一種小分子甲魚肽和甲魚油聯(lián)產的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及水產品加工領域，尤其涉及一種小分子甲魚肽和甲魚油聯(lián)產的制備方法。
【背景技術】
[0002]甲魚又名鱉、團魚，味道鮮美，含多種營養(yǎng)物質，是我國傳統(tǒng)的保健食品原料。甲魚富含蛋白質、脂肪、鈣、鐵以及多種維生素，具有補血、抗疲勞和強骨等多種功效。目前，甲魚主要以鮮活銷售為主，加工產品少，產品附加值低。研究表明，甲魚油呈高度不飽和狀態(tài)，含有人體必需的脂肪酸，具有較高的營養(yǎng)。甲魚中蛋白質豐富，通常人體攝取的蛋白質經過消化道酶水解后，以多肽的形式直接吸收，并且二肽和三肽的吸收速度比同一組成的氨基酸快。
[0003]目前，已有關于甲魚產品開發(fā)的相關研究，在甲魚多肽制備方面，中國申請專利CN102286588A公開了甲魚肽的制備方法、中國申請專利CN102286589 A公開了甲魚低聚肽的制備方法，中國申請專利CN101744090公開了一種甲魚低分子多肽的制造方法，這類專利都采用酶解方法獲得甲魚多肽，對于蛋白資源的的高效利用和甲魚的精深加工起到一定的作用，但是存在酶解效率低和低分子量多肽比例偏低等問題。在甲魚油制備方面，中國申請專利CN1769409 A 一種精制甲魚油的制備方法，對甲魚油進彳丁了精制，提尚了品質，但廣品形式單一。
[0004]以上這些研究存在以下缺陷:
(1)甲魚屬于爬行動物，含有硬骨、結締組織和膠原等復雜成分，簡單的加工處理方式不容易破壞這類組織，嚴重影響后續(xù)的酶解效率。
[0005](2)由于生長環(huán)境等因素，甲魚帶有一定細菌，酶解后期加熱處理能夠起到一定滅菌作用，但較難達到理想效果，對產品品質產生不良影響。
[0006](3)甲魚中富含油脂，是制備甲魚油的天然原料。油脂容易與蛋白發(fā)生結合，形成包裹層，影響蛋白酶酶解效率。前期人工剔除脂肪難以完全，同時存在人工成本高等問題，而在酶解后期處理達不到棄除脂肪的效果，油脂容易發(fā)生氧化，影響產品的品質；
(4)研究表明，分子量小于3 kDa的多肽容易被人體吸收，然而以往專利由于酶解效率低，獲得低分子量多肽所占比例不高。
[0007](5)這類專利或專利申請大多以甲魚為原料，研究產品多為單一利用甲魚中蛋白資源或油脂成分，甲魚資源未得到充分利用。
[0008]因此，繼續(xù)一種從甲魚中獲得高比例的低分子量多肽和甲魚油的制備方法。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種從甲魚中獲得高比例的低分子量多肽和甲魚油制備方法。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種小分子甲魚肽和甲魚油聯(lián)產的制備方法，步驟為，
(1)預處理:選取新鮮甲魚原料，宰殺后棄內臟，清洗干凈，切塊后立即使用或凍存于-30 °C冰箱中備用；
(2)高溫高壓預煮:將清洗干凈的甲魚放置于高溫高壓蒸汽殺菌進行高溫高壓處理，冷卻后瀝干湯汁；
(3)絞碎和勻漿:將處理后的甲魚放入絞肉機中絞碎，絞碎后樣品加入蒸餾水，并用組織搗碎機搗碎勻漿得到樣品混合液；絞肉機實現(xiàn)了甲魚肉和骨頭的徹底粉碎，同時組織搗碎可實現(xiàn)蛋白樣品的均勻分布，提高后續(xù)的酶解效果；
(4)蛋白與油脂分離:將搗碎后的樣品混合液置于水浴鍋，高溫加熱并不斷攪拌，反應結束后冷卻至室溫，離心取上層和中層即為油脂粗樣，下層沉淀重復步驟一次，上層和中層與之前的上層與中層混合為油脂粗樣；
(5)甲魚油提取:往步驟(4)所得油脂粗樣中加入酒精溶液，攪拌后-20°C下冷凍結晶，離心去掉酒精溶液，獲得凝固的甲魚油粗樣；
(6)分步酶解:步驟(4)獲得的沉淀加入蒸餾水，組織搗碎后調整pH，加入高pH蛋白酶進行一次酶解，酶解結束后加入低pH蛋白酶進行二次酶解得到酶解樣品；
(7)膜處理:酶解樣品高溫處理后調pH至7.0，冷卻后用濾袋過濾，再進行超濾膜和納濾膜處理；
(8)噴霧干燥:將獲得的樣品進行噴霧干燥，即得甲魚多肽粉產品。
[0011 ] 進一步，所述步驟(1)中，清洗所用的清水為4-10 °C的冰水。
[0012]進一步，所述步驟(2)中，高溫高壓處理條件為0.lMPa，121°C，處理時間為10?20min。121°C高溫高壓預煮能夠殺滅甲魚所帶細菌，同時起到甲魚蛋白變性的作用，有利于后續(xù)酶解效率提尚;
進一步，所述步驟(3)中，處理后的甲魚為甲魚肉和甲魚骨頭的混合物；
任選的，組織搗碎機所用轉速為3000-5000 rpm/min，組織搗碎時間為3-5 min。
[0013]進一步，所述步驟(4)中，高溫加熱所用溫度為80-100 °C，加熱時間為20-30min ；
任選的，離心所用轉速為4000-8000 rpm，離心時間為10-20 min，溫度為4-20 °C。
[0014]本發(fā)明采用80-100 °C預處理，使水溶性蛋白在加熱條件下變性，離心后沉淀，而油脂漂浮于上層和中層，實現(xiàn)油脂和蛋白的有效分離。
[0015]進一步，所述步驟(5)中，所用酒精濃度為75-100體積％，加入量為油脂粗樣體積的2-4倍；
任選的，冷凍結晶20-30小時，優(yōu)選24小時；
任選的，離心所用轉速為4000-8000 rpm，離心時間為10-20 min，溫度為4-20 °C ； 進一步，所述步驟(6)中，加入2-4倍體積的蒸饋水，4000-5000rpm組織搗碎；
任選的，所述高pH蛋白酶為胰蛋白酶、堿性蛋白酶或復合蛋白酶；優(yōu)選的，加酶量為0.5?1重量％，反應時間為1?2 h ;
任選的，所述低pH蛋白酶為木瓜蛋白酶或中性蛋白酶；優(yōu)選的，加酶量為0.5?1重量％，反應時間為1?2 h。
[0016]進一步，所述步驟(7)中，酶解樣品于90°C?95°C高溫處理10?20 min，并用1MNaOH調整pH至7.0，冷卻后用濾袋過濾，再進行超濾膜和納濾膜處理；
優(yōu)選的，所述超濾膜所用孔徑為5000?20000道爾頓，納濾膜200?300道爾頓。
[0017]進一步，所述步驟(8)中，噴霧干燥的進口溫度設置為170?190°C，出口溫度為85 ?100。。。
[0018]本發(fā)明能夠實現(xiàn)油脂和蛋白的有效分離，提高了蛋白酶的酶解效果，提高了酶解效率，獲得的甲魚肽分子量主要集中在2 kDa以下，所占比例98%以上；
本發(fā)明采用超濾和納濾膜相結合的手段，提高了效率，同時也提升了產品品質。
[0019]本發(fā)明采用生物技術及物理方法，實現(xiàn)對甲魚油脂和蛋白進行高效利用，對于有效提尚提尚廣品附加值。
[0020]本發(fā)明采用分步酶解，一步酶解所用高pH蛋白酶對甲魚蛋白進行酶解，一步酶解后酶解液pH值隨之降低，二步酶解在不調整pH的情況下采用低pH蛋白酶酶解，這個過程中避免了 pH調整中無機鹽的帶入。同時，采用分步酶解能夠使得酶解更加充分，最終將大分子逐步降解為小分子，直至2KD左右，故獲得的多肽主要集中在2 kDa以下。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1是本發(fā)明實施例2所得產品的HPLC液相GPC軟件處理圖。
[0022]圖2是本發(fā)明實施例3甲魚蛋白分布酶解過程的SDS-PAGE電泳圖。
【具體實施方式】
[0023]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的描述中，“第一”、“第二”、“第三”等為指代或描述方便，不能理解為有順序關系或者有相對重要性指示，除非另有說明，“多個”、“多組”、“多重”的含義是兩個(組或重)或兩個(組或重)以上。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。
[0024]實施例1:
(1)預處理:選取鮮活甲魚原料，宰殺后棄內臟498g，清洗干凈，切塊后2504 g;
(2)高溫高壓預煮:將清洗干凈的甲魚放置于采用高溫高壓蒸汽殺菌鍋(0.1MPa，121 °C)高溫高壓處理20 min，冷卻后瀝干湯汁；
(3)絞碎和勻漿:將步驟(2)處理后的甲魚放入絞肉機中絞碎，絞碎后樣品加入6.5 L體積蒸餾水，用組織搗碎機勻漿5 min ;組織搗碎機轉速為3000 rpm/min，時間5 min ；
(4)蛋白與油脂分離:將搗碎后的樣品混合液置于水浴鍋，100°C加熱3Omin并不斷攪拌，反應結束后冷卻至室溫，4-20 °C下，4000rpm,離心20min，取上層和中層即為油脂粗樣，下層沉淀，重復步驟一次；
(5)甲魚油提取:將步驟(4)上層和中層樣品溶液，加入75%酒精溶液10L，攪拌后-20°C下冷凍結晶，4-20 °C下，4000rpm，離心20min，去掉酒精溶液，獲得凝固的甲魚油粗樣 202.0 g ； (6)分步酶解:步驟(4)獲得的沉淀加入3.7L蒸餾水，組織搗碎后調整pH 7.2，加入0.5重量％復合蛋白酶室溫進行一次酶解2h，酶解結束后加入0.8重量％木瓜蛋白酶室溫進行二次酶解1.5 h ;
(7)膜處理:酶解后樣品90°C高溫處理10min，并用1M NaOH調整pH至7.0，冷卻后濾袋過濾，將獲得的溶液分別進行超濾膜和納濾膜處理，超濾膜所用孔徑為5000道爾頓，納濾膜300道爾頓濃縮