一種口腔黏膜上皮模型及其體外構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程學(xué)生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可體外替代口腔黏膜上皮進(jìn)行口腔護(hù)理產(chǎn)品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、一次性衛(wèi)生用品等產(chǎn)品的安全性與功效性檢測及其他與口腔黏膜上皮接觸的材料的安全性與功效性評價的口腔黏膜上皮模型及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明中口腔黏膜上皮模型是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將少量種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后構(gòu)建而成，其結(jié)構(gòu)與正?？谇火つど掀そY(jié)構(gòu)高度類似，由上而下的結(jié)構(gòu)依次為顆粒層、棘層和基底層，均無角質(zhì)層，具有完整的上皮結(jié)構(gòu)，除可用于替代或修復(fù)病變、缺損組織，重建生理功能外，體外重建口腔黏膜還可用作體外檢測模型，對口腔護(hù)理產(chǎn)品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、一次性衛(wèi)生用品等產(chǎn)品的安全性與功效性檢測及其他與口腔黏膜接觸的材料安全性與功效性評價。
[0003]目前，口腔黏膜上皮在口腔護(hù)理產(chǎn)品的安全性及功效性檢測，藥物滲透能力檢測，煙草成分致癌能力檢測，口腔致病菌致病機(jī)理研究等各方面得到越來越多的關(guān)注。但目前研究中口腔黏膜上皮來源主要是動物口腔黏膜、患者手術(shù)切除口腔黏膜組織。兩者都存在一定的應(yīng)用弊端，動物來源的口腔黏膜組織不能準(zhǔn)確的反應(yīng)人體實驗，結(jié)果統(tǒng)計表明只有50%的動物實驗結(jié)果符合人體數(shù)據(jù)結(jié)果；此外，大量動物用于各項試驗的倫理問題受到質(zhì)疑，國際上已禁止化妝品、化學(xué)品等的動物實驗。人體來源的口腔黏膜組織主要存在取材困難、來源有限，不能滿足口腔相關(guān)產(chǎn)品安全性體外評價數(shù)量需求。
[0004]在組織工程口腔黏膜研究的早期，研究者利用口腔黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)形成上皮膜片，直接用于黏膜組織缺損修復(fù)。Lauer等人用牙齦上皮，利用3T3細(xì)胞為滋養(yǎng)層，在體外培養(yǎng)3~4周可形成完整的包含3~6層細(xì)胞的上皮膜片，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的上皮分化良好，與正常組織類似，但異種滋養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)用，在臨床修復(fù)中可能會對人體造成潛在的危險。后有研究者在無滋養(yǎng)層情況下利用組織塊法培養(yǎng)口腔黏膜上皮膜片并應(yīng)用于臨床，移植入患者體內(nèi)后，成功率達(dá)65%。但如前所述組織塊法培養(yǎng)時常常有成纖維細(xì)胞的污染，影響上皮細(xì)胞的生長。
[0005]Mitchell Klausner等人使用人口腔黏膜組織體外培養(yǎng)構(gòu)建口腔黏膜單層模型，對該模型的屏障功能進(jìn)行分析，檢測了在NaF及焦磷酸(PPI)刺激下該模型的細(xì)胞活性及細(xì)胞因子的釋放情況，并使用該模型對已商品化的系列口腔護(hù)理產(chǎn)品進(jìn)行ET-50分析；Francis Koschier等使用體外構(gòu)建的口腔黏膜模型研究了不同濃度的酒精對口腔黏膜的刺激作用，口腔黏膜模型對酒精的吸收能力，及酒精刺激后模型對咖啡因的吸收能力的影響。但這些模型均使用人源口腔黏膜組織，同樣具有來源困難，無法實現(xiàn)體外大量生產(chǎn)，滿足市場需求的缺點(diǎn)。
[0006]為克服以上種子細(xì)胞來源的缺陷，有研究者采用口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株TR146做為種子細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后構(gòu)建成口腔黏膜模型?？谇火つ[狀癌細(xì)胞株是目前較為成熟的口腔黏膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞系穩(wěn)定可控，可以解決種子細(xì)胞來源困難、細(xì)胞穩(wěn)定性等問題。例如Hanne M0rck Nielsen等人利用TR146細(xì)胞體外構(gòu)建口腔黏膜模型進(jìn)行研究，但該模型具有一系列缺陷:一，構(gòu)建時間長，體外構(gòu)建一批模型需長達(dá)一個月時間，過長的構(gòu)建時間會增加過程中的不可控因素，影響模型的穩(wěn)定性；二，培養(yǎng)體系單一不能適應(yīng)細(xì)胞不同階段的營養(yǎng)需求，導(dǎo)致模型復(fù)層化較差，基底層無半橋粒結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)不均一完整，屏障功能減弱，嚴(yán)重降低模型的應(yīng)用；三，主要應(yīng)用于藥物滲透吸收研究，應(yīng)用方向單一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種口腔黏膜上皮模型及其體外構(gòu)建方法，是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，使用口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株TR146、Tca8113、SCC-4、SCC-9、SCC-25、HN-6、CAL-27中的一種或兩種，經(jīng)體外擴(kuò)增后，采用氣液面培養(yǎng)法，在不同階段使用不同培養(yǎng)體系，使其復(fù)層化，形成體外口腔黏膜上皮模型。
[0008]本
【發(fā)明內(nèi)容】
如下:
一種口腔黏膜上皮模型，所述模型細(xì)胞具有細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基膜的連接結(jié)構(gòu)，并表達(dá)了口腔黏膜上皮相關(guān)蛋白。
[0009]進(jìn)一步地，所用的口腔黏膜細(xì)胞為口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株TR146、Tca8113、SCC-4、SCC-9、SCC-25、HN-6、CAL-27 中的一種或兩種。
[0010]一種口腔黏膜上皮模型的體外構(gòu)建方法，包括以下方法步驟:
步驟一、口腔粘膜鱗狀癌細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
取任一種或兩種口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株，復(fù)蘇擴(kuò)增后，使用P10~P20代細(xì)胞，以胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5.0 X 105個/mL?5.0 X 10 6個/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，加10%胎牛血清的培養(yǎng)液I培養(yǎng)，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻后，置于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)；
所述培養(yǎng)液I，為DMEM，其所含葡萄糖含量為1.0?4.5g/L，谷氨酰胺含量為1.0?10.0mM ；
步驟二、口腔黏膜上皮細(xì)胞液下接種培養(yǎng)
使用一種口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株構(gòu)建時，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以培養(yǎng)液II制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0 X 105個/mL?5.0 X 10 6個/mL，進(jìn)行接種，置于37°C、5%C0 2條件下培養(yǎng)1?5小時；后轉(zhuǎn)入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1?10天，每天換液；
使用兩種口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株構(gòu)建時，分別取對數(shù)生長期細(xì)胞，以培養(yǎng)液II制成單細(xì)胞懸液，按3:1?1:3的比例混合均勻，調(diào)整細(xì)胞密度5.0X101 /mL?5.0X1M"/mL，進(jìn)行接種，置于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)1?5小時；后轉(zhuǎn)入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1?10天，每天換液；
所述培養(yǎng)液II，為在培養(yǎng)液I中，添加人表皮生長因子濃度為0.1?100.0 ng/mL，胰島素濃度為0.1?100.0 ng/mL，氫化可的松濃度為0.1?10.0 μ g/mL，三磷酸腺苷濃度為
1.0?100.0 μ g/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為1.0?100.0 ng/mL，孕酮濃度為1.0?100.0 nM，對輕基苯甲酸丁酯濃度為0.1?10.0 yg/mL，丁二胺濃度為1.0?100.0 μ M，牛腦垂體浸提物濃度為1.0?100.0 μ g/mL,霍亂毒素濃度為1.0?100.0 μ g/L, 二性霉素B濃度為1.0?50.0 mg/L，青霉素濃度為1.0?100.0 IU/mL，鏈霉素濃度為1.0?100.0 μ g/ mL ；
步驟三、口腔黏膜上皮模型氣液面的增殖分化培養(yǎng)
將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換為培養(yǎng)液III，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1?10天，每天換液；再更換為培養(yǎng)液IV，繼續(xù)進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1?10天，每天換液；最后更換為培養(yǎng)液V，繼續(xù)進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1?10天，每天換液，培養(yǎng)結(jié)束，口腔黏膜上皮模型的體外構(gòu)建結(jié)束；
所述培養(yǎng)液III，為在培養(yǎng)液II中，添加CaCl2濃度為20.0?100.0 μ g/mL，維生素C濃度為 10.0 ?50.0 μ g/mL ；
所述培養(yǎng)液IV，為在培養(yǎng)液II中，添加CaCl2濃度為50.0?150.0 μ g/mL,維生素C濃度為 50.0 ?100.0 μ g/mL ；
所述培養(yǎng)液V，為在培養(yǎng)液II中，添加CaCl2濃度為150.0?300.0 μ g/mL,維生素C濃度為 100.0 ?200.0 μ g/mL ο
[0011]進(jìn)一步地，該模型應(yīng)用于口腔護(hù)理產(chǎn)品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、一次性衛(wèi)生用品等產(chǎn)品的安全性及功效性檢測，藥物滲透能力檢測，煙草成分致癌能力檢測，口腔致病菌致病機(jī)理研究。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
采用本發(fā)明提供的方法構(gòu)建的口腔黏膜上皮模型，具有以下優(yōu)點(diǎn):一，口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞系穩(wěn)定可控，可以解決種子細(xì)胞來源困難、細(xì)胞穩(wěn)定性等問題，體外構(gòu)建，重復(fù)性佳，可實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化制備；二，單一細(xì)胞的使用，解決了異種細(xì)胞、成纖維細(xì)胞污染的問題；三，氣液面分段培養(yǎng)法，保證了細(xì)胞在不同階段的不同營養(yǎng)需求，縮短了構(gòu)建時間、降低生產(chǎn)成本；四，培養(yǎng)基中因子的添加，保證了模型的正常復(fù)層化，從而形成了和人體口腔黏膜上皮高度類似的細(xì)胞-細(xì)胞(橋粒)、細(xì)胞-基膜(半橋粒)連接結(jié)構(gòu)，并正常表達(dá)了口腔黏膜上皮相關(guān)蛋白，這種自身結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外微環(huán)境的影響可進(jìn)一步提升模型的屏障功能，最終構(gòu)建的體外口腔黏膜上皮模型與人口腔黏膜上皮組織具有高