一種引物組及其在擴增siv/shiv基因組中的應(yīng)用與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種引物組及其在擴增SIV/SHIV基因組中 的應(yīng)用與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾滋病，又稱為獲得性免疫缺陷綜合癥（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一 類死亡率極高的傳染性疾病，對全球、尤其是亞洲和非洲等廣大發(fā)展中國家人民的生命健 康安全威脅極大。HIV最獨特的特征之一就是基因組的高變異性?；诨蜃儺?，流行于全 球的HIV-1分為四組，Μ組、0組、N組和P組，Μ組內(nèi)又可分為A~J 10個亞型，各亞型間的基因 離散率是20%~35%，同時，還有數(shù)十種循環(huán)重組型存在。病毒基因組基因分析在HIV研究 的很多重大發(fā)現(xiàn)中扮演了重要角色，而且高水平的基因變異分析也是艾滋病廣譜疫苗研發(fā) 的重要障礙。因此，高水平的病毒基因獲取技術(shù)對HIV研究至關(guān)重要。
[0003] SIV(Simian immunodeficiency virus)是一種猴免疫缺陷病毒，發(fā)現(xiàn)于非洲靈長 類動物，與HIV-1 病毒非常相似。SHIV(Simian-Human immunodeficiency virus)是人/猿嵌 合免疫缺陷病毒，是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)將HIV-1重要基因與SIV重組成的嵌合體病毒。由 于恒河猴感染SIV和人感染HI V-1存在著相似性，繼而發(fā)展出的癥狀也和AIDS相似，這些特 點可以使SIV/恒河猴動物模型用于HIV/AIDS研究。因此，SIV、SHIV病毒基因組序列的獲得 及分析就顯得尤為重要。
[0004] 起初，人們使用普通PCR(Bulk PCR)擴增早期血漿病毒以獲得SIV或SHIV病毒的基 因組片段，然后進行Sanger測序。該方法具有簡單、易操作及成本低等優(yōu)勢，也得到了急性 期和早期病毒群體的大概復(fù)雜性。但是，由于SIV病毒或SHIV病毒的基因組序列長度較長， 約為lOOOObp，普通的PCR技術(shù)往往存在重組、序列選擇及擴增序列有限的問題，這就使擴增 所獲得的片段會產(chǎn)生一定的突變，降低了精確度，給后續(xù)序列分析造成困擾。
[0005] 因此，需要進一步研究能夠精確擴增SIV或SHIV病毒基因組的引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種引物組及其在擴增SIV/SHIV基 因組中的應(yīng)用與試劑盒，本發(fā)明提供的引物特異性好，精確度高、敏感性高。
[0007] 本發(fā)明提供的引物組包括SEQ ID NO: 1~4所示核苷酸序列的4條引物和/或SEQ ID N0:5~8所示核苷酸序列的4條引物。
[0008] 本發(fā)明提供的引物組在擴增SIV/SHIV基因組的中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的引物組根據(jù)SIVmac239全基因組序列（Genbank NO.M33262)保守區(qū) 設(shè)計，分別位于LTR和Pol區(qū)。其中，SEQ ID N0:1~4所示核苷酸序列的4條引物用于擴增 SIV/SHIV基因組的5'半長(基因組全長的509位~6236位，共計5728bp)，SEQ ID N0:5~8所 示核苷酸序列的4條引物用于擴增SIV/SHIV基因組的3'半長(基因組全長的5244位~10087 位，共計4844bp)。以本發(fā)明提供引物組擴增得到的5'半長和3'半長存在重復(fù)序列，經(jīng)測序 后能夠拼接獲得完整的SIVmac239全基因組序列。
[0010] 本發(fā)明提供的引物組能夠具有特異性的、穩(wěn)定而準確的擴增出目標序列。經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳檢測，未見非特異性條帶產(chǎn)生，未見拖尾或彌散現(xiàn)象產(chǎn)生。經(jīng)測序后與Genbank 中登錄的SIVmac239全基因組序列比對，匹配度為100%，未見堿基置換或缺失(gap)。
[0011] 實驗表明，本發(fā)明提供的引物組對SIV/SHIV基因組具有良好的靈敏性，在病毒拷 貝數(shù)為lO13· 5^4·13之間皆能起到良好的檢測效果，分析認為靈敏性的差異性與病毒序列變異 度有關(guān)。
[0012] 本發(fā)明還提供了擴增SIV/SHIV基因組的試劑盒，包括本發(fā)明提供的的引物組。
[0013] 本發(fā)明提供的引物組以質(zhì)粒DNA為模板，也可以動物血漿逆轉(zhuǎn)錄來的病毒cDNA為 模板。作為優(yōu)選，以病毒cDNA為模板。因此，需提取病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。
[0014] 本發(fā)明提供的試劑盒中還包括SEQ ID N0:9所示核苷酸序列的逆轉(zhuǎn)錄引物。
[0015] 本發(fā)明提供的試劑盒中還包括Superscript III酶和High Fidelity Taq酶。
[0016] 其中，Superscript III酶為逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0017]本發(fā)明提供的試劑盒中還包括巢式PCR常用的緩沖液、底物，例如:PCR buf f er、 Mg2+、dNTP〇
[0018] 本發(fā)明提供了擴增SIV/SHIV基因組的方法，其特征在于，包括：以待測樣品的cDNA 為模板，以本發(fā)明提供的引物組擴增。
[0019] 在本發(fā)明實施例中，擴增采用巢式PCR分別擴增SIV/SHIV基因組的5'半長、3'半 長。
[0020] 本發(fā)明中SIV/SHIV基因組的5'半長的擴增包括：
[0021]步驟1:以待測樣品的cDNA為模板，以SEQ ID NO: 1~2所示核苷酸序列的引物擴 增，獲得中間產(chǎn)物；
[0022]步驟2:以中間產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO: 3~4所示核苷酸序列的引物擴增，獲得 SIV/SHIV基因組的5'半長。
[0023] 退火溫度(Annealing Temperature)為引物和模板結(jié)合時候的溫度參數(shù)，當50% 的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度，它是影響PCR特異性的較重要因素。
[0024] 作為優(yōu)選，步驟1中擴增的退火溫度為60°C~62°C，步驟2中擴增的退火溫度為60 Γ。
[0025] 優(yōu)選的，步驟1中的擴增程序為：
[0026]
[0027]或
[0028]
[0029]
[0030] 優(yōu)選的，步驟1中的擴增體系為：
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]在本發(fā)明中，SIV/SHIV基因組的3'半長的擴增包括：
[0037]步驟1:以待測樣品的cDNA為模板，以SEQ ID N0: 5~6所示核苷酸序列的引物擴 增，獲得中間產(chǎn)物；
[0038]步驟2:以所述中間產(chǎn)物為模板，以SEQ ID N0:7~8所示核苷酸序列的引物擴增， 獲得SIV/SHIV基因組的3'半長。
[0039] 作為優(yōu)選，步驟1中擴增的退火溫度為64°C，步驟2中擴增的退火溫度為60°C。
[0040] 優(yōu)選的，步驟1中的擴增程序為：
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048] 在本發(fā)明中待測樣品為血漿、組織、細胞或質(zhì)粒。
[0049] 本發(fā)明提供了用于擴增SIV/SHIV基因組的引物組，該引物組能夠有效擴增SIV或 SHIV的基因組。本發(fā)明提供的引物組能夠具有特異性的、穩(wěn)定而準確的擴增出目標序列。經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳檢測，未見非特異性條帶產(chǎn)生，未見拖尾或彌散現(xiàn)象產(chǎn)生。經(jīng)測序后與 Genbank中登錄的SIVmac239全基因組序列比對，匹配度為100%，未見堿基置換或缺失 (gap)。實驗表明，本發(fā)明提供的引物組對SIV/SHIV基因組具有良好的靈敏性，在病毒拷貝 數(shù)為之間皆能起到良好的檢測效果，分析認為靈敏性的差異性與病毒序列變異度 有關(guān)。
【附圖說明】
[0050]圖1示實施例1擴增產(chǎn)物的電泳圖；其中，泳道1~8依次示引物對1~8的擴增效果， 泳道W示以水為陰性對照的電泳，泳道Μ示marker;
[00511圖2-a示實施例2各組引物以SIVmac239質(zhì)粒為模板擴增產(chǎn)物(3'半長）的電泳圖； 其中泳道1~5依次示對照組1~5引物的擴增效果;泳道6示實驗組1引物的擴增效果;泳道N 示陰性對照，泳道P示陽性對照，泳道Μ示marker;
[0052] 圖2-b示實施例示表2各組引物以SIVmac239質(zhì)粒為模板擴增產(chǎn)物(5'半長）的電泳 圖；其中泳道1~2依次示對照組6~7引物的擴增效果;泳道3示實驗組2引物的擴增效果;泳 道4~6示對照組8~10引物的擴增效果；泳道N示陰性對照，泳道P示陽性對照，泳道Μ示 marker；
[0053] 圖3-a示表2各組引物以SHI V-KB9質(zhì)粒為模板擴增產(chǎn)物(3 '半長)的電泳圖；其中泳 道1~5依次示對照組1~5引物的擴增效果;泳道6示實驗組1引物的擴增效果;泳道N示陰性 對照，泳道P示陽性對照，泳道Μ示marker;
[0054] 圖3-b示表2各組引物以SHI V-KB9質(zhì)粒為模板擴增產(chǎn)物(5 '半長)的電泳圖；其中泳 道1~2依次示對照組6~7引物的擴增效果;泳道3示實驗組2引物的擴增效果;泳道4~6示 對照組8~10引物的擴增效果;泳道N示陰性對照，泳道P示陽性對照，泳道Μ示marker;
[0055] 圖4-a示表2實驗組2引物對的退火溫度檢測；泳道N示陰性對照，泳道P示陽性對 照，泳道Μ示marker;
[0056] 圖4-b示表2實驗組1引物對的退火溫度檢測；泳道Μ示以SIVmac239質(zhì)粒為模板;泳 道K示以SHI V-KB9質(zhì)粒為模板;泳道N示陰性對照，泳道P示陽性對照，泳道Mr示marker;
[0057] 圖5-a示以實驗組2的引物組擴增不同模板的擴增效果，S1~S9示以不同毒株感染 的細胞上清為模板的編號，其中，S1為SIVmac239感染的細胞上清為模板，S2為SIVmac239-973感染的細胞上清為模板，S3為SIVmac251感染的細胞上清為模板，S3為SHIV-CN97001感 染的細胞上清為模板，S4為SHI