及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]埃博拉出血熱由埃博拉病毒(Ebola virus, EB0V)引起，病死率可高達(dá)90%，是當(dāng)今世界最恐怖烈性的傳染病。本病自1976年于非洲埃博拉河流域發(fā)現(xiàn)以來，每年都有發(fā)生，今年的疫情尤為嚴(yán)重，自2014年3月以來，于非洲幾內(nèi)亞、利比里亞、塞拉利昂持續(xù)暴發(fā)，快速蔓延，疫情幾近失控，截止2014年10月9日已確診3750人，死亡1876人，WHO呼吁世界加強(qiáng)防控。
[0003]我國處于WHO公布的埃博拉自然疫區(qū)范圍內(nèi)，在我國南方地區(qū)存在埃博拉病毒的自然宿主，錘頭果蝠、富氏前肩頭果蝠和小項圈果蝠。中國科學(xué)院武漢病毒研究所的研究人員對我國部分地區(qū)的蝙蝠進(jìn)行血清學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)有萊斯頓型埃博拉病毒(EB0V-R)流行的血清學(xué)證據(jù)；也有報道稱我國豬體內(nèi)EB0V-R病原核酸呈陽性，但是尚未發(fā)現(xiàn)致死性埃博拉病毒病病例。需要特別提及的是，我國的鄰國菲律賓2009年曾2次發(fā)生EB0V-R疫情。目前我國在40多個非洲國家派有醫(yī)療隊、維和部隊和維和警察隊等援外人員達(dá)2萬余人。隨著國際交往日益增多，該病傳入我國的可能性加大。同時，國際國內(nèi)政治斗爭形勢日趨復(fù)雜化，作為被列入禁止生物武器公約名單的埃博拉病毒也有可能被恐怖分子和敵對勢力所利用，危害我國公共衛(wèi)生安全。目前該病尚無有效預(yù)防和救治藥物。
[0004]抗血清用于抗病毒治療已有100多年的歷史，1988年英國微生物實驗室工作人員感染埃博拉病毒后使用抗血清治療痊愈；特別是，近期美國赴西非2名醫(yī)務(wù)人員感染埃博拉病毒后利用抗體治療也證明有效?？寡宓膬?yōu)點是特異性強(qiáng)、效價高、作用快、制備周期短，生產(chǎn)量大。我國也早已批準(zhǔn)人用馬抗狂犬病血清、破傷風(fēng)抗毒素血清、抗蛇毒血清等異源抗體制劑。因此，精制馬抗的研制和應(yīng)急儲備對日趨嚴(yán)峻的埃博拉疫情防控十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高效、安全、可靠的馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制備方法。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種制備馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2的方法，其是將同時表達(dá)扎伊爾型埃博拉病毒的GP和VP40兩個基因(GenBankAccess1n N0.AY354458，Zaire 1995)的病毒樣顆粒經(jīng)滅活、純化與免疫佐劑混合作為免疫原，通過多次免疫健康馬匹，獲得高免血漿，分離純化IgG蛋白，然后IgG蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DEAE離子交換層析柱，收集洗脫液，脫鹽、凍干，即得馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2。
[0007]所述制備方法具體包括以下步驟:
[0008]1)將扎伊爾型埃博拉病毒的兩個基因GP和VP40克隆于同一昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒，用重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，拯救獲得重組桿狀病毒，將獲得的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)后收獲上清，即得到同時表達(dá)扎伊爾型埃博拉病毒的GP和VP40兩個基因的病毒樣顆粒；
[0009]2)將上述病毒樣顆粒經(jīng)純化后與弗氏不完全佐劑混合，健康馬匹經(jīng)過背部皮下分點注射的方法進(jìn)行初免、多次加強(qiáng)免疫，檢測馬血漿效價達(dá)到1:5000以上時采血；采用飽和硫酸銨沉淀法，從血漿中分離純化IgG蛋白，然后用胃蛋白酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物過DEAE離子交換層析柱，收集穿透峰、洗脫峰，最后過G-25脫鹽凝膠柱，收集蛋白峰，過濾、凍干，即得馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2。
[0010]前述的方法，步驟1)中所述昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體選自ACRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZ1、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUffl、pAcUW2U pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW3U pAcUW4U pAcUW42、pAcUW43、pAcUW5UpAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacII1、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP1、pJVrsMAG、pMBac、pP1、pPAKl、pPBac、pSHONEXl.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV V1-、pVL1391、pVL1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHTB、pFastBacHT C、pFastBacDual。優(yōu)選 pFastBacDual。
[0011]步驟1)中使用的昆蟲細(xì)胞選自草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf21、Sf9、Mimic Sf9 細(xì)胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)Se 301 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl細(xì)胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 細(xì)胞系、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)BT1-Tn-5B1_4 細(xì)胞系、BT1-Tn-5C1 細(xì)胞系、BT1-Tn-5F2 細(xì)胞系，斜紋貪夜蛾(Spodoptera litura) ZSU-S1-1 細(xì)胞系、IBL-SL1A細(xì)胞系、家蠶卵巢細(xì)胞系BmN。優(yōu)選Sf9。
[0012]步驟1)中所述扎伊爾型埃博拉病毒的兩個基因GP和VP40可根據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子進(jìn)行基因優(yōu)化，然后將優(yōu)化后的基因GP和VP40克隆于同一昆蟲細(xì)胞高效表達(dá)載體上。
[0013]步驟2)中病毒樣顆粒經(jīng)蔗糖密度梯度離心(用20%、30%、60%蔗糖密度梯度離心)后，在30%和60%之間得到純化病毒樣顆粒后，與弗氏完全佐劑按1:2的體積比混合。
[0014]步驟2)中所述飽和硫酸銨沉淀法具體為:取馬血漿適量，在攪拌下加入硫酸銨，使硫酸銨終濃度為31 %，然后在20°C，8000rpm離心30min，棄上清，取沉淀。
[0015]步驟2)中采用胃蛋白酶酶切的具體方法為:向純化的IgG蛋白中加入胃蛋白酶(胃蛋白酶的終濃度為7-10U/mL)，混勻，于30°C消化3.5-4.5h。酶解完成后用5mol/L NaOH調(diào)溶液pH值至5.2，終止酶解反應(yīng)。置于57°C保持30min，待溫度降至45°C以下后離心，上清為F(ab' )2粗品。
[0016]步驟2)中使用的DEAE離子層柱中填料為DEAE_Sepharose FF。過DEAE離子交換層析柱時使用的洗脫緩沖液成分為:含有0.5M Tris-HCl和1.0M NaCl的pH8.5的溶液。
[0017]本發(fā)明還提供按照上述方法制備的馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2。
[0018]本發(fā)明還提供所述馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2在制備用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒病藥物中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明進(jìn)一步提供由所述馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)^lj備的用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒病的藥物。
[0020]本發(fā)明制備的馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2含量不低于總蛋白含量的95.0%。本發(fā)明產(chǎn)品為凍干粉劑型，具有高效價的中和埃博拉病毒特性，可作為治療埃博拉病毒病人的一種新的有效藥物，用于埃博拉病毒感染患者的緊急救治。
[0021]本發(fā)明提供的馬抗埃博拉病毒特異免疫球蛋白F(ab’)2，是用于預(yù)防和治療埃博拉病毒所引起的埃博拉病毒出血熱的有效藥物，對埃博拉病毒感染重癥患者具有顯著療效，提高患者的存活率。本品將填補國內(nèi)此類藥物的空白。本發(fā)明的制備工藝采用獨特的工藝參數(shù)控制，用常規(guī)的分離法生產(chǎn)出所述特異性免疫球蛋白，適于工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品安全可靠。用于制備馬抗埃博拉病毒特異免疫球蛋白F(ab’)2的原料血漿有穩(wěn)定高效的來源，能滿足血漿的供給。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0023]實施例1馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制備方法
[0024]馬抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2的制備方法包括以下步驟:
[0025]1、免疫原的制備:將扎伊爾型埃博拉病毒的兩個基因GP和VP40(GenBankAccess1n N0.AY354458, Zaire 1995)克隆于同一昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體 pFastBacDual上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒，用重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，拯救獲得重組桿狀病毒，將獲得的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞Sf9，27°C靜止培養(yǎng)48-72h后收獲細(xì)胞上清液，即得到同時表達(dá)扎伊爾型埃博拉病毒的GP和VP40兩個基因的病毒樣顆粒。
[0026]經(jīng)鑒定，達(dá)到要求表達(dá)量的病毒樣顆粒，采用蔗糖密度梯度離心((用20%、30%、60%蔗糖密度梯度離心)后，在30%和60%之間得到純化病毒樣顆粒。
[0027]2、將上述病毒樣顆粒滅活液與弗氏完全佐劑按1 '2的體積比混合均勻，挑選健康馬匹(優(yōu)選4-6歲體質(zhì)