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      Stk39基因甲基化位點(diǎn)及其診治骨性關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用

      文檔序號(hào):9466942閱讀:1234來(lái)源:國(guó)知局
      Stk39基因甲基化位點(diǎn)及其診治骨性關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及STK39基因甲基化位點(diǎn)及其診治骨性關(guān) 節(jié)炎的應(yīng)用,更具體的設(shè)及STK39基因、STK39基因的甲基化檢測(cè)及其在診治骨性關(guān)節(jié)炎中 的應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002] DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一,能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、 DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變,從而控制基因表達(dá)。甲基化位點(diǎn)可隨DNA 的復(fù)制而遺傳,因?yàn)镈NA復(fù)制后,甲基化酶可將新合成的未甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化。DNA 的甲基化可引起基因的失活,DNA甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化,從而影響了蛋白質(zhì) 與DNA的相互作用,甲基化達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)發(fā)生從常規(guī)的B-DNA向Z-DNA的過(guò)渡,由于 Z-DNA結(jié)構(gòu)收縮,螺旋加深,使許多蛋白質(zhì)因子賴W結(jié)合的原件縮入大溝而不利于轉(zhuǎn)錄的起 始,導(dǎo)致基因失活。
      [0003] 骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoart虹itis,OA)是一種W關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和關(guān)節(jié)周?chē)?質(zhì)增生為主要病理特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病。它是老年人中最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病,也是引 起中老年人關(guān)節(jié)疼痛的最常見(jiàn)原因。現(xiàn)今我國(guó)社會(huì)逐步進(jìn)入老齡化,該病的發(fā)生率也呈逐 年上升趨勢(shì)。已有報(bào)道表明OA發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與軟骨細(xì)胞的DNA甲基化有一定相關(guān)性,但 相關(guān)的研究還十分匿乏,亟待更多的研究掲示與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的甲基化基因,并闡明所 述甲基化位點(diǎn)與OA的關(guān)系。
      [0004] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)5例骨性關(guān)節(jié)炎病人及2例對(duì)照的膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行高通量甲基 化測(cè)序分析及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選出幾個(gè)在病例組中呈高甲基化且基因表達(dá)下調(diào)的候選 基因及其甲基化位點(diǎn)。進(jìn)一步的分子生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明,候選基因STK39在骨性關(guān)節(jié) 炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織中低表達(dá),同時(shí)該基因在患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織中甲基化程度明顯高 于正常組。本發(fā)明提供了一種新的骨性關(guān)節(jié)炎診治祀點(diǎn),具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)STK39基因的試劑在制備診斷骨性關(guān)節(jié)炎診斷 制劑中的應(yīng)用。
      [0006] 進(jìn)一步,所述診斷制劑中含有檢測(cè)STK39基因表達(dá)量和/或檢測(cè)STK39基因甲基 化程度的試劑。
      [0007] 優(yōu)選的,采用下列方式中的一種或幾種檢測(cè)STK39基因表達(dá)量:巧光定量PCR試劑 盒、基因忍片、ELISA法和/或膠體金法,更優(yōu)選的,采用引物序列為序列表SEQIDNO. 1和 SEQIDNO. 2進(jìn)行STK39基因表達(dá)量檢測(cè)。
      [0008] 基因忍片又稱為DNA微陣列值NAmicroarray),可分為S種主要類(lèi)型:1)固定在 聚合物基片(尼龍膜,硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或CDNA片段,通常用同位素標(biāo)記 的祀基因與其雜交,通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列,通過(guò)與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核巧 酸探針陣列,與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)?;蛉唐鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù),應(yīng)用于疾病的診斷,其優(yōu)點(diǎn)有W下幾個(gè)方面:一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性;二 是快速簡(jiǎn)便;=是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
      [0009] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)巧LISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體 等,具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾屯、法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的化ISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過(guò)氧化物酶(HR巧或者堿性憐 酸酶(A巧。
      [0010] 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù):(1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片,可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色,也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上,W銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記, 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面,可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。(2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合, 然后進(jìn)行負(fù)染??捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。(3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體,先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上,封閉后加待檢樣本,洗涂后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相 應(yīng)的抗原或抗體。(4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體W條帶狀固定在膜上,膠 體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上,當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后,通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng),溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng),當(dāng)移動(dòng)至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí),待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留, 聚集在檢測(cè)帶上,可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條,使用十分方 便。
      [0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑,所述制劑中含有促進(jìn)STK39 基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。
      [0012] 本領(lǐng)域人員熟知促進(jìn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通??蒞采用下述方法中的一種 和/或幾種:激活STK39基因的啟動(dòng)子、激活STK39基因表達(dá)的蛋白或因子、導(dǎo)入促進(jìn)STK39 基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體。
      [0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎的基因檢測(cè)試劑盒,所述試劑盒檢測(cè) 基因STK39。
      [0014] 本發(fā)明目的是提供了一種骨性關(guān)節(jié)炎蛋白檢測(cè)試劑盒,所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè) STK39蛋白。進(jìn)一步的,所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
      [0015] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎的基因忍片,所述的基因忍片包括與 STK39基因的核酸序列雜交的探針。
      [0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨性關(guān)節(jié)炎診療試劑,所述診療試劑組分中的一種或 幾種用于檢測(cè)或降低序列表中SEQIDNO. 3的CpG島甲基化程度。
      [0017] 進(jìn)一步,所述診療試劑組分中的一種或幾種用于檢測(cè)或降低序列表中SEQID NO. 3的第89bp處CpG島甲基化程度。
      [0018] 優(yōu)選的,采用BSP測(cè)序法對(duì)SEQIDNO. 3的甲基化程度進(jìn)行檢測(cè),更優(yōu)選的,采用 引物序列為序列表SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5進(jìn)行BSP測(cè)序檢測(cè)。
      [0019] 優(yōu)選的,采用甲基化特異性PCR法對(duì)甲基化程度進(jìn)行檢測(cè),甲基化特異性PCR法包 括一對(duì)甲基化檢測(cè)引物和一對(duì)非甲基化檢測(cè)引物。優(yōu)選的,甲基化特異性PCR法對(duì)序列表 中SEQIDNO. 3的第89bp處CpG島甲基化程度進(jìn)行檢測(cè)。
      [0020] 優(yōu)選的,采用引物序列為序列表SEQIDNO. 6到SEQIDNO. 9進(jìn)行甲基化特異性 PCR法對(duì)甲基化程度進(jìn)行檢測(cè)。
      [0021] 進(jìn)一步,采用下列方法中任意一種或幾種的組合對(duì)甲基化程度進(jìn)行檢測(cè):甲基化 敏感的限制性內(nèi)切酶方法、NaHS〇3法、忍片技術(shù)方法;所述N址SO3法包括BSP測(cè)序法、聯(lián)合 NaHS〇3限制性分析法、甲基化特異性PCR、巧光定量法;所述忍片技術(shù)方法包括甲基化高密 度忍片、差異甲基化雜交、甲基化特異性寡核巧酸忍片。
      [0022] 本發(fā)明的目的在于提供上述診療試劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎診療工具中的應(yīng)用。
      [0023] 甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法是經(jīng)典的甲基化分析方法,主要根據(jù)一些限制性 內(nèi)切酶不能切開(kāi)甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳動(dòng)物DNA中,只有CG相連的 胞喀晚能夠被甲基化,因此,在酶切位點(diǎn)內(nèi)包含CG序列的限制性內(nèi)切酶就會(huì)遇到問(wèn)題。運(yùn) 種方法所使用的兩個(gè)經(jīng)典酶對(duì)是HPa II-Msp I(CCGG)和SmaI-Xma I (CCCGGG)。由于第二 對(duì)限制酶識(shí)別序列非常罕見(jiàn),所W-般都用HPa II-Msp I (CCGG)。兩個(gè)酶都識(shí)別CCGG序 列,而當(dāng)其中的胞喀晚甲基化時(shí),HPaII不能夠?qū)⑵淝虚_(kāi),利用化a II-Msp工的運(yùn)種屬性處 理DNA,運(yùn)就使得HPa II-Msp I能夠作為快速甲基化分析的工具,隨后進(jìn)行Southern或PCR 擴(kuò)增分離立物,明確甲基化狀態(tài)。
      [0024]NaHS〇3可將非甲基化的C轉(zhuǎn)化為U,后者經(jīng)PCR擴(kuò)增變成T而產(chǎn)生T:A配對(duì),但甲 基化的C則能抵抗Na服〇3的修飾,運(yùn)樣DNA包含的甲基化信息就可轉(zhuǎn)化為DNA序列的差異。 由此發(fā)展了多種CpG島甲基化檢測(cè)方法,如BSP測(cè)序、PCR(C0BRA,MSP,Metheli曲t等)、忍 片雜交技術(shù)(microarray),此類(lèi)方法適應(yīng)于檢測(cè)己知基因中一個(gè)或多個(gè)CpG島的幾個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化,屬位點(diǎn)特異性DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)。
      [0025] 忍片技術(shù)的發(fā)展為高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理大致可 分為3種:(1)基于亞硫酸氨鹽處理后C/T轉(zhuǎn)變的原理,(2)基于甲基化敏感性內(nèi)切酶或者 甲基化依賴性內(nèi)切酶的方法,(3)基于5-甲基胞喀晚抗體或者M(jìn)BD的免疫撲獲方法富集甲 基化的DNA片段。
      【附圖說(shuō)明】
      [0026] 圖1骨性關(guān)節(jié)炎組和對(duì)照組中STK39基因甲基化情況
      [0027] 圖2骨性關(guān)節(jié)炎患者組內(nèi)STK39蛋白表達(dá)和基因甲基化相關(guān)性分析圖
      【具體實(shí)施方式】
      [0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明,僅用于解釋本發(fā)明,而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 W對(duì)運(yùn)些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型,本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
      [0029] 實(shí)施例1樣本的采集及測(cè)序
      [0030] 對(duì)照組:收集2012-2014年因交通事故在醫(yī)院進(jìn)行半月板損傷及交叉初帶損傷進(jìn) 行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療的患者,取膝關(guān)節(jié)軟骨組織速存于液氮罐。
      [003
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