然存在和非天然存在的，并且可以具有與參考核酸相似的結(jié)合性質(zhì)。此類類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2' -0-甲基核糖核苷酸和肽核酸 (PNAs)?！昂塑账帷卑撗鹾颂?DNA)或核糖(RNA)、糖、含氮堿基和磷酸基團或其類似物。 核苷酸通過磷酸基團連接在一起?！皦A基”包括嘌呤和嘧啶，這進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然類似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物， 這包括但不限于放置新反應(yīng)基團例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯和烷基鹵化物的修飾。術(shù)語“小分子”指具有小于IkDa分子量的分子。小分子可以是天然存在或合成的各種分子。生物學活性分子可以是小有機分子、小無機分子、糖分子、脂質(zhì)分子等。小分子可以是藥物。術(shù)語“藥學上可接受的賦形劑”指在配制藥物產(chǎn)品中使用的藥學上可接受的材料、組合物或媒介物，例如脂質(zhì)或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑。每種賦形劑必須是就與主題組合物及其組分相容以及對于患者無害方面而言是“可接受的”?？梢猿洚斔帉W上可接受的賦形劑的一些材料實例包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；( 淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；C3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；⑷黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)；明膠；(7)滑石；⑶賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟； (9)油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水； (17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)在藥學制劑中采用的其他無毒相容性物質(zhì)?？贵w融合蛋白將目的蛋白質(zhì)與免疫球蛋白恒定區(qū)例如免疫球蛋白Fc區(qū)連接的抗體融合蛋白具有所連接的蛋白質(zhì)的生物學活性以及與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)組分的存在相關(guān)的優(yōu)點。與單獨的生物學活性分子比較，此類融合蛋白顯示出增強的穩(wěn)定性和增加的生物利用度。另外，F(xiàn)c片段的存在可以顯著改善蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。據(jù)認為，其可以部分地因融合蛋白的Fc部分被設(shè)計用于融合蛋白的有效分泌以及部分地因融合蛋白可以在天然表達免疫球蛋白的宿主細胞中產(chǎn)生和分泌從而使得融合蛋白可以容易地從宿主細胞中分泌而發(fā)生。最后，F(xiàn)c片段可以進一步用于幫助純化融合多肽。在成年哺乳動物中，F(xiàn)cfoi充當結(jié)合IgG和援救IgG不受降解的保護性受體。眾多研究支持抗體的Fcfoi結(jié)合親和力和血清半衰期之間的關(guān)系。令人驚訝的是，本發(fā)明提供了具有減少Fcfoi結(jié)合的突變的抗體融合蛋白顯示出與不含該突變的相應(yīng)融合蛋白相當?shù)纳飳W性質(zhì)，例如延長的循環(huán)半衰期。此外，考慮到Fcfoi在IgG介導(dǎo)的調(diào)理中的作用，考慮具有減少Fcfoi親和力的突變的抗體融合蛋白可以展示出減少的免疫原性。因此，本發(fā)明提供包括2條多肽鏈的抗體融合蛋白。第一條多肽鏈包括與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的生物學活性分子，并且第二條多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。多肽鏈之一的免疫球蛋白恒定區(qū)的部分的氨基酸序列，因為包含F(xiàn)cfoi結(jié)合位點中的突變，而不同于第二條多肽鏈的免疫球蛋白恒定區(qū)的部分的氨基酸序列。本發(fā)明還提供用于表達在Fcfoi結(jié)合位點中具有減少Fcfoi結(jié)合的突變的可溶性、 生物學活性的抗體融合蛋白的方法和組合物。特別地，本發(fā)明提供了編碼多肽鏈的核酸分子，所述多肽鏈包括生物學活性分子和包括減少Fcfoi結(jié)合的突變的至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。在另一個方面，本發(fā)明涉及編碼第一多肽鏈的第一核酸和編碼第二多肽鏈的第二核酸的組合物，所述第一多肽鏈包括生物學活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，并且所述第二多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。核酸序列之一包含F(xiàn)cfoi結(jié)合位點中的突變。本發(fā)明還提供通過給哺乳動物施用有效量的本發(fā)明抗體融合蛋白，由抗體融合蛋白的施用而減輕疾病或病癥的治療方法?？贵w融合蛋白結(jié)構(gòu)變體本發(fā)明公開包括2條多肽鏈的抗體融合蛋白。第一條多肽鏈包括與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的生物學活性分子，并且第二條多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。多肽鏈之一包括Fcfoi結(jié)合中的突變。
圖1舉例說明生物學活性分子可以與抗體的免疫球蛋白恒定區(qū)例如Fc亞基連接的一些方式。生物學活性分子可以與免疫球蛋白恒定區(qū)的N末端(圖IA和1B)或免疫球蛋白恒定區(qū)的C末端(圖IC和1D)連接。生物學活性分子可以與具有Fcfoi結(jié)合突變的免疫球蛋白恒定區(qū)連接或與不含該突變的免疫球蛋白恒定區(qū)連接?？贵w融合蛋白可以包括至少2個生物學活性分子。如圖2中舉例說明的，生物學活性分子可以與免疫球蛋白恒定區(qū)的N末端(圖2A)或免疫球蛋白恒定區(qū)的C末端(圖2B) 連接，或生物學活性分子之一可以與免疫球蛋白恒定區(qū)的N末端連接，并且第二生物學活性分子與免疫球蛋白恒定區(qū)的C末端連接(圖2C)。2個生物學活性分子可以是相同或不同的。圖2D-2F舉例說明2個不同的生物學活性分子可以與免疫球蛋白恒定區(qū)如何連接。本發(fā)明還涉及包括2條多肽鏈的抗體融合蛋白，其中多肽鏈中的至少一條包括抗體可變結(jié)構(gòu)域。圖3舉例說明生物學活性分子可以與包括抗體可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白區(qū)域如何連接的一些方式。生物學活性分子可以與包括抗體可變結(jié)構(gòu)域的多肽鏈之一的 N末端或C末端連接(圖3A-3D)。可替代地，2條多肽鏈均可以包括抗體可變結(jié)構(gòu)域(圖 3E-3H)。圖4顯示2個生物學活性分子可以與包括重鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)的抗體如何連接。生物學活性分子可以與免疫球蛋白區(qū)域的N末端、C末端、或N末端和C末端連接(圖 4A-4C)。不同的生物學活性分子可以與免疫球蛋白區(qū)域連接(圖4D-4F)。本發(fā)明的融合蛋白可以包括與完整抗體例如IgG連接的生物學活性分子。圖5描述生物學活性分子可以與抗體連接的一些方式。生物學活性分子可以與免疫球蛋白重鏈的 N末端或C末端連接(圖5A和5B)。可替代地，生物學活性分子可以與免疫球蛋白輕鏈的 N末端或C末端連接(圖5C和5D)。圖6舉例說明2個生物學活性分子可以與完整抗體如何連接。生物學活性分子可以與免疫球蛋白重鏈的N末端或C末端連接(圖6A和6B)?？商娲?，生物學活性分子可以與免疫球蛋白輕鏈的N末端或C末端連接(圖6C和6D)。生物學活性分子之一可以與免疫球蛋白重鏈連接，而第二個生物學活性分子可以與免疫球蛋白輕鏈連接(圖6E和6F)。 圖7顯示不同的生物學活性分子可以與完整抗體如何連接(圖7A-7F)?？贵w融合蛋白的生物學性質(zhì)如前所述，本發(fā)明的抗體融合蛋白可以表現(xiàn)出與不含突變的相應(yīng)融合蛋白可比的生物學性質(zhì)，例如延長的循環(huán)半衰期。例如，圖11-15證實含H435A突變的人Fc y 4_IFNi3 在體內(nèi)展示出與不含該突變的人FcY4_IFNi3相似的血清穩(wěn)定性。靜脈內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)的含H435A突變的Fc y 4_IFNi3顯示出了與不含該突變的抗體融合蛋白相似的循環(huán)半衰期 (圖11和12)。相似地，皮下注射到小鼠體內(nèi)的含H435A突變的FcY4-IFNi3顯示出了與不含該突變的抗體融合蛋白相似的循環(huán)半衰期(圖13和14)?？紤]本發(fā)明的抗體融合蛋白的衍生物，其可以通過置換、添加和/或缺失/截短來改變其氨基酸序列或通過引入導(dǎo)致功能上等價分子的化學修飾而制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，任何蛋白質(zhì)的序列中都有一些氨基酸可以置換成其他氨基酸而不會不利地影響蛋白質(zhì)的活性。由此改變而產(chǎn)生的衍生物、類似物或突變體、及此衍生物的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。FcRn結(jié)合位點突變
本發(fā)明提供了在包括Fc的一條多肽鏈的Fcfoi結(jié)合位點中具有突變的抗體融合蛋白。雖然包括Fc的另一條多肽鏈保留固有的Fcfoi結(jié)合親和性，但突變導(dǎo)致抗體融合蛋白對Fcfoi受體減少的結(jié)合親合力。減少的結(jié)合可以表征為具有低于IO6M-1的親和常數(shù)&的低親和力。需要時，F(xiàn)cfoi結(jié)合可以通過改變結(jié)合條件而降低。結(jié)合條件，例如分子濃度、溶液的離子強度、溫度、允許用于結(jié)合的時間，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。與Fcfoi受體結(jié)合的IgG Fc部分的區(qū)域已基于X射線晶體學得到描述 (Burmeister等人，1994, Nature 372:379)。涉及與Fcfoi結(jié)合的IgG殘基位于Fc區(qū)的 CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面上。主要接觸位點包括CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基對8、250_257、272、 285、288、290、291、308-311 和 314，以及 CH3 結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基 385-387,428 和 433-436。使用這個知識，抗體融合蛋白的Fc片段可以根據(jù)公認的程序例如定點誘變進行修飾，以生成對于Fcfoi具有減少的親和力的經(jīng)修飾的抗體融合蛋白。修飾可以是置換、添加和/或缺失/截短。例如，抗體融合蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)可以包含在位置435 (在天然IgGlFc片段中對應(yīng)于組氨酸)上的改變。氨基酸改變可以通過本領(lǐng)域已知的方法用丙氨酸替換組氨酸(H435A)。除在位置435上的改變外，本發(fā)明還考慮具有其他改變的殘基的抗體融合蛋白。例如，抗體融合蛋白可以在位置233、234、235、236、252、253、254、255、沘8、309、386、 388、400、415、433、4；35、436、439和447中的一個或多個上改變，其中，IgG Fc區(qū)中的殘基的編號是 Kabat 等人(Seq uences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版， Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))中描述的 EU hdex的編號?？梢詼p少或消除與Fcfoi的結(jié)合的修飾例子包括但不限于下述E233A、 L234A、L235A、G236A、I253A、S254A、R255A、K288A、S415A、H433A、H435A、Y436A?？紤]，還可以突變上文未列出的另外氨基酸殘基，以減少Fcfoi結(jié)合。此外，除丙氨酸外，其他氨基酸殘基也可以置換在上述位置上的野生型氨基酸。突變可以單個引入，或可以將這些突變中的 2、3個或更多個組合一起引入。此外，抗體融合蛋白的多肽鏈之一可以突變以減少Fcfoi結(jié)合，或2條多肽鏈均可以是突變的。無論生物學活性分子如何，均可以使用本文描述的任何突變。免疫球蛋白區(qū)域本發(fā)明的抗體融合蛋白包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。完整免疫球蛋白包括共價結(jié)合的4條多肽鏈-2條重鏈和2條輕鏈。每條鏈進一步包括一個可變區(qū)和一個恒定區(qū)。 取決于免疫球蛋白同種型，重鏈恒定區(qū)包含3或4個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(例如CHl、CH2、CH3、 CH4)和鉸鏈區(qū)。這些結(jié)構(gòu)域如下順次命名CH1-鉸鏈-CH2-CH3(-CH4)。部分免疫球蛋白恒定區(qū)可以包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的部分。在一個實施方案中，免疫球蛋白是IgG。在另一個實施方案中，免疫球蛋白是IgGl。在另一個實施方案中，免疫球蛋白是IgG2。在另一個實施方案中，免疫球蛋白是IgG3，而在另外一個實施方案中，免疫球蛋白是IgG4。合適免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的選擇在美國專利號5，541, 087和 5，726，044中詳細討論。自某些免疫球蛋白類別和亞類選擇特定免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列以達到特定結(jié)果，被視為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平內(nèi)。部分免疫球蛋白恒定區(qū)可以包括整個重鏈恒定區(qū)、或其片段或類似物。在一個實施方案中，部分免疫球蛋白恒定區(qū)是Fc片段。例如，免疫球蛋白Fc片段可以包括1)CH2結(jié)構(gòu)域；2)CH3結(jié)構(gòu)域；3)CH4結(jié)構(gòu)域；4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域；5)CH2結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域；6) CH3結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域；或7)免疫球蛋白鉸鏈區(qū)和/或CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域和/或CH4結(jié)構(gòu)域的組合。在一個實施方案中，免疫球蛋白Fc區(qū)包括至少免疫球蛋白鉸鏈區(qū)，而在另一個實施方案中，免疫球蛋白Fc區(qū)包括至少一個免疫球蛋白恒定重鏈區(qū)，例如CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域，并且取決于用于生成Fc區(qū)的免疫球蛋白類型，任選地CH4結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，且優(yōu)選缺乏CHl 結(jié)構(gòu)域，而在另一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域。在另外一個實施方案中， Fc區(qū)包括鉸鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域。 免疫球蛋白Fc片段可以來自任何免疫球蛋白類型。例如，免疫球蛋白類型可以是 IgG(IgG Yl) (Y亞類1、2、3或4)。還可以使用其他類型的免疫球蛋白，例如IgAdga )、 IgD(IgS), IgE(Ige)和IgM(Igy)。合適免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的選擇在美國專利號 5，541, 087和5，726，044中詳細討論。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解如何從某些免疫球蛋白類型和亞類中選擇特定免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)以實現(xiàn)特定結(jié)果?？紤]，可以使用于生成融合蛋白的Fc片段適應(yīng)于特定應(yīng)用。例如，F(xiàn)c片段可以源自免疫球蛋白Yl同種型或其變體。人Yl作為Fc片段序列的使用具有幾個優(yōu)點。例如， 當希望使融合蛋白靶向肝臟時，可以使用衍生自免疫球蛋白Yl同種型的Fc片段。另外， 如果抗體融合蛋白待用作生物藥，那么FcyI結(jié)構(gòu)域可以對融合蛋白賦予效應(yīng)子功能活性。該效應(yīng)子功能活性包括生物學活性，例如胎盤轉(zhuǎn)移和增加的血清半衰期。該免疫球蛋白 Fc片段還使得可以通過抗Fc ELISA進行檢測和通過與金黃色葡萄球菌(Maphylococcus aureus)蛋白A( “蛋白A”)結(jié)合進行純化?？商娲?，抗體融合蛋白的Fc片段可以源自免疫球蛋白Y4同種型。因為免疫球蛋白Y 4同種型在介導(dǎo)效應(yīng)子功能中是無效的，并且展示出與Fc γ受體極大減少的結(jié)合， 所以考慮當施用于哺乳動物時，具有免疫球蛋白Y 4作為Fc區(qū)的抗體融合蛋白可以顯示出減少的免疫效應(yīng)子功能和增強的循環(huán)半衰期。免疫球蛋白Fc片段可以組合多個免疫球蛋白類型或亞類。例如，片段可以組合 IgGl鉸鏈區(qū)以及IgG2CH2和CH3結(jié)構(gòu)域(參見例如美國專利號7，148，326)。在某些實施方案中，可以組合來自不同同種型的部分結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生具有改變的二聚化性質(zhì)的鏈交換工程化結(jié)構(gòu)域(〃 SEED")，如美國專利申請公開號2007/(^87170中描述的。在一個實施方案中，抗體融合蛋白包括至少一個抗體可變結(jié)構(gòu)域。抗體可變結(jié)構(gòu)域可以是重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當理解，用于本發(fā)明的部分免疫球蛋白恒定區(qū)可以包括其突變體或類似物，或可以包括化學修飾的免疫球蛋白恒定區(qū)(例如，聚乙二醇化)或其片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用公知的分子生物學技術(shù)制備此類變體。生物學活性分子本發(fā)明涉及包括2條多肽鏈的抗體融合蛋白。第一條多肽鏈包括與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的生物學活性分子，并且第二條多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。生物學活性分子可以與免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基末端連接?？商娲?，生物學活性分子可以與免疫球蛋白恒定區(qū)的羧基末端連接。在一個實施方案中，第二條多肽鏈也可以包括生物學活性分子。
本發(fā)明考慮使用當施用于哺乳動物時能夠發(fā)揮生物學作用的任何生物學活性分子。生物學活性分子可以包括但不限于多肽、核酸、小分子。生物學活性分子的其他例子包括但不限于激素、抗病毒劑、止血劑、肽、蛋白質(zhì)、化療劑、維生素、輔因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反義核酸、三鏈體形成寡核苷酸和適體。細胞因子在一個實施方案中，生物學活性分子是細胞因子。細胞因子是支持細胞，包括淋巴細胞，生長和成熟的因子。細胞因子的例子包括但不限于白細胞介素-I(IL-I)、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18、淋巴因子抑制因子、巨噬細胞集落刺激因子、血小板衍生的生長因子、干細胞因子、腫瘤壞死因子、粒細胞集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。在一個特定實施方案中，生物學活性分子可以包括人干擾素，例如干擾素-β。干擾素-β結(jié)構(gòu)部分(moiety)可以是野生型成熟人干擾素_β蛋白質(zhì)，或與野生型成熟人干擾素-β至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%等同的序列。例如，生物學活性分子可以摻入具有一個或多個突變的人干擾素-β部分，例如以改善融合蛋白的蛋白質(zhì)折疊性質(zhì)、減少聚集、或改善蛋白質(zhì)表達。例如，抗體融合蛋白的干擾素部分可以包含在對應(yīng)于天然成熟干擾素-β的位置17、50、57、130、131、136和140中的1、2、3、4個或更多個位置上的改變。在這些位置上的氨基酸改變可以通過本領(lǐng)域已知的方法經(jīng)由氨基酸置換、氨基酸缺失或氨基酸修飾而實現(xiàn)。在這些殘基上引入的改變被認為減輕非共價聚集。在一個例子中，在位置17上的半胱氨酸由絲氨酸(C17S)、丙氨酸(C17A)、纈氨酸(C17V)或甲硫氨酸(C17M)置換。在某些實施方案中，在位置50上的苯丙氨酸由組氨酸(F50H)替換。 在某些實施方案中，在位置57上的亮氨酸由丙氨酸(L57A)替換，而在其他實施方案中，在位置130上的亮氨酸由丙氨酸(L130A)替換。在某些實施方案中，在位置131上的組氨酸由丙氨酸(Η131Α)替換，而在其他實施方案中，在位置136上的賴氨酸由丙氨酸(Κ136Α)替換。在某些實施方案中，在位置140上的組氨酸由丙氨酸(Η140Α)或蘇氨酸(Η140Τ)替換。 雖然已列舉了某些氨基酸置換，但本發(fā)明并不限于這些改變。在天然成熟干擾素的位置17、50、57、130、131、136和140上的原始氨基酸殘基，可以用能夠?qū)θ诤系鞍踪x予合適性質(zhì)的任何合適氨基酸置換。本發(fā)明還考慮抗體融合蛋白的干擾素部分具有如本文所公開的位置17、50、57、130、131、136和140上的改變中的1、2、3、4、5、6或7個的組合。生長因子在一個實施方案中，生物學活性分子是生長因子。生物學活性分子可以是能夠誘導(dǎo)細胞生長和增殖的任何試劑。生長因子的例子包括但不限于肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、角質(zhì)形成細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、腫瘤生長因子-α、表皮生長因子、 VEGF、胰島素生長因子和胰島素樣生長因子I和II。在一個特定實施方案中，生物學活性分子是能夠誘導(dǎo)紅細胞增殖的任何試劑。因此，本發(fā)明考慮的生物學活性分子的一個例子是人促紅細胞生成素。MM在一個實施方案中，生物學活性分子是激素。激素改變細胞生長、功能和代謝。激素的例子包括但不限于垂體激素，例如絨毛膜促性腺激素、二十四肽促皮質(zhì)素、促濾泡激素、促生長素、iorticotropin、普羅瑞林、促甲狀腺素、加壓素、賴氨酸加壓素；腎上腺激素例如倍氯美松雙丙酸酯、倍他米松、地塞米松、氟羥潑尼松龍(triamcinolone)；胰腺激素例如胰高血糖素、胰島素；甲狀旁腺激素例如dihydrochysterol ；甲狀腺激素例如降鈣素、 甲狀腺球蛋白、醋酸特立帕肽；類固醇激素例如糖皮質(zhì)激素、雌激素、孕酮、雄激素、四氫去氧皮質(zhì)酮；胃腸激素縮膽囊肽、腸高血糖素(enteroglycan)、甘丙肽、胃泌素、五肽胃泌素、四肽胃泌素、促胃動素、肽YY和胰泌素。在一個特定實施方案中，生物學活性分子是人生長激素。核酶在一個實施方案中，生物學活性分子是核酸例如DNA或RNA。例如，生物學活性分子可以是在RNA干擾中使用的核酸分子，例如反義RNA、小干擾RNA(siRNA)、雙鏈 RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)和小發(fā)夾RNA (shRNA)。核酸分子應(yīng)是長度約6-約60個核苷酸。例如，在某些實施方案中，核酸分子是長度約15-約50、約25-約45、或約30-約40個
核苷酸。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA或其混合物或衍生物或修飾形式。寡核苷酸可以是在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈上修飾的，例如以改善分子的穩(wěn)定性、雜交等。寡核苷酸可以包括其他附著基團，例如多肽(例如用于在體內(nèi)靶向宿主細胞受體)、 或促進跨細胞膜(參見例如 Letsinger 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :6553 ； Lemaitre 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :648 ；和 WO 88/09810)或血腦屏障(參見例如WO 89/10134)的轉(zhuǎn)運的試劑、雜交觸發(fā)的切割試劑(參見例如Krol等人(1988) BioTechniques 6 :958)或嵌入劑(參見例如 (1988) Pharrn. Res. 5 :539)。為此，寡核苷酸可以與另一分子綴合，例如多肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運試劑、或雜交觸發(fā)的切割試劑。小分子本發(fā)明還考慮任何治療性小分子或藥物作為生物學活性分子的用途。生物學活性分子可以是例如脂質(zhì)分子。生物學活性分子可以是糖分子。生物學活性分子可以是小有機分子或小無機分子。經(jīng)修飾的抗體融合蛋白的產(chǎn)生應(yīng)當理解本發(fā)明可以采用常規(guī)重組DNA方法，以生成在本發(fā)明實踐中有用的抗體融合蛋白?？贵w融合構(gòu)建體優(yōu)選在DNA水平生成，將所得到的DNAs整合到表達載體內(nèi)并表達以產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明提供編碼與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的生物學活性分子的核酸，其中所述部分免疫球蛋白恒定區(qū)包括Fcfoi結(jié)合位點中的突變。在一個實施方案中，突變是用丙氨酸替換在免疫球蛋白恒定區(qū)的位置435上的組氨酸(H435A)的密碼子置換。本發(fā)明還提供核酸組合物第一核酸編碼生物學活性分子和至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)；第二核酸編碼至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。核酸之一編碼具有影響Fcfoi結(jié)合的突變的免疫球蛋白恒定區(qū)。在一個實施方案中，突變是用丙氨酸替換在免疫球蛋白恒定區(qū)的位置435上的組氨酸(H435A)的密碼子置換。核酸還可以包括本領(lǐng)域已知的其它序列或元件(例如啟動子、 增強子、多聚A序列或親和標簽)。根據(jù)本發(fā)明的核酸和核酸組合物可以使用本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)容易地合成。例如，核酸可以通過標準方法合成，例如通過使用自動化DNA合成儀。對于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)，將核酸或核酸組合物插入合適的表達運載體內(nèi)，S卩，包含對插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體。如本文使用的，術(shù)語“載體”應(yīng)理解為意指任何有能力摻入宿主細胞內(nèi)并與宿主細胞基因組重組且整合到其內(nèi)或作為附加體自主復(fù)制的核酸，包括核苷酸序列。此類載體包括線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體的非限制性例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。有用的表汰載體是DdCs (Lo 等人(1988)Protein Engineering 11:495)，其轉(zhuǎn)錄利用人巨細胞病毒的增強子/啟動子和SV40多腺苷酸化信號。所使用的人巨細胞病毒的增強子和啟動子序列源自Boshart等人(19^)^^1141 :521中提供的序列的核苷酸-601至 +7。該載體還包含突變的二氫葉酸還原酶基因作為選擇標記(Simonsen和Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Scl USA 80 :2495)。適宜的分離的宿主細胞可以用本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，且用于靶蛋白的表達和/或分泌。用于本發(fā)明的示例性分離的宿主細胞包括永生化雜交瘤細胞、NS/0骨髓瘤細胞、293細胞、中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞和COS細胞。使用抗體融合蛋白的方法本發(fā)明還提供包括在Fcfoi結(jié)合位點中具有突變的抗體融合蛋白和藥學上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。術(shù)語“藥學上可接受的賦形劑”是本領(lǐng)域公知的，指在配制藥物產(chǎn)品中使用的藥學上可接受的材料、組合物或媒介物，例如脂質(zhì)或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑。在與主題組合物及其組分相容以及對于患者無害的意義上，每種賦形劑必須是“可接受的”。適宜藥學載體的實例由E. W. Martin在Remington ‘ s Pharmaceutical kiences中描述。賦形劑的實例可以包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；( 淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；C3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；(4)黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)；明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟； (9)油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水； (17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)在藥學制劑中采用的其他無毒相容性物質(zhì)。本發(fā)明的組合物可以通過與具體分子相容的任何途徑施用?？紤]本發(fā)明的組合物可以通過任何合適方式提供給哺乳動物，直接地(例如局部地，如通過注射、植入或局部施用于組織部位)或全身性地(例如腸胃外或經(jīng)口)。當組合物待腸胃外提供時，例如通過靜脈內(nèi)、皮下、眼、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)頰、直腸、陰道、眶內(nèi)、腦內(nèi)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、池內(nèi)、囊內(nèi)、鼻內(nèi)或通過氣霧劑施用時，組合物優(yōu)選包括部分水性或生理學相容液體的懸浮液或溶液。因此，載體或媒介物是生理學上可接受的，從而使得，除將所需組合物遞送給患者外，它不會不利地影響患者的電解質(zhì)和/或容積平衡。因此用于藥劑的液體介質(zhì)可以包括正常生理鹽水。本發(fā)明提供治療各種癌癥、病毒疾病、其他疾病、相關(guān)病癥及其原因的方法，所述方法通過給具有此類狀況的哺乳動物施用本發(fā)明的DNA、RNA或蛋白質(zhì)而進行。相關(guān)病癥可以包括但不限于炎癥病癥或自身免疫疾病，例如多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、紅斑狼瘡；各種惡性腫瘤，例如急性髓樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、何杰金氏病、基底細胞癌、宮頸發(fā)育不良和骨肉瘤；各種病毒感染，包括病毒性肝炎、帶狀皰疹和生殖器皰疹、乳頭瘤病毒、病毒性腦炎和巨細胞病毒肺炎；貧血；和出血性病癥。本發(fā)明的融合蛋白的最佳劑量將取決于待治療的疾病和副作用的存在。最佳劑量可以使用例行實驗進行測定。劑量/施用的范圍可以為0. lmg/m2-100mg/m2Umg/m2-20mg/ m2和2mg/m2-6mg/m2。融合蛋白的施用可以為定期大劑量注射，或自外部儲庫(例如自靜脈袋)或內(nèi)部儲庫(例如自生物可蝕性植入物)的連續(xù)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。此外，考慮本發(fā)明的融合蛋白還可以與多種不同的生物學活性分子聯(lián)合施用于預(yù)期的接受者?？梢韵氲剑诤系鞍缀推渌肿拥淖罴呀M合、施用方式，劑量可以通過完全在本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)的例行實驗進行確定。考慮本發(fā)明的抗體融合蛋白還可以與至少一種其他藥劑組合用于治療具有疾病或病癥的哺乳動物，其中所述其它藥劑為已知治療所述疾病或病癥的藥劑。實施例實施例1 用于表汰h(huán)uFcV4h-單-L-DI-IFN β的DNA序列的構(gòu)建huFCγ4h-單-L-DI-IFNβ (huFc γ 4鉸鏈突變體-接頭單體去免疫的干擾素-β ) 抗體融合蛋白是由人FcY4h鏈和人Fc-Y4h-接頭-DI-IFNii鏈組成的異源二聚體。通過共表達人Fc y 4h鏈和人Fc- y 4h-接頭-DI-IFN β鏈(其轉(zhuǎn)錄單位包含在1個單一質(zhì)?；?2個分開質(zhì)粒中)，在哺乳動物細胞中產(chǎn)生了該蛋白質(zhì)。編碼huFc γ 4h (huFc γ 4鉸鏈突變體)的DNA源自人IgG4基因組序列，并且隨后工程改造為包含經(jīng)修飾的Yl鉸鏈區(qū)，以便使半分子形成降到最低。關(guān)于不在鉸鏈區(qū)形成共價二硫鍵的IgG4半分子的形成，先前已有報道(Angal等人(1993)M01. Immunol. 30 :105)。編碼人免疫球蛋白-Y 4的Fc片段(Fe γ 4)的DNA序列的構(gòu)建編碼人IgG4的基因組序列得自從HeLa細胞中分離的細胞DNA。該序列與GenBank 中公開的IgG4序列-LO⑶S HUMIG⑶2(登記號K01316)是高度保守的，除了在CH3區(qū)中有3 個氨基酸殘基差異外。所公開的序列包含R409、E419、V422，而我們的序列包含K409、Q419、 1422。有趣的是，K409和Q419也在人IgGl、IgG2和IgG3中發(fā)現(xiàn)；1422在人IgG3中發(fā)現(xiàn)。 由來自其他IgG亞類的氨基酸置換組成的此類同種異型決定簇被稱為isoallotypes，并且人 IgG4 基因的 isoallotypes 先前已有報道(Brusco 等人(1998)Eur. J. ImmunoRenetics 25:349-355)。Fc γ 4片段的氨基酸序列顯示于SEQ ID Ν0:1中。SEQ ID NO 1 :huFc γ 4的肽序列(Y 4鉸鏈區(qū)有下劃線，并且Κ409、Q419、1422為粗體)ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNffYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS κ LTVDKSRWQ Q GN χ FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKFc Y 4鉸鏈區(qū)的修飾具有氨基酸序列〃 ESKYGPPCPSCP" (SEQ ID NO 7)的Y 4鉸鏈區(qū)由具有氨基酸序列〃 EH(SSDKTHTCPPCP〃 (SEQ ID NO:8)的經(jīng)修飾的 Y 1 鉸鏈區(qū)(Lo 等人(1998)Protein EnRineerinR 11 =495-500)替換，以使半分子的形成降到最低(美國專利號7，148，321)。為了修飾Fc γ 4的鉸鏈區(qū)，包含天然Y 4鉸鏈外顯子(粗體)的Aflll-MuI 片段 5 ‘ CTTAAGC AGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAG (SEQ ID N0:9)由包含具有Cys至Ser置換(下戈丨」 線)的經(jīng)修飾Yl鉸鏈外顯子(粗體)的相應(yīng)Aflll-StuI片段 5 ‘ -CTTAAGC AGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCA CCGTGCCCAG (SEQ ID NO :10)替換，所述Cys至Ser置換消除正常與輕鏈配對的 Cys殘基。因為在Yl和Y 4外顯子中的MuI位點是C甲基化的，并且MuI限制性核酸內(nèi)切酶是甲基化敏感的，所以在可以用MuI酶消化前，2種質(zhì)粒均必須從DNA胞嘧啶甲基化酶(DCM)陰性細菌菌株中分離。具有經(jīng)修飾的Yl鉸鏈區(qū)的所得到的Fc γ 4被命名為 Fc y 4h ( y 4h γ -4鉸鏈突變體)。IFN-β β的克隆和去免疫成熟IFN- β的編碼序列由人胎盤DNA PCR擴增(Sigma, Poole, UK)?？寺〉腜CR 產(chǎn)物進行測序，以鑒定IFN-β克隆，其氨基酸序列與GenBank中所公開的野生型IFN-β序列-LOCUS ΧΜ_005410 完全匹配。去免疫的IFN-β (DI-IFNP)包含去除潛在T輔助細胞表位的3個氨基酸置換仏57々、!113認、!1140幻、和使共價聚集最小化的1個氨基酸置換(C17S)。將編碼DI-IFNβ的 DNA克隆到已修飾過的哺乳動物表達載體DdCs-huFc (Lo等人(1998) Protein Engineering 11 :495-500)內(nèi)，使IFN-β序列經(jīng)由具有氨基酸序列(^4SG4SG3SG的15個氨基酸柔性接頭與人Fcy 4h的C末端融合。接頭-DI-IFN^命名為L-DI-IFN^，其序列顯示于SEQ ID NO: 2 (接頭有下劃線，C17S、L57A、H131A和H140A為粗體)。SEQ ID NO 2 =L-DI-IFNg 的肽序列GGGGSGGGGSGGGSGMSYNLLGFLQRSSNFQ s QKLLffQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE DAA A TIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRI L χ YLKAKEYS A CAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN基因組前導(dǎo)區(qū)適應(yīng)性改變?yōu)樾盘栯挠糜诜置趤碜孕∈竺庖咔虻鞍纵p鏈基因的基因組信號肽序列038-bp)用于huFcY4h和 huFcy4h-L-DI-IFN^鏈的分泌。編碼信號肽的_2氨基酸殘基(_1氨基酸是信號肽的C 末端殘基)的基因序列經(jīng)誘變，由絲氨酸殘基變成亮氨酸殘基(AGC至TTA)，從而使得編碼信號肽末尾的DNA是CTTAAGC，其中CTTAAG是生成的AflII位點(Lo等人(1998) Protein Engineeringl 1 :495-500)。此外，引入Kozak共有序列CCACC ATG G用于最佳的核糖體結(jié)合以便在ATG的翻譯起始(Kozak等人(1986)Cell44 =283-292)。這通過將起始密碼子后的第一個氨基酸殘基從AAG突變成GAG以給出序列TCTAGACCACC ATG GAG (SEQ ID NO 11) 來達到，其中Kozak共有序列有下劃線，TCTAGA是)(baI位點。由此，信號肽包含在起始密碼子后的第一個氨基酸殘基上的置換、和在-2位置上的氨基酸殘基上的另一個置換。因為信號肽在細胞內(nèi)被信號肽酶切割而不出現(xiàn)在分泌的蛋白質(zhì)中，所以這些突變不影響FcY4h 和Fc y 4h-L-DI-IFN^產(chǎn)物的氨基酸組成。huFc γ 4h 禾口 huFc y 4h-L_DI_IFN β 鏈的月太和 DNA 序列對完整huFc Y4h和huFc Y4h-L-DI_IFN0鏈的編碼區(qū)進行了完全測序。huFc γ 4h 和 huFc Y4h-L-DI-IFN0 鏈的肽和 DNA 序列顯示在 SEQ ID NO :3 至 SEQ ID NO :6。為了促進編碼huFc y 4h和L-DI-IFN^的DNA片段的連接，通過使用在人IgG4(GenP印t中LOCUS CAC20457)中以及在 IgGl 和 IgG2 中存在的 PGK 序列(Lo 等人(1998) Protein EnRineering
1811 :495-500)，產(chǎn)生SmaI位點；此外，在CH3的C末端殘基上引入賴氨酸至丙氨酸置換，以使在連接處的潛在切割降到最低。重要的是，在CH3-L-DI-IFNi3連接處所得到的序列不產(chǎn)生任何潛在的T細胞表位。SEQ ID NO 3 :huFc y 4h的肽序列(信號肽有下劃線)MELPVRLLVLMFffIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 4 從翻譯起始密碼子到翻譯終止密碼子的huFc y 4h鏈的DNA序列 (編碼序列為大寫字母，非編碼序列為小寫字母)ATGGAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGgtgaggagagagggaagtgaggg aggagaatggacagggagcaggagcactgaatcccattgctcattccatgtattctggcatgggtgagaagatgggt cttatcctccagcatggggcctctggggtgaatacttgttagagggaggttccagatgggaacatgtgctataatga agattatgaaatggatgcctgggatggtctaagtaatgcctagaagtgactagacacttgcaattcactttttttgg taagaagagatttttaggctataaaaaaatgttatgtaaaaataaacatcacagttgaaataaaaaaaaatataagg atgttcatgaattttgtgtataactatgtatttctctctcattgtttcagCTTCCTTAAGCGAGCCCAAATCTTCTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGgtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgc cctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacgcatccacctccatctcttcctGagCACCTG AGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGgtgggacccacggggtgcgagggccacatggacagaggtcagctcggcccaccctctgccc tgggagtgaccgctgtgccaacctctgtccctacagGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCC TCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGASEQ ID NO 5 :huFc y 4h_L-DI_IFN β的肽序列(信號肽和CH3末端的K至A置換有下劃線；L-DI-IFN β為粗體)MELPVRLLVLMFffIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNIFSCSVMHEALHNHYTgKSLSLSPGAeGGGSC^GSGSGSGMSBSIitGFLtlSEQ ID NO 6 從翻譯起始密碼子到翻譯終止密碼子的huFcy4h-L-DI-IFN^鏈的DNA序列(編碼序列大寫字母，非編碼序列小寫字母)ATGGAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGgtgaggagagagggaagtgagggaggagaatggacagggagcaggagcactgaatcccattgctcattccatgtattctggcatgggtgagaagatgggt cttatcctccagcatggggcctctggggtgaatacttgttagagggaggttccagatgggaacatgtgctataatga agattatgaaatggatgcctgggatggtctaagtaatgcctagaagtgactagacacttgcaattcactttttttgg taagaagagatttttaggctataaaaaaatgttatgtaaaaataaacatcacagttgaaataaaaaaaaatataagg atgttcatgaattttgtgtataactatgtatttctctctcattgtttcagCTTCCTTAAGCGAGCCCAAATCTTCTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGgtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgc cctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacgcatccacctccatctcttcctcagCACCTG AGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGT GCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGgtgggacccacggggtgcgagggccacatggacagaggtcagctcggcccaccctctgcc ctgggagtgaccgctgtgccaacctctgtccctacagGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC CCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTGCAGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGAT CCGGCGGGGGCTCGGGTATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGAGTCAGAAGCTC CTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATATTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCA GCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCAGCCACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGAC AAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAACCAT CTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAA AAGATATTATGGGAGGATTCTGGCCTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTGCCTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGG AAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAACTGA實施例2 構(gòu)建用于表達在Y 4中包含H435A置換的huFcv4h_單-L-DI-IFNg變體的DNA序列構(gòu)建了用于表達在Y4中包含Η435Α置換(Kabat編號)的 huFcv4h-單-L-DI-IFN^變體的DNA序列。這包括編碼異源二聚體huFc γ 4h(H435A)/ huFc y 4h-L-DI-IFN β、huFc γ 4h/huFc γ 4h (Η435Α) -L-DI-IFN β 禾口 huFc γ 4h (Η435Α) / huFc γ 4h (Η435Α) -L-DI-IFN β的DNA序列。通過用誘變引物進行重疊PCR(Daugherty等人 (1991)Nucleic Acids Res. 19 :2471-2476)，在裸 huFc γ 4h 鏈或 huFc γ 4h-L_DI_IFNβ 融合蛋白鏈中引入編碼Η435Α置換的從CAC密碼子到GCG的突變，其中使用正向引物5' -G GCTCTGCACAACGCGTACACGCAGAAGAG (SEQ ID NO 12)，其中 _ 編碼丙氨酸置換,和反向引物 5 ‘ -CTCTTCTGCGTGTACGCGTTGTGCAGAGCC (SEQ ID NO 13)，其中是丙氨酸置換的反密碼子。實施例3 融合蛋白的表達通過共表達人Fcy 4h鏈和人Fc-Y 4h_接頭-DI-IFN^鏈，在哺乳動物細胞中產(chǎn)生了 11砂(^411-單-1^-01-0^^異源二聚體，其中所述鏈的轉(zhuǎn)錄單位包含在1個單一質(zhì)?；?個分開質(zhì)粒中。對于蛋白質(zhì)表達的快速分析，使用lipofectamineanvitrogen，Carlsbad, CA)通過瞬時轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒 pdCs_Fc γ 4h 和 pdCs_Fc Fc γ 4h_ 接頭-DI-IFN β 或變體引入人腎細胞內(nèi)(GenHunter Corporation，Nashville，TN)。小鼠骨髓瘤NS/0和中國倉鼠卵巢細胞用于獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，其表達 huFCγ4h-單-L-DI-IFNβ異源二聚體。為高水平表達，通過電穿孔將包含人Fc γ 4h鏈和人Fcy 4h-接頭-DI-IFN β鏈轉(zhuǎn)錄單位的質(zhì)粒pdCs引入小鼠骨髓瘤NS/0細胞內(nèi)。NS/0 細胞在補充有10%熱滅活胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的達爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基中生長。約切106細胞用PBS洗滌1次，并且重懸浮于0.5ml PBS中。隨后使 10 μ g線性化質(zhì)粒DNA與細胞在Gene Pulser Cuvette (0. 4cm電極間距，BioRad)中在冰上孵育 10 分鐘。使用設(shè)為 0. 25V 和 500 μ F 的 Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA)執(zhí)行電穿孔。允許細胞在冰上恢復(fù)10分鐘，這之后重懸浮于生長培養(yǎng)基中，并且在2塊96孔板上鋪平板。通過在IOOnM氨甲蝶呤(MTX)的存在(在轉(zhuǎn)染后2天加入生長培養(yǎng)基中)下的生長，選擇了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。細胞每3天飼喂，進行再2-3次飼喂，MTX抗性克隆在2-3周內(nèi)出現(xiàn)。通過抗Fc ELISA測定來自克隆的上清液，以鑒定高生產(chǎn)者。分離高生產(chǎn)克隆，并且在包含IOOnM MTX的生長培養(yǎng)基中增殖。典型使用的生長培養(yǎng)基是H-SFM或⑶培養(yǎng)基 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。對于通過凝膠電泳的常規(guī)表征，在ftOtein A Sepharose珠(R印ligen， Cambridge, ΜΑ)上捕獲分泌到培養(yǎng)基內(nèi)的huFc_IFNi3融合蛋白，并且隨后通過在加有或未加有還原劑例如巰基乙醇的蛋白質(zhì)樣品緩沖液中煮沸樣品而進行洗脫。通過 SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析樣品，并且通過考馬斯染色顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。圖8顯示通過人Fcy 4h鏈和人Fcy 4h-接頭-DI-IFN β在四31~細胞中的瞬時共表達而產(chǎn)生的huFc y 4h-單-L-DI-IFN β。在還原條件下SDS-PAGE分析的泳道2 (左泳道)顯示，F(xiàn)cy 4h鏈和Fcy 4h-接頭-DI-IFNii鏈均表達，并且裸Fc以比融合蛋白更高的水平表達。當這2條鏈以這些水平共表達時，預(yù)期非還原性凝膠應(yīng)根據(jù)二項式a2+2ab+b2顯示裸Fc同源二聚體Fc/Fc-IFNi3異源二聚體Fc_IFNi3同源二聚體的比，其中a和b分別是還原性凝膠上可見的裸Fc鏈和融合蛋白鏈的相對表達水平。令人驚訝的是，在非還原條件下的SDS-PAGE分析(中泳道)顯示產(chǎn)生了極少的Fc-IFNii同源二聚體(〃 (Fc-X)2")， 與由Fc和Fc-IL-2的共表達(也在非還原條件下分析)獲得的更正常模式(右泳道)(根據(jù)a2+2ab+b2的比率)形成鮮明對比。共表達Fc y 4h鏈和Fc y 4h_接頭-DI-IFN β鏈的穩(wěn)定克隆類似地缺乏!^c-IFNii同源二聚體(圖9)，提示Fc-IFNii同源二聚體在細胞中的產(chǎn)生是不利的，這可能的原因是蛋白質(zhì)折疊，因為IFNii自身趨于聚集。實施例4 :huFc γ 4h~ 單-L-DI-IFNg g 的純化基于Fc蛋白質(zhì)部分對于蛋白A的親和力，執(zhí)行含F(xiàn)c融合蛋白的純化。簡言之， 將包含融合蛋白的細胞上清液裝載到預(yù)平衡的I^rotein Akpharose柱上，并且在相同緩沖液(在中性PH下150mM磷酸鈉、IOOmMNaCl)中徹底洗滌柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)在低pH(pH 2.5-3)在相同緩沖液中洗脫，并且立即中和洗脫物級分?；贗FNii蛋白質(zhì)對于Cikicron Blue3GA(Blue Sepharose Fast Flow 柱；Pharmacia)的親禾口力，huFc γ 4h_ 單一L—DI—IFN β 異源二聚體可以與FcY4h同源二聚體容易地分離。包含所表達的融合蛋白的培養(yǎng)上清液調(diào)整至IM NaCl，并且裝載到用緩沖液A (緩沖液A :20mM磷酸鈉(pH 7. 2) IM NaCl)預(yù)平衡的Blue Sepharose FastFlow柱上。用10柱體積的緩沖液A，隨后用15柱體積的緩沖液
21A:緩沖液B(緩沖液B:20mM磷酸鈉(pH 7. 2),50% (ν/ν)乙二醇)的1 1混合物，洗滌柱。異源二聚體在100%緩沖液B中洗脫，將Iml級分收集到包含0. 5ml緩沖液A的管內(nèi)。 通過尺寸排阻色譜(SEC)分析純化的huFc γ 4h-單-L-DI-IFN β，并且通過用抗IFN β抗體探測蛋白質(zhì)印跡，進一步證實。^MM 5 句,含消除FcRn結(jié)合的單置換的免,瘡球蛋白_和huFc-單-配體奪體的表汰衍生自Fc-SEED (參見 W02007/110205)的 huFc-單-L-DI-IFN^ 變體以 huFc-AG2(H435A)/huFc-GA2-L-DI-IFN0的形式產(chǎn)生。產(chǎn)生的另外變體包括IgG亞類和配體變體，例如 huFc y 1 (H435A) /huFc y 1-IL2 和去免疫的 KS- y 1 (Η435Α) /KS- y 1-IL2，稱為免疫細胞因子的一種全IgG融合蛋白(Davis等人Q003) Cancer Immunol. Immunother. 52 297-308)。除 H435 夕卜，H310 也被報道參與 FcRn 結(jié)合(Kim 等人(1999)Eur. T. Immunol. 29 2819-2825)。因此，包含H310A置換的另一個huFc y 4h-單-L-DI-IFN β變體以 huFc y 4h (H310A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 異源二聚體的形式產(chǎn)生。t施例6.在某干細朐的牛物測I^H式駘中huFc-IFNg蛋白質(zhì)的活件在抗病毒測定試驗中測定Fc-IFNii融合蛋白的活性。病毒復(fù)制對于細胞通常是毒性的，導(dǎo)致細胞裂解，一種稱為致細胞病變效應(yīng)(CPE)的效應(yīng)。干擾素作用于抑制病毒增殖的途徑，保護細胞不發(fā)生CPE。IFN^的抗病毒活性可以通過測量CPE被減少的程度 (CPER)來測定，參見如 M. J. Clemens, A. G. Morris 和 A. J. H. Gearin, I. R. L. Press, Oxford, 1987 IS車t的"Lymphokines and Interferons :APractical Approach “中的ffii$。貞_入上皮肺癌細胞系A(chǔ)549(ATCC#CCL-185)作為腦心肌炎病毒(EMCV ;ATCC#VR 129B)的宿主， 比較純化的Fc y 4h-單-L-DI-IFN β和包含Η435Α置換的Fc y 4h-單-L-DI-IFN β變體與 Rebif的抗病毒活性。有效劑量(ED50)設(shè)為導(dǎo)致50% CPER(即50%細胞受保護)的蛋白質(zhì)的量，相對于未感染的對照細胞來測定。在摩爾基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)Fcy 4h-單-L-DI-IFN β和 Fc y 4h-單-L-DI-IFN^變體在此CPE測定試驗中均與Rebif至少一樣有力(圖10)。實施例7. huFc-IFNg蛋白質(zhì)的藥代動力學在Balb/c小鼠(n = 3)中測定huFc_IFNi3異源二聚體融合蛋白和變體的藥代動力學(PK)。對于靜脈內(nèi)施用，將25yg異源二聚體融合蛋白注射到每只小鼠的尾靜脈內(nèi)。通過眶后采血，在注射后立即(t = 0分鐘)以及在注射后30分鐘、1小時、2小時、4 小時、8小時、24小時、48小時、72小時和96小時，將血液收集到肝素包被的管內(nèi)。對于皮下施用，每只小鼠注射50yg異源二聚體融合蛋白。。通過眶后采血，在注射后1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、72小時和96小時，將血液收集到肝素包被的管內(nèi)。通過離心(以12，500g，4分鐘)去除細胞，并且通過抗huFc ELISA和抗huFc-IFN β ELISA， 測定血漿中的融合蛋白濃度，其中，抗huFc ELISA包括抗-(H&L) (AffiniPure山羊抗人 IgG (H+L) ,Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)捕獲禾口抗 Fc (HRP-綴合的(Fab' )2 二聚體山羊抗人 IgG Fe, Jackson Immuno ResearchLaboratories, West Grove,PA)檢測，抗huFc-IFNβ ELISA包括抗(H&L)捕獲和抗huIFN0 (生物素化的山羊抗 A IFN^ ,R&D Systems,Minneapolis,MN)檢測。此外，通過用抗 huFc 抗體或抗 huIFNβ 抗體探測Hi血清樣品的免疫印跡，證實了循環(huán)融合蛋白的完整性。
圖11和12比較了靜脈內(nèi)施用的huFc γ 4h-單-L-DI-IFN β和包含Η435Α置換的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β 變體(以 huFc4h (H435A) /huFc y 4h-L_DI_IFN β 異源二聚體的形式)的藥代動力學曲線(分別通過抗huFc ELISA和抗huFc-IFNi3 ELISA測定)。 huFc y 4h-單-L-DI-IFNii具有48小時的循環(huán)半衰期，比以分鐘計的IFNi^的循環(huán)半衰期長很多倍。令人驚訝的是，包含H435A置換的huFc y 4h_單-L_DI_IFNi3變體具有46小時的循環(huán)半衰期，這基本上等同于在實驗誤差內(nèi)的huFc γ 4h-單-L-DI-IFNii的循環(huán)半衰期。此外，H435A變體的AUC(曲線下面積)為野生型的AUC的約三分之二，這是IFNβ的幾百倍?？筯uFc-IFN β ELISA特異性檢測融合蛋白，而不檢查不含N末端Fc或C末端IFN β 部分的任何斷裂片段。此外，使用抗huFc抗體或抗huIFNii抗體作為探針在還原條件下對靜脈內(nèi)Hi樣品的蛋白質(zhì)印跡分析證實，融合蛋白在體內(nèi)保持完整(圖17)。在圖17的左上部分中，上箭頭指示huFcY4h-L-DI-IFNi3多肽鏈，并且下箭頭指示huFc γ 4h鏈。類似地，在圖17的左下部分中，上箭頭指示huFCY4h-L-DI-IFNi3多肽鏈，并且下箭頭指示 huFc y 4h (H435A)鏈。圖16和13比較皮下施用的相同2種分子的藥代動力學曲線。 huFc y 4h-單-L-DI-IFN^ 和包含 H4!35A 置換的 huFc y 4h-單-L_DI_IFN0 變體具有相似的循環(huán)半衰期，這比IFNi3的長很多倍。令人驚訝的是，包含H435A置換的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β變體具有46小時的循環(huán)半衰期，這基本上等同于在實驗誤差內(nèi)的huFcγ4h-單-L-DI-IFNβ的。Η435Α變體還具有野生型的AUC (曲線下面積)之約三分之二的AUC，這是IFN0的幾百倍?？筯u Fc ELISA和抗hu IFN0 ELISA檢測融合蛋白分子的2個末端。此外，使用抗huFc抗體或抗hu IFNii抗體作為探針在還原條件下蛋白質(zhì)印跡分析皮下I3K樣品，證實了融合蛋白在體內(nèi)保持完整(圖15)。在圖15的左上小圖中，上箭頭指示huFc y 4h-L-DI-IFNi3多肽鏈，并且下箭頭指示huFc y 4h鏈。類似地，在圖15的左下小圖中，上箭頭指示huFc y 4h-L-DI-IFN β多肽鏈，并且下箭頭指示huFc y 4h (H435A) 鏈。實施例8.包含消除FcRn結(jié)合的單置換的免疫球蛋白_和huFc-單-配體變體的減少免疫原性為了證實僅一條多肽鏈包含消除Fcfoi結(jié)合的單置換的免疫球蛋白-或 huFc-單-配體變體具有減少的免疫原性，用huFc y 4h-單-L-DI-IFN^或包含H435A突變的huFCγ4h-單-L-DI-IFNβ變體免疫接種小鼠。在免疫接種后的合適時間比較抗體滴度。用33 μ g/ 小鼠的 huFc γ 4h-單-L-DI-IFN^ 或包含 H4!35A 突變的 huFc y 4h-單-L-DI-IFNii變體，分別皮下注射2組雌性、8周齡Balb/C小鼠(5只小鼠 /組)。在第15天時，小鼠接受33 μ g/小鼠的huFc γ 4h-單-L-DI-IFN β或包含Η435Α 突變的11砂(^411-單-1^-01-0^^變體的皮下加強注射。通過ELISA在第沈天時測定小鼠抗體滴度。這包括通過在PBS中在4°C孵育過夜，用Iyg山羊抗小鼠IgG(H+L) (JacksonImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA,目錄 #115-005-062)包被 96 孑L 板的孔，隨后用PBS 0. 05% Tween洗滌4次。接下來，用乳封閉山羊抗小鼠IgG(H+L) 包被的板，用PBS 0. 05% Tween洗滌4次，干燥且貯存于_20°C。對于捕獲小鼠抗體，血清在PBS 0.05% Tween中最初稀釋1 1000，隨后1 2系列稀釋，在37°C加入山羊抗小鼠IgG(H+L)包被的孔中1小時。隨后用PBS 0.05% Tween洗滌孔4次。通過加入免疫原， 0. 5 μ g/ml 的 huFc y 4h_ 單-L-DI-IFN^ 或包含 H435A 突變的 huFc y 4h_ 單-L-DI-IFN^ 變體，禾口 F(ab)2 山羊抗 hu-IgG-Fc-HRP(JacksonImmunoResearch Laboratories,目錄 #109-036-098)在PBS 0. 05% Tween中的1 20，000稀釋物，檢測捕獲的抗體。板在室溫孵育1小時，隨后用PBS 0.05% Tween洗滌4次。使用100 μ 113' ,3' ,5' ,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，檢測信號，在15分鐘后用100μ 12Ν H2SO4終止反應(yīng)。圖15比較用huFcY4h-單-L_DI_IFN3或包含H435A突變的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β變體免疫接種的小鼠的抗體滴度。接受包含Η435Α突變的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β變體(菱形)的小鼠具有比huFc y 4h-單-L-DI-IFN β (圓圈)免疫接種的小鼠更低的滴度，說明變體具有減少的免疫原性。使用配對t檢驗，通過 Sigma-Plot分析該組間比較。在2個組之間的差異是統(tǒng)計學顯著的(正態(tài)性檢驗p = 0. 288，t = 5. 422，自由度為 7 (ρ = < 0. 001))。^MM 9.誦i寸體外T細胞JlIiH式駘來測丨定免,瘡原十牛為了顯示包含H435A突變的huFc-單-配體變體比野生型對應(yīng)物具有更少免疫原性，使用人T細胞增殖測定試驗，包括單核細胞衍生的樹突狀細胞(DC)的培養(yǎng)和成熟，抗原在DC上的裝載和呈遞，和在CD4+T細胞中抗原誘導(dǎo)的應(yīng)答的測定。來自健康供體的人外周血單核細胞(PBMC)充當DC和自體T細胞的來源。典型地，通過 Ficoll-Hypaque梯度從Ieukopack樣品中分離PBMC，并且使用MACS CD14分離試劑盒 (Miltenyi Biotec he. Auburn，CA)純化單核細胞，用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)5天。用不同抗原，例如 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β、包含 Η4!35Α 突變的 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β 變體、以及破傷風類毒素，裝載未成熟的DC。因為IFNi3具有非常有力的免疫抑制作用，所以 huFc y 4h-單-L-DI-IFN β和huFc y 4h_單-L-DI-IFN β變體必須在適度高溫進行熱處理， 以便較為熱敏感的IFNii部分被滅活，同時較為熱穩(wěn)定的Fc以其天然形式保留。用于此選擇性滅活的有用溫度范圍是56°C-65°C。可替代地，包含失活I(lǐng)FNi3部分的融合蛋白可以通過氨基酸置換而重組生產(chǎn)。在DC與抗原孵育M小時后，用TNF-α、IL-1 β、IL-6和PGE2刺激DC 24小時，以誘導(dǎo)DC成熟。使用MACS CD4分離試劑盒(Miltenyi Biotec Inc. Auburn,CA)由相同人PBMC 制備的自體CD4+T細胞，使用CellTrace CFSE增殖試劑盒Gnvitrogen)，用羧基熒光素二乙酸酯和琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記。DC和T細胞隨后共培養(yǎng)6-7天，這之后在FACS上測定分裂T細胞的百分率。與相應(yīng)野生型Fc融合蛋白相比，被來自11砂(^411-單-1^-01-0^3 變體的DC呈遞肽刺激的自體T細胞增殖預(yù)期將較低。
權(quán)利要求
1.包括第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域的抗體融合蛋白，其中每個結(jié)構(gòu)域均包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，其中所述第一或第二重鏈結(jié)構(gòu)域中至少一個與生物學活性分子融合，并且所述第一或第二重鏈結(jié)構(gòu)域中僅一個包括在恒定區(qū)內(nèi)的氨基酸序列突變，其中所述突變導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的部分或完全喪失。
2.權(quán)利要求1的抗體融合蛋白，其中所述突變是在位置386、388、400、415、433、435、 436,439和447中的一個或多個上的氨基酸殘基的置換。
3.權(quán)利要求2的抗體融合蛋白，其中所述突變是至少H435的置換。
4.權(quán)利要求2的抗體融合蛋白，其中所述突變是H435A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的抗體融合蛋白，其中生物學活性分子與免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基末端連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的抗體融合蛋白，其中生物學活性分子與免疫球蛋白恒定區(qū)的羧基末端連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的抗體融合蛋白，其中第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域均包括生物學活性分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的抗體融合蛋白，其中第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域是包括鉸鏈區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，且構(gòu)成Fc片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的抗體融合蛋白，其中第一和/或第二重鏈結(jié)構(gòu)域包括抗體可變結(jié)構(gòu)域，從而形成完全抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的抗體融合蛋白，其中所述免疫球蛋白是IgG。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體融合蛋白，其中所述IgG是IgGl、IgG2或IgG4。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的異源二聚體抗體融合蛋白，其中(i)第一和第二重鏈結(jié)構(gòu)域是包括鉸鏈區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成Fc片段；( )第一重鏈結(jié)構(gòu)域經(jīng)由其C末端與生物學活性分子融合；和(iii)第二重鏈結(jié)構(gòu)域不與生物學活性分子融合。
13.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，其中導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的喪失或減少的所述突變位于不與生物學活性分子融合的重鏈結(jié)構(gòu)域中。
14.權(quán)利要求12的抗體融合蛋白，其中導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的喪失或減少的所述突變位于與生物學活性分子融合的重鏈結(jié)構(gòu)域中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項的抗體融合蛋白，其中生物學活性分子選自細胞因子、生長因子、生長激素和治療上有效的多肽。
16.權(quán)利要求15的抗體融合蛋白，其中生物學活性分子是人干擾素或人促紅細胞生成ο
17.權(quán)利要求16的抗體融合蛋白，其中人干擾素是干擾素-β(IFN^)0
18.權(quán)利要求15的抗體融合蛋白，其中人IFNi3的氨基酸序列是改變的。
19.權(quán)利要求18的抗體融合蛋白，其中所述IFNii序列包括在相應(yīng)于于天然成熟人 IFNβ的位置17、50、57、130、131、136和140中的一個或多個上的氨基酸置換。
20.權(quán)利要求19的抗體融合蛋白，其中所述氨基酸置換選自C17S、C17A、C17V、C17M、 F50H、L57A、L130A、Η131Α、Κ136Α、Η140Α 和 Η140Τ。
21.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-20中任一項的抗體融合物。
22.一種適用于制備權(quán)利要求1-20中任一項的抗體融合蛋白的核酸組合物，其包括 (i)編碼第一重鏈結(jié)構(gòu)域的核酸，所述第一重鏈結(jié)構(gòu)域包括與至少部分IgG恒定區(qū)融合的生物學活性分子，和( )編碼第二重鏈結(jié)構(gòu)域的核酸，所述第二重鏈結(jié)構(gòu)域包括不與生物學活性分子融合的至少部分IgG恒定區(qū)，其中所述IgG恒定區(qū)或其部分中僅一個包括導(dǎo)致Fcfoi結(jié)合的部分或完全喪失的突變。
23.一種可復(fù)制的表達載體，其包括權(quán)利要求21的核酸。
24.一種分離的宿主細胞，其包含權(quán)利要求23的表達載體，或包括權(quán)利要求22(i)的核酸的第一表達載體和包括權(quán)利要求22 (ii)的核酸的第二表達載體。
25.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-20中任一項的抗體融合蛋白和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
26.權(quán)利要求1-20中任一項的抗體融合蛋白或權(quán)利要求25的藥物組合物用于治療癌癥、病毒感染、貧血或多發(fā)性硬化。
全文摘要
本發(fā)明公開具有經(jīng)修飾的FcRn結(jié)合位點的抗體融合蛋白和編碼其的核酸分子。抗體融合蛋白包括2條多肽鏈，其中第一條多肽鏈包括與至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)連接的生物學、優(yōu)選治療上活性的分子。第二條多肽鏈包括至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)。多肽鏈之一包括在恒定區(qū)中的突變，所述突變導(dǎo)致FcRn結(jié)合的減少或喪失，但不引起所述抗體融合蛋白的血清半衰期的實質(zhì)上減少。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及相應(yīng)地構(gòu)建的Fc-IFNβ分子。本發(fā)明還公開產(chǎn)生融合蛋白的方法和通過施用融合蛋白減輕疾病和病癥以使用融合蛋白用于治療的方法。
文檔編號C07K16/00GK102405230SQ201080017392
公開日2012年4月4日 申請日期2010年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者K-M·勞, P·A·斯泰因 申請人:默克專利有限公司