單個(gè)基因mRNA甲基化水平檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于單個(gè)基因 mRNA甲基化水平檢測(cè) 方法及所用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA甲基化修飾發(fā)現(xiàn)于1974年，是一種最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄后水平修飾，大約占全部RNA 修飾的三分之二。在真核生物中，最常見(jiàn)的mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾是發(fā)生在堿基A第6位N原子 上的甲基化修飾，m6A大約占細(xì)胞mRNA全部腺苷含量的0. 1 % -0. 4%，即哺乳動(dòng)物中平均每 一條mRNA含有3-5個(gè)6-甲基修飾的腺苷。m6A甲基化位點(diǎn)主要發(fā)生在高度保守的RRACH (R =G，A ;H = A，C，T)序列中，在表觀遺傳中可能發(fā)揮重要的作用，但由于m6A修飾方式并沒(méi)有 破壞堿基之間的配對(duì)，故無(wú)法通過(guò)直接的測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行基因組上的定位，同時(shí)由于缺乏有 效的檢測(cè)分析手段，相關(guān)的研究一直停滯不前。直到2012年，文獻(xiàn)相繼報(bào)道鑒定出FTO和 ALKBH5等是RNA去甲基化的修飾酶類(lèi)，METTL3、METTL14等是RNA的甲基化酶，這促使RNA 甲基化成為一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，結(jié)合FTO超表達(dá)的小鼠被檢測(cè)到各組織RNA甲基 化水平明顯升高，且容易發(fā)生肥胖，ALKBH5缺失的小鼠生殖器RNA甲基化水平降低，睪丸發(fā) 育遲緩，精子形態(tài)異常這些現(xiàn)象，提示mRNA甲基化具有潛在的生物學(xué)意義，其分子機(jī)制有 待進(jìn)一步研究。不同基因 mRNA甲基化水平存在差異，可能影響mRNA剪切、出核轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定 性及翻譯效率對(duì)具體的生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)生作用，因此對(duì)單個(gè)基因 mRNA甲基化水平的測(cè)定，可 以進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行深入研究。
[0003]目前僅有的測(cè)定mRNA甲基化的方法是基于特異識(shí)別m6A抗體的免疫沉淀的二代 測(cè)序，但此方法成本高昂且耗時(shí)，因此建立價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單易操作的單基因甲基化相對(duì)水平 檢測(cè)方法非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)單基因甲基化水平的方法。發(fā)明人通過(guò) 設(shè)計(jì)mRNA甲基化特異引物，提取組織RNA并進(jìn)行片段化，利用甲基化的免疫沉淀及熒光定 量PCR等檢測(cè)手段建立單基因甲基化水平檢測(cè)平臺(tái)，為探索mRNA甲基化水平與其生物學(xué)功 能奠定基礎(chǔ)。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種單個(gè)基因 mRNA甲基化水平檢測(cè)方法中 所用的引物；
[0006] 靶基因?yàn)镃/ΕΒΡα基因，
[0007] 引物為：
[0008] C/EBP a -P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
[0009] C/EBPa -P2 R tcggagcggtgagtttgc〇
[0010] 本發(fā)明還同時(shí)提供了單個(gè)基因 mRNA甲基化水平檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0011] 1)、設(shè)計(jì)靶基因甲基化區(qū)域的熒光定量引物：根據(jù)NCBI上提供的靶基因 mRNA全長(zhǎng) 序列，在涵蓋⑶S區(qū)結(jié)束段及3' UTR區(qū)甲基化高度保守的RRACH (R = G，A ;H = A，C，T)序 列區(qū)域設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（為多對(duì)熒光定量PCR引物）；
[0012] 2)、提取總RNA，用化學(xué)斷裂法將總RNA片段化為RNA片段（100~500nt之間）；
[0013] 備注說(shuō)明：可利用RNA變性凝膠電泳檢測(cè)RNA片段化成功且未降解；RNA變性電泳 檢測(cè)屬于常規(guī)技術(shù)；
[0014] 3)、將步驟2)得到的片段化的RNA通過(guò)特異性識(shí)別m6A的抗體將帶有m 6A位點(diǎn)的 所有mRNA片段沉淀下來(lái)；并用瓊脂糖磁珠進(jìn)行收集富集；
[0015] 備注說(shuō)明：
[0016] 特異性識(shí)別 m6A 的抗體，即為：Affinity purified anti_m6A rabbit polyclonal antibody (Synaptic Systems, cat. no. 202 003)；
[0017] 洗脫提純后檢測(cè)mRNA濃度，Dot Blot方法檢測(cè)到含m6A的mRNA片段特異性富集 (如圖3)。
[0018] 4)、將步驟3)中抗體富集得到的mRNA片段反轉(zhuǎn)錄，用步驟1)的熒光定量PCR引 物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量的高低就代 表了單個(gè)基因 mRNA甲基化水平高低。
[0019] 作為本發(fā)明的單個(gè)基因 mRNA甲基化水平檢測(cè)方法的改進(jìn)：
[0020] 靶基因?yàn)镃/ΕΒΡα基因，
[0021] 引物序列如下：
[0022] C/EBP a -P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
[0023] C/EBPa -P2 R tcggagcggtgagtttgc。
[0024] 作為本發(fā)明的單個(gè)基因 mRNA甲基化水平檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0025] 步驟2)的化學(xué)斷裂法中，
[0026] RNA片段化體系為：
[0027] RNA(1 μ g/μ 1)180 μ 1，
[0028] 片段化緩沖液（10Χ) 20 μ I ;
[0029] 孵育溫度和時(shí)間為以下任意一種：
[0030] 70。(：、3111丨11，70。(：、5111丨11(較佳），95。(：、3111丨11(較佳）和95。(：、511^11。
[0031] 本發(fā)明的方法是一種單個(gè)基因 mRNA甲基化相對(duì)水平檢測(cè)技術(shù)，該方法的獨(dú)特之 處在于從生物組織RNA樣品中，通過(guò)m6A免疫沉淀和熒光定量PCR技術(shù)，可以測(cè)定單個(gè)基因 甲基化相對(duì)水平。
[0032] 本發(fā)明用帶有m6A位點(diǎn)的基因片段mRNA表達(dá)量來(lái)計(jì)算靶基因 mRNA甲基化水平。 由于目前并不存在直接測(cè)定基因甲基化水平的方法，因此本方法可實(shí)現(xiàn)單個(gè)基因甲基化相 對(duì)水平檢測(cè)。
[0033] 本發(fā)明采用甲基化特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR，得到靶基因 mRNA甲基化水平表 達(dá)量，通過(guò)與Input比較，計(jì)算得到革El基因的甲基化相對(duì)水平。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0035] 圖1 :不同水浴溫度和時(shí)間條件下的RNA片段化效果；
[0036] 圖2 :凝膠電泳證實(shí)C/EBP α引物的有效性；
[0037] 圖3 :m6A特異性抗體進(jìn)行各組mRNA片段化富集（Dot blot檢測(cè)）；
[0038] 圖4 :樣品1和樣品2的C/EBP α基因 mRNA甲基化相對(duì)水平；
[0039] 樣品1:21日齡豬的肝臟組織，樣品2:180日齡豬的肝臟組織。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1、
[0041] 1.總 RNA 提?。?br>[0042] 分別取兩組豬肝樣品各50~IOOmg進(jìn)行以下操作：液氮中研磨后，加 Iml Trizol 裂解液混勾，加入0. 2ml氯仿劇烈振蕩15秒，室溫下孵育IOmin后，4°C、15000g離心15min， 吸取上層水相（約500 μ 1)轉(zhuǎn)移到新管中，加入500 μ 1異丙醇，顛倒混勻；4°C，15, OOOg離 心lOmin，棄上清；加入1ml 75% (體積％ )乙醇洗滌，4°C，15, OOOg離心10min，棄上清， 待管底R(shí)NA沉淀變成無(wú)色透明時(shí)，加入80 μ 1的DEPC水吹打混勻。
[0043] 2. RNA 片段化：
[0044] 1)按以下反應(yīng)體系將步驟1所得的RNA與片段化緩沖液混合，
[0045] RNA片段化體系
[0047] 為獲得最佳溫度和孵育時(shí)間，分別設(shè)置70°C *3min，70°C *5min，95°C *3min和 95°C *5min四種條件。
[0048] 該片段化緩沖液（IOX)為：800 μ L RNase-free 水，100 μ L IM Tris-HCl 緩沖液 (pH = 7. 0)，100 μ L IM ZnCl2溶液。
[0049] 2)反應(yīng)結(jié)束后立即加入20 μ 1濃度為0. 5Μ的EDTA溶液，在冰上迅速冷卻以終止 反應(yīng)，劇烈振蕩15秒；依次加入550 μ 1預(yù)冷的無(wú)水乙醇，77 μ 1濃度為3M的醋酸鈉溶液， 15 μ 1 (質(zhì)量濃度為2% )的糖原溶液。1000 g離心Imin后于-80°C冰箱沉淀過(guò)夜（12小 時(shí)）。
[0050] 3)沉淀過(guò)夜的RNA于4°C、15000g離心25min后收集沉淀，棄上清，加入1ml 75% (體積％ )乙醇洗滌，4°C，15, OOOg離心10min，棄掉上清，待管底的RNA沉淀變無(wú)色透明時(shí)， 加入50 μ 1的DEPC水，并吹打混勻。
[0051 ] 4)變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA片段化效果：電泳條件為恒壓60V，電泳30min~ lh。以步驟1中提取的總RNA作為對(duì)照，結(jié)果表明：在70°C*5min和95°C*3min條件下，RNA 片段化效果較好，斷裂的RNA片段大小在100~500nt之間（圖1)，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0052] 3.引物設(shè)計(jì)：
[0053] 以豬的C/EBP α基因?yàn)槔?，根?jù)在NCBI上提供的該基因 mRNA全長(zhǎng)序列，在⑶S區(qū) 末尾及3' UTR區(qū)的甲基化特異性序列（RRACH)上下游設(shè)計(jì)多對(duì)熒光定量PCR引物，由上海 生工生物有限公司合成，引物序列如下：
[0054] C/EBP α -P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
[0055] C/EBP a -P2 R tcggagcggtgagtttgc
[0056] 用于篩選的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序如下：
[0057] 引物采用 IOul 的 PCR擴(kuò)增體系，BP :5ul 2xTaq PCR MasterMix(含染料），0· 5 μ 1 C/EBP a -P2F，(λ 5 μ I C/EBP a -P2R，1 μ 1 豬肝 cDN