一個(gè)"通孔（via.)"具有一個(gè)半徑。注射成型部分的內(nèi)部通道表面也是更光滑的。通 道的流動(dòng)特征是重要的，因?yàn)樗鼘?duì)于微流態(tài)具有極大的表面效應(yīng)。表面張力和粘度構(gòu)成了 表面粗糖度效果。通道的最狹窄尺寸對(duì)于流動(dòng)的影響最大。結(jié)果是，在基于矩形或圓形的橫 截面形狀的通道中的流動(dòng)由對(duì)角線寬度或直徑控制，典型地是改變?cè)O(shè)計(jì)W利用運(yùn)些行為。 對(duì)于200微米W下的直徑來說，流動(dòng)方向上錐度的減小導(dǎo)致毛細(xì)作用。相反，通道擴(kuò)大形成 球狀可能使流動(dòng)停止，除非施加壓力。通道中的通孔可W設(shè)計(jì)為促進(jìn)定向流動(dòng)，一種固態(tài)止 回閥。
[0066] 如本文所使用的，術(shù)語"下游"是指，在使用時(shí)，樣品順序通過裝置的不同部分。而 術(shù)語"下游"包括在其范圍內(nèi)裝置的兩部分直接流體連通的，它還包括在其范圍內(nèi)，當(dāng)兩部 分由例如閥或裝置的另一個(gè)部分分隔開的情況。術(shù)語"集成"是指裝置的兩個(gè)不同部分組合 成一個(gè)單元，W使得，例如，裝置的同一個(gè)部分可W用于過濾樣品并且作為裂解單元。當(dāng)術(shù) 語"集成"被應(yīng)用于與核酸擴(kuò)增單元組合在一起的本發(fā)明的第一和第二方面的裝置時(shí)，它是 指系統(tǒng)的兩部分彼此相連，W使得在使用時(shí)，它們彼此是流體連通的。在另一個(gè)方面，術(shù)語 "集成"是指裝置的不同部分優(yōu)選在共同的基質(zhì)上形成。術(shù)語"連接"當(dāng)應(yīng)用于裝置的兩個(gè) 部分時(shí)，是指運(yùn)兩個(gè)部分彼此是直接流體連通的（例如通過直接連接在一起或者通過通道 連接在一起），或者可W是彼此被例如閥或裝置的另一部分分隔開的。優(yōu)選地，術(shù)語"與…… 相連"是指裝置的兩個(gè)部分彼此直接連接。
[0067] 微流體累：包括例如，燈泡累、隔膜累、模式累、或氣泡累，其是要推動(dòng)液體的移 動(dòng)，其中累的底部結(jié)構(gòu)具有小于1毫米的厚度或其它尺寸。運(yùn)些累包括Weigl的美國(guó)專利 No. 6, 743, 399中和Saltsman的U.S. 2005/0106066中描述的機(jī)械驅(qū)動(dòng)的循環(huán)累，其通常是 轉(zhuǎn)讓給申請(qǐng)人并通過引用將其全文合并入本文。運(yùn)些累可W是機(jī)器操作的或是人工操作 的。還提供了電滲驅(qū)動(dòng)累。運(yùn)些累可用于代替外部驅(qū)動(dòng)，W在基于微流體裝置的測(cè)定中推 動(dòng)溶解的試劑和樣品的流動(dòng)。
[0068] 隔膜累（"指"）累：是形成為空腔的裝置，其形狀通常是圓柱形的，其冠狀部分被 彈性隔膜分成兩部分，形成第一和第二半室，它們之間不是可流動(dòng)連接的。隔膜由與第一半 室相連的氣動(dòng)脈沖發(fā)生器控制。隔膜上的正壓使其膨脹，使第二半室的內(nèi)容物移動(dòng)，負(fù)表壓 (吸力）使其收縮，使第二半室擴(kuò)張并吸入液體。通過半室，應(yīng)當(dāng)理解，隔膜的有效面積是在 正壓條件下的體積位移和在吸入壓力下的體積位移之中較小的那個(gè)，因此，當(dāng)在隔膜上方 和下方的第一和第二半室基本是對(duì)稱的或者體積相等時(shí)，是最優(yōu)的。第二半室與液體流入 部分和液體流入部分相連。液體流入部分和流出部分可W是分隔開的部分或者一個(gè)部分， 但是在任一種情況下，都受到閥的控制。如上所述，氣動(dòng)脈沖發(fā)生器與第一半室氣動(dòng)相連， 通常是通過微通道相連，所述微通道也裝有閥。在完整的儀器中，氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)是可編程的。因 此，脈沖發(fā)生器所使用的可編程氣動(dòng)壓力邏輯具有兩個(gè)功能，發(fā)信號(hào)驅(qū)動(dòng)隔膜，W及發(fā)信號(hào) 打開和關(guān)閉閥。當(dāng)脈沖發(fā)生器與盒、短管或進(jìn)口脫開時(shí)，提供氣動(dòng)總管和電磁閥。
[0069] 使用時(shí)，當(dāng)對(duì)隔膜施加負(fù)壓時(shí)，液體通過進(jìn)口閥進(jìn)入隔膜累的第二半室（或者被 動(dòng)地，液體由第二隔膜累推動(dòng)進(jìn)入）。然后，當(dāng)對(duì)隔膜施加正壓時(shí)，室中的液體內(nèi)容物通過出 口閥被移出。類似地，正壓和負(fù)壓信號(hào)控制閥的打開和關(guān)閉。通過向隔膜提供一連串的正 壓和負(fù)壓脈沖，液體可w被移進(jìn)和移出隔膜累室。通過應(yīng)用同步閥邏輯使運(yùn)種流體運(yùn)動(dòng)成 為定向的，由此形成累送作用。
[0070] 微流體閥：包括各種液壓的、機(jī)械的、氣動(dòng)的、磁力的、和靜電的驅(qū)動(dòng)流動(dòng)控制器， 其具有至少一個(gè)小于500um的尺寸。運(yùn)些種類的代表性的瓣閥在美國(guó)專利No. 6, 431，212 中描述，通過引用將其全文合并入本文。還包括止回閥。一類閥指運(yùn)樣的配置：流動(dòng)通道 和控制通道在此處相交，并由彈性膜分隔開，作為對(duì)控制通道中的驅(qū)動(dòng)力的響應(yīng)，所述彈性 膜可W偏向流動(dòng)通道一側(cè)或者縮回。描述微流體閥的種類的專利包括美國(guó)專利Nos. 5, 971 ，355, 6, 418, 968, 6, 518, 99, 6, 620, 273, 6, 748, 975, 6, 767, 194, 6, 901，949 和美國(guó)專利申請(qǐng) 2002/0195152和2005/02005816,它們中的一些通常被轉(zhuǎn)讓給申請(qǐng)人，通過引用將它們?nèi)?部合并入本文。
[0071] 止回閥：是一種單向閥，微尺度形式的彈黃球閥、瓣閥、和觸發(fā)器閥是止回閥。
[0072] 被動(dòng)截止閥：是微流體通道中的可濕潤(rùn)的插入物或包被物，當(dāng)它被浸潤(rùn)的時(shí)候會(huì) 封閉微通道中進(jìn)一步在各個(gè)方向上的流動(dòng)。類似地，已公開了由微通道壁上的疏水材料環(huán) 構(gòu)成的"表面張力閥"，可W延緩或停止試劑的流動(dòng)。還可W通過擴(kuò)大微流體通道直徑的錐 度實(shí)現(xiàn)流動(dòng)停止。
[007引自動(dòng)注入（Self-priming):表示微流體通道由某種材料制成或者經(jīng)過處理，W使 得通道是可濕潤(rùn)的，并且開始進(jìn)行毛細(xì)流動(dòng)，而無需向通道中注入。
[0074]通過（Via):微流體通道中的一個(gè)步驟，其提供從一個(gè)基質(zhì)層向其上或其下的另 一個(gè)基質(zhì)層的流體通路，是層層構(gòu)建的層狀裝置的特征。
[007引枕包（Pillow):由可變形的球囊形成的內(nèi)置試劑包，例如聚脂薄膜小袋，其可選 地裝載氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)的裝置中，W便于在控制的時(shí)間刺穿袋釋放其內(nèi)容物。為了穩(wěn)定性考慮，金 屬和塑料的復(fù)合層是優(yōu)選的。
[0076]罩板包裝：在可變形（或者彈性）隔膜之下的內(nèi)置試劑包。用于通過向隔膜加壓 來輸送試劑，并且可W放置在"鋒利物體（sharp)"，例如金屬V形物體附近，W便于隔膜上 的壓力使"枕包"（參見枕包）破裂。運(yùn)些可W與止回閥或者可關(guān)閉孔一起使用，W產(chǎn)生定 向的液體流動(dòng)和試劑輸送。彈性隔膜可W容易地由例如聚氨醋、聚硅氧烷和聚下二締，W及 臘類獲得（參見彈性體）。可變形的、無彈性的隔膜由例如聚對(duì)苯二甲酸乙二醇醋（PET)、 聚醋薄膜、聚丙締、聚碳酸醋、或尼龍制成。其它適用于可變形膜的材料包括石蠟?zāi)?、乳膠、 錐、和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇醋。選擇可變形膜的關(guān)鍵因素包括屈服點(diǎn)和變形松弛系數(shù)（彈 性模量）。
[0077] 隔離或"隔離的":"正向隔離"在運(yùn)里是指保護(hù)使用者不暴露于可能污染了感染原 或毒素的臨床材料。"反向隔離"是指保護(hù)測(cè)定裝置不被假性外源污染物，例如可能引起假 陽性的核酸污染。
[0078] 廢物室或"包":是腔或室，其作為收集排出的樣品、漂洗溶液、和廢棄試劑的容器。 通常還包括引流材料（參見引流條）。廢物包還可W被密封在彈性隔離膜之下，彈性隔離膜 與微流體裝置的本體密封地相連。該內(nèi)置膜隨著吸收材料的膨脹而膨脹，由此將廢物材料 封閉。隔離膜之外的腔通向大氣，W使廢物材料包含在其中并被隔離。廢物包可選地可W 含有干燥的或液體的殺菌劑。
[0079] 引流條：是一種吸水性物質(zhì)，用于通過毛細(xì)濕潤(rùn)作用推動(dòng)液體流動(dòng)，其可W代替微 流體累或者與微流體累一起使用。吸水忍通常包括天然或合成纖維的纖維狀網(wǎng)格，并且通 常還包括特定的吸收膠凝材料，所述吸收膠凝材料通常被稱為"水凝膠"、"超強(qiáng)吸水劑"或 "水狀膠體"物質(zhì)。物質(zhì)包括紙、海綿、尿布材料、和其它物質(zhì)。還可W使用干燥劑，例如硫酸 巧、硫酸巧、硅膠，單獨(dú)使用或與吸水材料一起使用。
[0080]存水彎（Trap):具有屏障的液體阱，其進(jìn)一步將廢物庫與排放口（vent)隔離開。 [008。 排放口 ：在內(nèi)部腔和大氣之間形成互通的孔。"衛(wèi)生"或"隔離排放口"還含有過濾 元件，所述過濾元件能透過氣體，但是是疏水的并且不能濕潤(rùn)?？蛇x地，運(yùn)些過濾元件具有 0.45微米或更小的孔徑。運(yùn)些過濾器的作用是同時(shí)進(jìn)行正向隔離和反向隔離。運(yùn)種類型和 結(jié)構(gòu)的過濾元件也可W放置在內(nèi)部，例如將閥或隔膜累與控制它的啟動(dòng)總管隔離開。
[0082]測(cè)試場(chǎng)所：指在基于微流體裝置的測(cè)定中觀察或測(cè)量測(cè)定終點(diǎn)的位置，例如光學(xué) 窗口，并且可選地是含有測(cè)試墊的檢測(cè)室。
[0083]"常規(guī)的"是表示是本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)中已知的術(shù)語。
[0084]"大約"和"大體上"是不精確的擴(kuò)展表述，從"差不多"的意義上描述"或多或少"、 "近似"、或"幾乎"的情況，其變化是無關(guān)緊要的、顯而易見的、或者具有等同的效用或功能， 并且進(jìn)一步表明相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)則或界限存在明顯的小的例外情況。例如，在各個(gè)實(shí)施例 中，上述術(shù)語是指跟隨在該術(shù)語之后的值的20 %、10 %、5 %、1 %或0. 1 %W內(nèi)的量。
[0085] 在本文中，在描述"用于某種功能的手段"時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不僅限于附 圖中例示的一種或多種模式，而是還包括用于實(shí)現(xiàn)說明書中所述的運(yùn)種功能的所有手段， W及申請(qǐng)之時(shí)本領(lǐng)域中一般已知的所有其它手段。"現(xiàn)有技術(shù)手段"包括申請(qǐng)之時(shí)本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的用于實(shí)現(xiàn)該功能的所有手段，包括本文通過引用幾個(gè)實(shí)例所引述的本領(lǐng)域的 累積知識(shí)。
[0086] 例如，用于聚合的手段，可W指各種分子機(jī)器，其被描述為聚合酶和它們的輔因子 和底物，例如逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQ聚合酶，并且包括本文通過引用幾個(gè)實(shí)例所引述的酶學(xué)的累 積知識(shí)。
[0087] 用于擴(kuò)增的手段包括熱循環(huán)和等溫手段。第一種熱循環(huán)技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（也稱為PCR)，其在美國(guó)專利Nos. 4, 683, 195, 4, 683, 202 和 4, 800, 159、Ausubelet al.CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md. (1989)、和inInnisetal.，（ "PC民Protocols,"AcademicPress,Inc.，SanDiego Calif. ,1990)中詳細(xì)描述，通過引用將它們?nèi)墓_的內(nèi)容合并入本文。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 方法是本領(lǐng)域熟知的。簡(jiǎn)短來說，在PCR中，制備兩個(gè)引物序列，所述引物序列與祀序列上 相反的互補(bǔ)鏈上的區(qū)域互補(bǔ)。向反應(yīng)混合物中加入過量的脫氧核巧S憐酸和DNA聚合酶， 例如Taq聚合酶。如果樣品中存在祀序列，引物將與祀結(jié)合，聚合酶會(huì)引發(fā)引物沿著標(biāo)志物 序列通過加入核巧酸而延伸。通過升高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物會(huì)從模板上 解離形成反應(yīng)產(chǎn)物，過量的引物會(huì)與模板和反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合并重復(fù)運(yùn)個(gè)過程。通過加入巧光 嵌入劑，可W實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
[0088]-種等溫技術(shù)是LAMP(環(huán)介導(dǎo)的DNA等溫?cái)U(kuò)增），在Notomi,T.etal.NuclAcid Res2000 28 中描述。
[0089] 鏈置換擴(kuò)增（SDA)是另一種進(jìn)行核酸的等溫?cái)U(kuò)增的方法，其包括多輪鏈置換和合 成，即切口平移（Wa化eretal.NucleicAcidsResearch, 1992:1691-1696,通過引用合并 入本文）。一種類似的方法，稱為修補(bǔ)鏈反應(yīng)（RCR)，包括在用于擴(kuò)增的整個(gè)祀?yún)^(qū)域上使幾 個(gè)探針退火，然后進(jìn)行修補(bǔ)反應(yīng)，在修補(bǔ)反應(yīng)中只存在四種堿基中的兩種。另外兩種堿基可 W生物素化的衍生物的形式加入，W便于檢測(cè)。在SDA中使用了類似的方法。還可W通過 循環(huán)探針反應(yīng)（CPR)檢測(cè)祀特異性序列。在CPR中，具有非特異性DNA的3'和5'序列和 特異性RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交之后用RNaseH處理反應(yīng)， 識(shí)別探針的產(chǎn)物為特定產(chǎn)物，并在消化后釋放該特定產(chǎn)物。初始模板與另一個(gè)循環(huán)探針退 火，重復(fù)反應(yīng)。
[0090] 另一種核酸擴(kuò)增技術(shù)是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)。首先，使用逆轉(zhuǎn)錄酶由 RNA模板制備互補(bǔ)DNA(cDNA)，然后在得到的cDNA上進(jìn)行PCR。
[0091]另一種擴(kuò)增方法是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（"LCR")，在EP0No. 320 308中公開，通過引 用將其全文合并入本文。在LCR中，制備兩個(gè)互補(bǔ)探針對(duì)，在存在祀序列的條件下，每一對(duì) 與祀的相反的互補(bǔ)鏈結(jié)合，W使它們相鄰。在存在連接酶的條件下，兩個(gè)探針對(duì)將會(huì)連接形 成一個(gè)單元。通過溫度循環(huán)，如PCR中那樣，結(jié)合的連接單元從祀上解離，然后作為"祀序 列"用于過量探針對(duì)的連接。美國(guó)專利No. 4, 883, 750描述了與LCR類似的方法，將探針對(duì) 與祀序列結(jié)合，通過引用將其全文合并入本文。
[0092]QP復(fù)制酶，也可W用于本發(fā)明的另一種擴(kuò)增方法中。在運(yùn)種方法中，在存在RNA 聚合酶的條件下，將具有與祀互補(bǔ)的區(qū)域的RNA的重復(fù)序列加入到樣品中。聚合酶將會(huì)復(fù) 制重復(fù)序列，然后重復(fù)序列可W被檢測(cè)。
[0093] 在GB申請(qǐng)No. 2 202 328和PCT申請(qǐng)No.PCT/US89/01025中還描述了其它的擴(kuò)增 方法，通過引用將其全文合并入本文，它們可W用于本發(fā)明。在前者的申請(qǐng)中，在類似PCR 的、依賴于模板和酶的合成中使用了 "修飾的"引物。該引物可W通過用捕獲分子（例如生 物素）和/或檢測(cè)分子（例如酶）進(jìn)行標(biāo)記而被修飾。在后者的申請(qǐng)中，向樣品中加入過 量的標(biāo)記探針。在存在祀序列的條件下，探針結(jié)合并通過催化作用被切割。切割之后，完整 釋放祀序列W被過量的探針結(jié)合。標(biāo)記探針的切割表示存在祀序列。
[0094] 其它核酸擴(kuò)增程序包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)（TA巧，包括基于核酸序列的擴(kuò)增 (NASBA)和 3SR(Kwohetal. , 1989,Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A. , 86:1173;Gingeraset al.，PCT申請(qǐng)WO88/10315,通過引用將其全文合并入本文）。在NASBA中，可W通過標(biāo)準(zhǔn)的 酪/氯仿提取、臨床樣品的熱變性、用裂解緩沖液處理并用minispin柱分離DNA和RNA或 用來鹽酸脈提取RNA，來制備用于擴(kuò)增的核酸。運(yùn)些擴(kuò)增技術(shù)包括使具有祀特異性序列的 引物退火。在聚合之后，用RNaseH消化DNA/RNA雜交體，再次將雙鏈DNA分子加熱變性。 在每一種情況下，通過加入第二祀特異性引物，然后進(jìn)行聚合，使單鏈DNA完全被制備成雙 鏈。然后通過RNA聚合酶如T7或SP6倍增轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA分子。在等溫循環(huán)反應(yīng)中，RNA被 逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA，然后轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，然后再用RNA聚合酶如T7或SP6轉(zhuǎn)錄一次。得到 的產(chǎn)物，無論是截短的還是完整的，都表示祀特異性序列。
[0095]Dav巧etal.，EP0No. 329 822公開了核酸擴(kuò)增過程，通過引用將其全文合并入 本文，該過程包括循環(huán)合成單鏈RNA( "ssRNA")、ssDNA、和雙鏈DNA(dsDNA)，其可用于本發(fā) 明。ssRNA是第一引物寡核巧酸的模板，其通過逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DM聚合酶）而延 長(zhǎng)。然后通過核糖核酸酶H(RNaseH，一種對(duì)RNA與DNA或RNA的雙鏈特異的RNase)的作用 從得到的DNA:RNA雙鏈移除RNA。得到的ssDNA是第二引物的模板，第二引物還包括RNA聚 合酶啟動(dòng)子（由T7RNA聚合酶例示）5'的序列至與模板同源的序列。然后通過DM聚合酶 (由大腸桿菌DNA聚合酶D的大"Klenow"片段例示）延伸該引物，得到雙鏈DNA("dsDNA") 分子，其具有與初始RNA上引物之間的序列相同的序列，并且在一端額外還具有啟動(dòng)子序 列。可通過合適的RNA聚合酶使用該啟動(dòng)子序列，制造DNA的多個(gè)RNA拷貝。運(yùn)些拷貝然 后可W再進(jìn)入循環(huán)，產(chǎn)生非?？斓臄U(kuò)增。正確選擇酶