專利名稱：含有gax蛋白中涉及轉(zhuǎn)錄抑制和/或與其他蛋白相作用功能域的多肽,相應的核酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療性功能域，更具體地涉及一些治療性新分子和它們治療心血管疾病的應用。
血管成形術后的再狹窄是一種局部過度增殖性疾病，它連續(xù)發(fā)展成為不可外科手術的動脈粥樣硬化斑。因而，血管成形術治療動脈粥樣硬化損傷經(jīng)常產(chǎn)生持續(xù)性再狹窄導致動脈壁的機械損傷(在一些研究中高達50％)。
血管壁中平滑肌細胞的增殖是動脈粥樣硬化的發(fā)展中、血管成形術后的再狹窄中以及冠狀動脈搭橋的失敗中的關鍵事件。平滑肌細胞正常情況下在細胞壁中是靜息的，但在損壞血管內(nèi)皮的損傷之后，它們重與血中的生長因子接觸。與心肌細胞和骨骼肌細胞不同，作為對各種生長因子的反應，平滑肌細胞可以去分化并重新開始它們的增殖循環(huán)。平滑肌細胞的這些表型改變源自于一些基因表達水平的重要變化。例如，當其他結(jié)構(gòu)基因如特異平滑肌α-肌動蛋白的表達及肌漿球蛋白的某些同工形式的表達被負調(diào)節(jié)時，細胞增殖中涉及的一些早熟基因如c-fos或c-myc的表達顯著增高。
盡管已清楚地證明骨骼肌細胞的最終分化由一些稱為肌原性因子的轉(zhuǎn)錄因子如Myo-D調(diào)節(jié)，但迄今平滑肌細胞的可逆性分化中涉及的已知因子很少。最近的研究揭示，在心血管系統(tǒng)的不同組織中存在具有同源框的轉(zhuǎn)錄因子。由于其同源框的緣故，這些因子識別其靶基因啟動子區(qū)中的特異性DNA序列并參與細胞分化增殖或遷移的調(diào)節(jié)。這些gax因子(生長抑制特異性同源框，Growth-Arrest-SpecificHomeobox)之一在不同的心血管組織中表達，包括血管壁的血管平滑肌。該gax基因最早從大鼠的主動脈cDNA庫中找到。它編碼一種303個氨基酸的蛋白。其序列已被鑒定，其cDNA已被克隆(Gorski等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)1993,6,3722-3733)。人的gax基因也已被克隆和測序(David F.Le Page等，基因組(Genomics)1994,24,535-540)。它編碼一種302個氨基酸的蛋白。該gax基因具有一些與gas和Gadd基因相似的特性，因為它看來也控制細胞周期的G0/G1轉(zhuǎn)換。因而大鼠CMLV中的gax的mRNA水平在與PDGF接觸2小時后降低10倍(Gorski等，分子細胞生物學，1993,6,3722-3733)。gax基因的表達因而在CMLV的促有絲分裂反應過程中被抑制。gax基因的另一特征在于其特異性表達。實際上，在成年大鼠中，gax基因絕大部分在心血管系統(tǒng)(主動脈，心臟)中表達。通過Northern印跡沒有表明在肝、大腦、胃和骼肌中存在gax的mRNA。另外，該gax基因?qū)儆谝粋€同種基因的家族。這些基因編碼這樣的轉(zhuǎn)錄因子，它們含有能識別DNA的特定區(qū)域(或同源框)的保守序列(或同源功能域)(見，Gehring等，細胞(Cell),78:211-223,1994)。大鼠gax蛋白的同源功能域含有185-245個氨基酸。有趣的是，迄今已鑒定的這些同種基因均參與胚發(fā)生過程中細胞分化/生長的控制，這強化了該gax基因的治療潛力(見，Lawrence和Morata，細胞78:181-189,1994；Krumlauf，細胞，78:191-201,1994)。
GAX的特征之一是一旦平滑肌細胞增殖它就被負調(diào)節(jié)，所述平滑肌細胞的增殖是在體外響應于生長因子或是在體內(nèi)由于細胞壁的內(nèi)皮損傷。這種抑制是可逆的，因為當通過體外消除血清平滑肌細胞被靜息化時GAX的表達又得以恢復。我們實驗室的工作最近表明GAX借助于腺病毒載體在平滑肌細胞中的過量表達阻斷平滑肌細胞的增殖，F(xiàn)R95/04234(ST95022)。
血管成形術后持繼再狹窄致機械損傷代表了最常發(fā)生的失敗因素(在某些研究中為50％)。平滑肌細胞的增殖是這一現(xiàn)象的一個關鍵因素，認識到GAX的增殖調(diào)節(jié)作用，因而GAX看來是在血管成形術后預防性治療血管壁的可選擇的治療基因，F(xiàn)R95/04234(ST950022)。
但對GAX的作用機制仍很少有報道。GAX同源框的靶DNA序列有待鑒定。另外，迄今還沒有進行對GAX各功能域功能的研究。對GAX各功能部分的鑒定最終構(gòu)成了一個重要方面，從而能夠確定GAX所依賴或處于根源的分子反應。
本發(fā)明準確的意義在于提供這些方面的信息。
在此工作過程中，采用了不同的分析途徑以鑒定與GAX相作用的分子、以確定該相互作用所需要的GAX功能域、及研究不同的功能域在GAX功能中的重要性。為此，使用了雙雜合系統(tǒng)，以從一個人肺文庫中鑒別出與GAX相作用的蛋白。
按此途徑已鑒定了不同的分子，其中之一即Ki抗原特別令人感興趣。Ki抗原是一種約32KDa的蛋白。它第一次作為被來自紅斑狼瘡患者的血清識別的核自身抗原而被鑒定(Nikaido等，1989，臨床實驗免疫學(Clin.Exp.Immunol.)1990,79,209-214)。最近的工作表明Ki在增殖中的細胞中或用癌基因轉(zhuǎn)化的細胞中過量表達(Nikaido等，1989，實驗細胞研究(Exp.Cell Res.)1989,182,284-289，)。共同免疫沉淀實驗(Takeushi等，摘要，1995，日本東京Juntendo大學)表明Ki以與增殖標志PCNA的復合物形式存在(Almendral等，1987，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),84,1575-1579)。
還在哺乳動物細胞的暫時轉(zhuǎn)染實驗中研究了GAX的功能，實驗中使用了與外源DNA結(jié)合功能域融合的GAX和報道基因系統(tǒng)，以獲得刪去分子不同區(qū)域后GAX轉(zhuǎn)錄活性的有關信息。這種抑制活性更具體與GAX的頭32個氨基酸相關。另外，該抑制域位于GAX在酵母中與Ki相互作用所必需的區(qū)域(1-222)中。GAX抑制特征和其與Ki相互作用的潛在應用將在下文描述。
本發(fā)明的第一方面涉及GAX蛋白具有生物特性的片段。
本發(fā)明的另一方面涉及參與GAX生物活性的GAX功能域。特別涉及參與GAX與其他分子相互作用的功能域或負責一種生物活性的功能域。本發(fā)明還涉及含有GAX功能域的嵌合分子。本發(fā)明還涉及GAX抑制基因表達的應用，以及可抑制GAX與某些細胞配體相互作用的化合物在調(diào)節(jié)GAX活性方面的應用。本發(fā)明還涉及篩選和/或鑒別GAX的細胞配體的方法。
如前文所述，gax基因具有特別有利于過度增殖性疾病的治療應用的特點，特別是對于再狹窄或其他與平滑肌細胞增殖相關的疾病。在專利申請FR95/04234(ST95022)中已經(jīng)證明gax基因的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移可顯著降低平滑肌細胞的增殖，以及抑制腔直徑的縮小。專利申請FR95/12871(ST95057)中也證明在腫瘤細胞中表達的gax基因能對抗細胞轉(zhuǎn)化過程。這些不同的特征都證明gax基因在基因治療途徑中的潛力。
本申請現(xiàn)描述GAX功能域的鑒定、具有生物活性的GAX衍生物的構(gòu)建、GAX蛋白配體的鑒定和可用于研究其他配體和鑒別能與這些配體的活性相作用的化合物的方法。更準確地講，本申請人現(xiàn)證明GAX蛋白具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。申請人還證明該活性由GAX蛋白的某些區(qū)域、特別是N-末端區(qū)域所攜帶。實施例中顯示的結(jié)果另外證明GAX的這些功能域還參與GAX與一種分子蛋白Ki的相互作用。文獻中已知Ki與PCNA相作用(Takeushi等，摘要，1995，日本東京Juntendo大學)，它是一種獨立于DNA聚合酶的DNA復制的輔助因子(Fukuda等，1995，生物化學雜志(J.Biol.Chem.270,22527-22534)。這些實施例中還證明Gax與PCNA相作用，因而可設想GAX可能參與細胞中的復制復合物。
本發(fā)明的第一個主題特別涉及一種多肽，其特征在于它是GAX蛋白具有轉(zhuǎn)錄抑制活性和/或正面或負面影響DNA復制的片段的部分或全部。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選至少包含人GAX蛋白的1-32殘基。
按照另一實施方案，本發(fā)明的多肽至少包含人GAX蛋白的104-230殘基。
作為本發(fā)明多肽的具體實例，可以舉出含人GAX蛋白的1-32、33-302和1-104片段的多肽。下文給出的實施例證明這樣的多肽能夠抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而保留了GAX的轉(zhuǎn)錄抑制特性。
更優(yōu)選地，除本發(fā)明的GAX蛋白片段外，該多肽還含有不同來源的片段。不同不來源的片段指不是來源于GAX蛋白的多肽片段。這可以是合成的、人工的片段、蛋白的片段等。這種不同來源的片段可以有各種功能。
例如這種不同來源的片段可以構(gòu)成一種標記，用以檢測該多肽及必要時在體內(nèi)跟蹤該多肽。這種標記例如可以是一種單克隆抗體所識別的表位。對此，在文獻中已描述了許多不同的標記序列(稱為序列標記)并已常規(guī)使用。對此可提及序列標記myc。
這種片段還可以是具有穩(wěn)定多肽特性的片段。這可以是具有高血漿半衰期的蛋白片段或全部。
最后，這種片段還可以是一種靶向元件，可以使該多肽更快和/或更特異性地到達特定的細胞腔室。這最好是核定位信號(NLS)、主要在細胞核中發(fā)揮其活性的多肽。文獻中已描述了各種不同的NLS信號，如SV40病毒T抗原的NLS信號，p53的NLS信號等。
這種不同來源的片段另外可以賦予多肽一種補充生物功能或有利于抑制性功能域的活性。作為一個特別有利的例子，可提及能夠特異性連接DNA的蛋白功能域。這樣此類嵌合分子能與DNA在特定區(qū)域連接并抑制位于該區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄。一個特別的例子是酵母GAL4蛋白的DNA結(jié)合域。在實施例中描述了這種結(jié)構(gòu)。它們可用于調(diào)節(jié)酵母中的基因表達，或調(diào)節(jié)被置于含GAL4蛋白連接位點的表達信號控制下的基因表達。其他DNA結(jié)合性蛋白域例如可為Lex A，核受體如雌激素受體或該家族任何其他成員的DNA結(jié)合域。這還可以是這樣的肽，它一方面允許GAX部分或全部分泌，另一方面允許其靶向膜受體，使其內(nèi)在化從而通過“Bystander”效應提高擴散性和GAX的活性范圍。對此可特別使用轉(zhuǎn)鐵蛋白的部分或全部或能夠識別平滑肌細胞表面的整聯(lián)蛋白的胞外基質(zhì)分子的片段。
本發(fā)明的多肽在治療方面和應用研究方面特別有意義。
本發(fā)明多肽的治療活性更具體是依賴于基抑制轉(zhuǎn)錄或影響DNA復制的能力，與GAX蛋白類似，它們具有調(diào)節(jié)其他蛋白的表達的能力。
在此方面，本發(fā)明還涉及GAX蛋白或所要求的片段抑制基因轉(zhuǎn)錄和/或正面或負面影響DNA復制的應用。
由于與GAX蛋白的行為類似性，這些片段可有利地替代GAX的轉(zhuǎn)錄抑制功能。另外，考慮到這些片段只包括了GAX蛋白參與轉(zhuǎn)錄抑制的功能域的部分或全部，因而可以想到它們對一些GAX蛋白所敏感的改變變得不太敏感。這些多肽本身或其衍生物因而可能顯示出比天然GAX蛋白更強的轉(zhuǎn)錄抑制特性。
還可以想到利用這些多肽鑒定新的GAX蛋白配體。對此，本發(fā)明還有一個主題是，篩選和/或鑒定與GAX蛋白或其功能域相作用的多肽的方法，其特征在于使用本發(fā)明的多肽。更優(yōu)選該多肽選自GAX蛋白的1-32和33-302片段。
對于這一點，申請人意外地證明GAX蛋白的一個功能域可與另一細胞蛋白Ki蛋白特異性地相互作用。如前文所提到的，Ki是在患諸如紅斑狼瘡的自身免疫病時出現(xiàn)的一種自身抗原。已報道作為核分子，其在細胞增殖過程中以及在被癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細胞中表達增高。
我們已在酵母中證明GAX的N-未端部分是與Ki作用所必需的。重組Ki蛋白特異性地識別從變性聚丙烯酯胺凝酸轉(zhuǎn)移到硝基纖維素濾膜上的GAX。
本發(fā)明還具體地涉及一種多肽，其特征在于它是一種能與Ki蛋白相作用的GAX蛋白片段。
更優(yōu)選該多肽是GAX蛋白的1-32或104-223片段。
申請人還很意外地證明GAX蛋白的一個功能域可特異性地與增殖標記PCNA(增殖性細胞核抗原，Proliferating Nuclear Autigen)特異性地相互作用。該因子負責DNA的復制，還在DNA的修復現(xiàn)象中起作用。
因而本發(fā)明還涉及一種多肽，其特征在于它是一種能與PCNA相作用的GAX蛋白片段。
另外，文獻報道Ki以與PCNA的復合物形式存在。因而Ki同時與GAX和PCNA相作用，與這兩種蛋白一之形式至少兩元復合物，優(yōu)選三元復合物。這些復合物的形成在細胞周期的進展中起重要作用(活化或抑制)。
因而本發(fā)明還涉及一種多肽，其特征在于它是種能與Ki和/或PCNA相作用并與這些蛋白形成至少兩元或至少三元復合物的GAX蛋白片段。
本發(fā)明的另一主題涉及編碼如上所定義的多肽的任何核酸。這可以是天然或人工來源的序列，特別是基因組DNA、mRNA、雜合序列或合成或半合成序列。這種核酸可以來源于人、動物、植物、細菌、病毒等。這種核酸可通過本領域技術人員已知的任何技術獲得，特別是篩選文庫、化學合成、或混合方法，包括對文庫篩選獲得的序列進行化學或酶的修飾。另外，它們還可以被插入在載體中，如質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的核酸有利地為cDNA。
本發(fā)明的核酸可用于制備探針或反義分子，通過雜交檢測編碼含本發(fā)明抑制域多肽的核酸的存在或表達，或抑制這種多肽的表達。對于探針來說，優(yōu)選含有10個以上的堿基，最好是10-300個堿基。
本發(fā)明的核酸可用于在細胞或基因治療方法中體外、體內(nèi)或離體表達和/或生產(chǎn)多肽。
對此，本發(fā)明涉及含有在啟動子(允許其表達)控制下的如上所定義的核酸的表達盒。
在本發(fā)明中可以使用各種啟動子。這可以是允許在哺乳動物細胞中表達的序列。
啟動子最好選自在人細胞中有功能的啟動子。更優(yōu)選允許在過度增殖性細胞(癌、再狹窄等)中表達核酸序列的啟動子。對此，可以使用各種啟動子?？梢允谴碳せ蛞种苹蜣D(zhuǎn)錄的啟動子或衍生序列，它的作用可以是特異性或非特異性的，可誘導的或不可誘導的、強的或弱的?？梢蕴貏e提到真核或病毒基因的啟動子序列。在真核啟動子中，特別可以使用遍在啟動子(HPRT、PGK、α-肌動蛋白、微管蛋白、DHFR等基因的啟動子)、中間絲啟動子(GFAP、結(jié)蛋白、波形蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白等基因的啟動子)、治療基因的啟動子(例如MDR、CFTR、第八因子、ApoAI等基因的啟動子)、組織特異啟動子(丙酮酸激酶、絨毛蛋白、脂肪酸結(jié)合腸蛋白、平滑肌α肌動蛋白基因的啟動子)、分裂狀態(tài)細胞類的細胞特異性啟動子(如癌細胞)、或應答于某種刺激的啟動子或稱為可誘異啟動子(類固醇激素的受體、視黃酸受體、糖皮質(zhì)激素受體等)。同樣，可以是源自病毒基因組的啟動子序列，例如腺病毒E1A和MLP基因的啟動子、CMV的早熟啟動子或RSV之LTR的啟動子。另外，這些啟動子區(qū)可通過加入活化序列、調(diào)節(jié)序列進行修飾，或允許組織特異性或選擇性表達。
本發(fā)明現(xiàn)提供新的治療劑，其通過轉(zhuǎn)錄抑制能力干預許多細胞功能障礙。為此，本發(fā)明的核酸或表達盒可被注射在如待治療的位點，或與待催毀或處理的細胞直接保溫。已報道裸核酸可以不用特別的載體而穿入細胞中。但本發(fā)明中優(yōu)選使用載體給藥，以改善(ⅰ)細胞穿透效力；(ⅱ)命中率和(ⅲ)細胞內(nèi)外的穩(wěn)定性。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，核酸或表達盒被插入在表達載體中。所用的載體可以是化學來源的(脂質(zhì)體、納米顆粒、肽復合物、脂質(zhì)或陽離子聚合物等)、病毒來源的(逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、AAV、痘病毒等)或質(zhì)粒來源的。
病毒載體的使用是基于病毒感染的天然特性。因而可能使用例如腺病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關病毒。這些載體顯示出特別好的轉(zhuǎn)染性能。對此，本發(fā)明的優(yōu)選主題是缺陷性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，在其基因組中含有如上所定義的核酸。本發(fā)明另一特別的主題是基因組中含有如上所定義核酸的缺陷性重組腺病毒。
本發(fā)明的載體還可以是一種能促進核酸向真核細胞轉(zhuǎn)移并表達的非病毒物質(zhì)?；瘜W的、生化的、合成的或天然的載體可作為天然病毒的有利替代品，尤其由于方便、安全及對待轉(zhuǎn)染DNA的大小沒有理論限制等方面的原因。這些合成載體有兩個主要功能，包緊待轉(zhuǎn)染的核酸和促進其在細胞上固定以及穿過漿膜，必要時穿過兩層核膜。為了掩蓋核酸的多陰離子性質(zhì)，非病毒載體總帶有多個陽性電荷。
本發(fā)明中所用的核酸或載體可以著眼于表皮、口服、非腸胃、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、透皮等給藥途徑進行配制。這些核酸或載體優(yōu)選以可注射的形式使用。因而可以與可藥用載體混合以制成可注射制劑，特別是在待治療部位直接注射。這特別可以是滅菌等滲溶液或干組合物，特別是凍干品，后者在根據(jù)情況加入無菌水或生理血清后可構(gòu)成可注射溶液。所用的核酸劑量可根據(jù)不同的參數(shù)調(diào)節(jié)，特別是根據(jù)基因、載體、所用的給藥方式、相關疾病或?qū)で笾委煹臅r間長短。
本發(fā)明還涉及含有至少一種如上所定義的核酸的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及含有至少一種如上所定義的載體的藥物組合物。
由于其抗增殖特性，本發(fā)明的藥物組合物特別適于治療過度增殖性疾病，特別是癌和再狹窄。因而本發(fā)明提供一種殺滅細胞、特別是過度增殖性細胞的特別有效的方法。本發(fā)明因而可用于殺滅腫瘤細胞或血管壁的平滑肌細胞(再狹窄)。本發(fā)明特別適于癌癥的治療。例如可舉出結(jié)腸腺癌、甲狀腺癌、肺癌、髓細胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、B型淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、成膠質(zhì)細胞瘤、肝癌、骨癌、皮膚癌、胰癌或腎癌和前列腺癌、食道癌、喉癌、頭頸癌、HPV陽性的男性生殖器癌、EBV陽性的鼻咽癌等。
另外，本發(fā)明還涉及能抑制Ki蛋白和/或PCNA的活性的化合物在抑制平滑肌細胞增殖中的任何應用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物與Ki蛋白和/或PCNA形成二元或三元復合物以正面或負面影響細胞周期之進展的應用。
參照以下實施例和附圖將更全面地描述本發(fā)明，這些實施例和附圖應視為說明性質(zhì)而非限制性質(zhì)的。


圖1用從不同組織提取的RNA對Ki蛋白表達的northern印跡分析。
圖2用免疫熒光法在轉(zhuǎn)染細胞中的KiHA核定位。
圖3Ki蛋白與GAX間的體外相互作用A)考馬氏藍
B)Far Westren印跡圖4A)人工啟動子控制下的表達細菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的報道基因的構(gòu)建示意圖。
B)用分別攜帶ER、GAL VP16和ER-GAL VP16的表達載體轉(zhuǎn)染后，在細胞提取物中測定CAT的酶活性。
圖5各種GAX缺失突變物建體與整個1-302GAX蛋白的比較。
圖6測定不同嵌合體GAL-GAX的CAT酶活性A)無活化子ERB)有活化子ER。
圖7:GST-GAX與PCNA間的相互作用。
材料和方法A)材料1)所用的酵母菌株使用釀酒酵母屬的YCM79菌株(MATa,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,Leu2-3,112,can1,gal4-542,gal80-538,met16::VRA3-pGAL1/10-LacZ,HIS3::GAL7BLE)作為雙雜合系統(tǒng)篩選肺融合文庫的工具。
該菌株培養(yǎng)在如下培養(yǎng)基上完全YPD培養(yǎng)基-酵母提取物(10g/l)(Difco)-細菌用蛋白胨(20g/l)(Difco)-葡萄糖(20g/l)(Merck)加入20g/l瓊脂(Dicfco)使該培養(yǎng)基固化。
基本YNB培養(yǎng)基-酵母氮基(Yeast Nitrogen Base)(無氨基酸)(6.7g/l)(Difco)-葡萄糖(20g/l)(Merck)加入20g/l瓊脂(Difco)使該培養(yǎng)基固化。
為了使營養(yǎng)缺陷型酵母能在此培養(yǎng)基上生長，需要向其中加入氨基酸或含氮堿，其濃度為50mg/ml。2)所用的細菌菌株基因型為supE、hsdD5、thi、D(lac-pro AB)、F’[tra D36 proA+B+lacIqlacZDM15]的大腸桿菌菌株GT1用作所用重組質(zhì)粒擴增和分離的工具。
為了生產(chǎn)重組蛋白，所用的大腸桿菌是從Pharmacia E.coli獲得的BL-21菌株。它們具有基因型F-omp T hsd Sb(rbmb-)gal dcm(DE3)。
選擇BL-21作為重組蛋白的生產(chǎn)菌株是因為它不具有蛋白酶并且它的膜脆弱，易于用簡單的超聲處理破碎。大腸桿菌BL-21具有T7 RNA聚合酶的抑制系統(tǒng)。這種抑制可由IPTG解除，這可控制置于T7 RNA聚合酶結(jié)合位點下游的基因。這些細菌在37℃攪拌下在2ml LB培養(yǎng)基(NaCl 5g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l)中培養(yǎng)過夜。將1ml該預培養(yǎng)物37℃下在50ml 2×YT培養(yǎng)基(NaCl 5g/l，胰蛋白胨16g/l，酵母提取物10g/l)中培養(yǎng)，直到細菌達到600nm處光密度(O.D.)0.4(指數(shù)生長期)。在冰上冷卻該細菌培養(yǎng)物。3300rpm下離心20分鐘。
用氯化鈣法制備重組蛋白生長的感受態(tài)大腸桿菌。為此，在5ml0.1M CaCl2中培養(yǎng)細菌(接種量1/10)。再以3300rpm離心10分鐘。將細菌重溶在含17.5％甘油的1ml 0.1M CaCl2中。分份保存在-80℃下。3)所用的質(zhì)粒所用的質(zhì)粒為·pGBT和pAS系列的載體(Clontech)，具有細菌的和酵母的復制起點的穿梭質(zhì)粒，其在這兩種微生物中能以高拷貝數(shù)復制。這些質(zhì)粒含有一個多克隆位點，其位于編碼GAL4 DNA結(jié)合功能域之序列的下游，及形成融合蛋白的終止子的上游。這些質(zhì)粒還含有釀酒酵母的TRP1基因，它能補充trp1基因型的酵母以在不含有色氨酸的基本培養(yǎng)基上挑選。這些載體帶有氨芐青霉素抗性基因，用于在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑選含有這種抗性的細菌。
·pGAD系列的載體(Clontech)，能夠在酵母中表達如下融合蛋白的載體GAL4的反式活化功能域與目標蛋白，或來自肺文庫的cDNA所編碼的蛋白，基因插入在載體EcoRⅠ和XhoⅠ位點上。
·pET29系列的載體(Novagen)，能在大腸桿菌中以與tagS融合形式表達重組蛋白的載體。
·pGEX系列載體(Pharmacia)，能在大腸桿菌中以與谷脫甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)之融合蛋白形式表達重組蛋白的載體。
·Bluescript系列載體(Strata gene)，能進行克隆的載體，以及pIC系列(J.Lawrence Marsh等，基因(Gene),1984,32,481-485)和pMTL系列(Steve P.Chambers等，基因，1998,68,139-149)載體。
·質(zhì)粒pGEX-2T-hGAX是用于大腸桿菌BL-21轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。該質(zhì)粒是從pGEX-2T質(zhì)粒獲得的，由波士頓圣伊麗沙白醫(yī)學中心(St.Elizabeth’s Medical Center)的K.Walsh博士提供?；A質(zhì)粒pGEX-2T(Pharmacia)可產(chǎn)生GAX與谷脫甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白，所述酶是一種與谷脫甘肽有強親和力的蛋白。GST-GAX的融合有利于GAX在與谷脫甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖小珠中進行親和純化。另外，存在溶血酶切割位點，可隨后分割GST和GAX間的嵌合。將hGAX cDNA插入在雜合啟動子tac和lac操縱子的控制之下。抑制劑lacⅠ與操縱子lac結(jié)合，阻止RNA聚合酶前進。這種抑制被乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)解除，后者與lacⅠ結(jié)合。lacⅠ-IPTG復合物不再與操縱子lac結(jié)合，RNA聚合酶從而不再被阻礙。4)Ki蛋白生產(chǎn)和純化我們從在酵母中所得質(zhì)粒pGAD將Ki蛋白與myc表位融合形式的基因克隆在質(zhì)粒pET-29(Novagen)中。PET-29質(zhì)粒產(chǎn)生與稱為S-Tag的表位融合的蛋白，這得以在與S-蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖小珠上親和純化KI。嵌合的SmycKI處于T7啟動子和lac操縱子控制之下。BL-21用質(zhì)粒pET-29-mycKI轉(zhuǎn)化。如GST-GAX蛋白那樣，將細菌培養(yǎng)至600nm處O.D.值為0.7。然后用0.1mM IPTG和BL-21產(chǎn)生的T7 RNA聚合酶誘導SmycKI的表達。然后按如下方法純化上清液。SmycKI的純化通過與S-蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖小珠上的親和來進行。該方法與GST-GAX的相同，只是樹脂用含有20mM TrispH7.5、0.15m NaCl和0.1％TritonX-100的溶液洗滌。洗脫和透析與GST-GAX的相同。B)方法分子生物學中所用的常規(guī)方法是本領域技術人員熟知的，并在文獻中有充分的描述[Maniatis T.等，“Molecular Cloning,aLaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y,1982；Ausubel F.M.等(編)，“Current Protocols inMolecular Biology”,John Wiley & Sons,New York,1987]。
1)雙雜合系統(tǒng)該系統(tǒng)是通過在釀酒酵母體內(nèi)相互作用的一種克隆方法，其原理是依據(jù)酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4(7)的結(jié)構(gòu)。GAL4轉(zhuǎn)錄的活化子有兩個具不同功能的獨立功能域。DNA結(jié)合域(GALDB，即GAL DNA Binding)使GAL4固定在基因啟動子區(qū)的特異DNA序列上。因而GAL4在空間上接近轉(zhuǎn)錄機器，由于其反式活化域(GALTA)的作用，它能提高相鄰基因上的轉(zhuǎn)錄啟動頻率，可能是通過與RNA聚合酶或相關蛋白的相互作用起作用。這種雙雜合系統(tǒng)的原理是將GALDB和GALTA分別與不同的蛋白X和Y融合，當它們相互作用時就形成了活性轉(zhuǎn)錄復合物。2)用PCR技術(聚合酶鏈式反應)進行酵母篩選直接對酵母用進行了篩選。將每個酵母菌落溶于含0.08％Tween20的10μl水中。Tween是一種非離子洗滌劑，可在95℃加熱的第一階段中提高酵母的裂解。在以后的階段中，Tween20作為Taq DNA聚合酶的保護劑。將酵母懸液補充至20μl終體積，其中含有下述量或終濃度10pmol引物1、10pmol引物2、1單位Taq DNA聚合酶、75mMTris pH9、20mM(NH4)2SO4、0.01％Tween20、2.5mM MgCl2和125μM各種脫氧核糖核酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)。PCR結(jié)束之后，對一部分混合物進行瓊脂糖凝膠分析。從而對于一對給定的引物和每個酵母克隆，可知是不是涉及已鑒定的DNA序列。3)質(zhì)粒DNA的制備用Promega的DNA快速制備試劑盒制備大量DNA。
按如下方法制備小量的DNA含有質(zhì)粒的細菌在搖瓶中2ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少4小時。然后在Ependorf管中以14000rpm離心2分鐘，然后將沉淀重懸于100μl溶液Ⅰ中(50mM葡萄糖，25mM Tris HCl緩沖液pH8、10mM EDTA pH8)，在200μl溶液Ⅱ中(0.2M NaOH,1％SDS)中裂解。該裂解溶液隨后用150μl溶液Ⅲ(3M醋酸鉀、11.5％(v/v)冰醋酸)中和。搖動試管直到形成絮狀沉淀，加入150μl苯酚/氯仿混合物(50％苯酚，50％水飽和的氯仿)，搖動整個混合物30秒鐘。14000rpm離心2分鐘后回收含有DNA的水相。然后加入0.5體積的異丙醇沉淀DNA,14000rpm下離心5分鐘，風干，最后溶在20μl TE RNAse(含50μg/ml RNAse的10mM Tris-HCl、1mM EDTA溶液)中。4)DNA的酶合成及擴增或PCR(聚合酶鏈式反應)在存在DNA引物、dNTP(0.2mM)、PCR緩沖液(Tris-HClpH8.510mM,MgCl21mM,KCl 5mM，明膠0.01％)、0.5μg每種寡核苷酸和2.5國際單位Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)及存在或不存在甲酰胺(5％)下，在100μl終體積中進行PGR反應。該混合物用2滴石蠟油覆蓋以限制樣品的蒸發(fā)。所用的儀器為Appli gene的“CrocodileⅡ”。我們使用的模板變性溫度為90℃，寡核苷酸與模板的雜交溫度低于寡核酸分離溫度5-10℃度，酶延伸溫度為72℃。
用于克隆的PCR片段在克隆后再進行系統(tǒng)測序，以驗證不存在擴增中出現(xiàn)的可能突變。
寡脫氧核苷酸是利用β-氰基乙基保護基團按亞磷酰胺方法化學合成的(Sinha,1984)。合成后，用氨處理除去保護基團，用丁醇沉淀2次以純化和濃縮寡脫氧核苷酸(Sawadogo,1991)。DNA的濃度用260nm處的光密度測定。5)連接所有的連接反應均在100-200ng載體、0.5-2μg插入片段、40國際單位T4 DNA連接酶(Biolabs)和連接緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.8；10mM MgCl2；10mM DTT；1mM ATP)存在下在10μl終體積中于+14℃下進行一夜。陰性對照是沒有插入片段的載體連接。凸起的5’端需要時在連接前按供應商的說明用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段(Biloabs)補平。3’凸起末端按制造商的說明用T4噬菌體的DNA聚合酶(Biolabs)破壞。6)細菌的轉(zhuǎn)化按下述方法用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌總體積10μl的連接混合物用于轉(zhuǎn)化TG1細菌，后者用Chung等的方法轉(zhuǎn)化為感受態(tài)(PNAS,1988,86,2172-2175)。
將TG1細菌37℃搖動下在恒溫箱中的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾個小時，直到600nm處的OD值為0.6。然后將培養(yǎng)基以6000rpm離心10分鐘。將細菌沉淀用相當于原始培養(yǎng)基體積1/10的TSB(LB培養(yǎng)基+100g/l PEG4000,5％DMSO,10mM MgCl2、10mM MgSO4)重懸，使細菌轉(zhuǎn)化為感受態(tài)。4℃培養(yǎng)30-60分鐘后，將200μl細菌在冰上與連接反應產(chǎn)物接觸15分鐘。加入200μl LB后，37℃培養(yǎng)細菌30分鐘，然后涂在LB培養(yǎng)基+氨芐青霉素上。7)DNA的分離和提取用電泳按大小分離DNA。為此，根據(jù)待分離的片段大小使用不同的凝膠-TBE緩沖液(9mM Tris堿；90mM硼酸；2mM EDTA)中的1％瓊脂糖凝膠(Gibco BRL)，用于分離大DNA片段(大于500bp)。
-TBE緩沖液中的2％NuSieve瓊脂糖凝膠(FMC Bioproducts)，用于分離小片段(小于500bp)。
在瓊脂糖或聚丙烯酸胺凝膠上的遷移都是在TBE緩沖液中在分子量標志(1Kb梯度，Gibco BRL)存在下進行的。在上樣于凝膠上之前，將DNA與1/10體積的點樣藍(200g/l Ficol1、0.5g/l溴酚藍50mMEDTA)混合。在100伏下遷移和用溴化乙錠(濃度為0.5μg/ml凝膠)染色后，條帶可在紫外燈下看到。
從瓊脂糖凝膠的條帶提取DNA是按如下電洗脫方法進行的用解剖刀切下含有DNA片段的膠條，將其置于用兩個夾子封口并含有100-500μl TBE的透析袋中。然后整個置于一電泳槽中，施加100伏的電場。走出凝膠后，DNA經(jīng)兩次酚/氯仿提取和兩次氯仿提取來純化，然后在0.3M醋酸鈉和2.5體積無水乙醇存在下沉淀。離心(14000rpm,5分鐘)后，干燥DNA沉淀，然后重溶在20μl水中。8)質(zhì)粒DNA的熒光測序按照Sanger的方法用帶不同熒光標記的4種二脫氧核苷酸進行測序。摻入這些二脫氧核苷酸中的一種就使待測序DNA的Taq聚合酶復制中止。該反應將給出不同大小的DNA片段，均以3’端的4種二脫氧核苷酸之一結(jié)束。
將1μg質(zhì)粒和4pmol引物加至由Applied Biosystems提供的稱為Prism的9.5μl預混物中。終體積應為20μl，用于進行25個循環(huán)的PCR反應，所述循環(huán)為96℃變性30秒，50℃雜交15秒和60℃延伸4分鐘。
擴增后獲得的DNA片段在排阻柱(Chromaspin-30,Clontech產(chǎn)品)上純化，然后在Speed Vac中干燥。重溶于5μl由24μl EDTA(50mM)和120μl去離子甲酰胺形成的混合物中。96℃變性3分鐘后，將3-5μl上樣于電泳凝膠上。不同的DNA片段按其大小被分離，順序通過370 DNA測序儀(Applied Biosystems)的激光閱讀器，在此檢測不同的熒光。9)肺文庫(Clontech)質(zhì)粒的制備肺cDNA融合文庫以細菌的形式出售。該文庫在質(zhì)粒pGAD424(見材料和方法)的EcoRⅠ-XhoⅠ位點克隆相應于人肺細胞總RNA的cDNA后產(chǎn)生的。
在驗證文庫后，將預先置于8ml LB中的2μl肺融合文庫細菌以非鋪滿形式涂在固體培養(yǎng)基上，以保證該文庫的代表性。我們涂了16個含LB+氨芐青霉素的770ml培養(yǎng)皿。將每個培養(yǎng)皿中出現(xiàn)的菌落收集在30mlLB+氨芐毒霉素液體培養(yǎng)基中。然后將所得懸液置于錐形瓶中，在搖床上37℃培養(yǎng)3小時。然后用Maxiprep技術從這些菌株提取DNA，在260nm處測定DNA的濃度。10)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母將在100ml液體培養(yǎng)基中預培養(yǎng)的酵母在3000rpm離心3分鐘后收集，懸浮在1ml無菌水中。3000rpm離心3分鐘后，將細胞沉淀重懸在1ml無菌水中，然后再次離心。再重復一次該操作以除去任何痕量的培養(yǎng)基。然后將酵母置于1ml轉(zhuǎn)化溶液Ⅰ(0.1M LiAc,10mMTris-HCl pH7.5,1mM EDTA)中，然后在3000rpm下離心3分鐘。將細胞沉淀再次重懸在1ml轉(zhuǎn)化溶液Ⅰ中。將50ml該酵母懸液與50μg鮭魚精子DNA和1-5μg質(zhì)粒DNA接觸。然后加入300μl轉(zhuǎn)化溶液Ⅱ(0.1M LiAc,10mM Tris-HCl pH7.5,1mM EDTA，于40％PEG4000中)，然后在28℃培養(yǎng)30分鐘。將該轉(zhuǎn)化混合物在40℃水浴中熱休克15分鐘，然后以15000rpm離心1分鐘以收集細胞沉淀。將該沉淀重懸于200ml水中，然后涂在含瓊脂不含相應于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒所攜帶標志的氨基酸的基本培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)該酵母72小時。
在用肺cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母的特例中，按下進行操作所用的酵母含有質(zhì)粒pGAL4DB-GAX，它表達與GAL4的DNA結(jié)合域融合形式的GAX蛋白。將該酵母28℃搖動下在250mlYPG基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到達到107細胞/ml的密度。3000rpm離心10分鐘收集細胞，重懸于250ml水中。再次離心后，將細胞沉淀重懸在100ml水中并再次離心。將沉淀重懸在轉(zhuǎn)化溶液Ⅰ中，在28℃搖動下培養(yǎng)1小時。離心后再將細胞重懸于2.5ml轉(zhuǎn)化溶液Ⅰ、100μl肺DNA文庫和20ml轉(zhuǎn)化溶液Ⅱ中，然后28℃搖動下培養(yǎng)1小時。對該轉(zhuǎn)化混合物于42℃進行熱休克20分鐘。然后重復離心(3000rpm下5分鐘)3次，每次將沉淀收集在10ml無菌水中。第三次的沉淀收集在2.5mlPSS中，這樣就消除了對細胞有毒性的PEG。2.4ml該懸液用于接種250ml含有氨基酸His、Lys、Met和堿基Ura和Ade的基本培養(yǎng)基，在28℃搖床中培養(yǎng)過夜。100μl該懸液用于驗證轉(zhuǎn)化的效率，為此，將該懸液稀釋至10-2、10-3和10-4。將該過夜培養(yǎng)物離心(3000rpm5分鐘)，用無菌水洗2次。將沉淀重懸于2.5ml水中。將其中2.4ml用無菌水稀釋至10ml，用于接種10個含有YNB+Lys+Met+His+Ade培養(yǎng)基的435ml培養(yǎng)皿，然后培養(yǎng)3天。留下的100μl用于測定轉(zhuǎn)化率時的相同操作，以確定過夜培養(yǎng)中菌落數(shù)的擴增率。11)酵母DNA(基因組的和質(zhì)粒的)的制備將一平均環(huán)(anse)量的酵母克隆置于200μl TELT溶液(2％Triton X100,1％SDS、100mM NaCl,10mM Tris pH8,1mM EDTA)中，其中存在3g直徑450μm的玻璃珠和200μl酚/氯仿。將該混合物渦旋15分鐘，然后以14000rpm離心2分鐘。不用取出蛋白餅而收集上清液，該相中所含的DNA用2.5體積的無水乙醇沉淀。以14000rpm離心2分鐘后，干燥DNA沉淀并重溶于20μl TE-RNAse中。該DNA溶液相當于基因組DNA和質(zhì)粒DNA的混合物，直接用于轉(zhuǎn)化細菌。只有質(zhì)粒DNA能夠在細菌中復制，并可用miniprep技術分析。12)β-半乳糖苷酶活性的測定將一硝基纖維素膜預先鋪在含有獨立酵母克隆的Petri培養(yǎng)器上。由于吸附現(xiàn)象，這樣就得到了克隆位置的真實影象。然后將該膜浸在液氮中30秒鐘，以爆裂酵母從而釋放β-半乳糖苷酶活性。解凍后，將該硝基纖維素膜菌落朝上鋪在另一個含有Whatman濾紙的Petri培養(yǎng)器上，所述濾紙預先用1.5ml PBS溶液(60mM Na2HPO4,40mM NaH2PO4,10mM KCl,1mM MgSO4,pH7)和10-30μl 50mg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的N,N-二甲基甲酰胺溶液浸透。然后將該培養(yǎng)皿放在37℃恒溫箱中，封蓋以避免干燥。藍顏色出現(xiàn)的時間可以很不相同，為幾分鐘到幾小時。該試驗應在作用機制清楚并迅速變藍的陽性對照存在下進行。13)表達載體和報道基因的構(gòu)建a)表達載體雌激素受體(ER)的cDNA從小鼠子宮總RNA提取物借助于商品試劑盒(Pharmacia的第一鏈cDNA合成試劑盒)通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)獲得，然后PCR擴增。我們使用了一對特異性引物，其在5’端與ER的頭20個核苷酸雜交，在第一密碼子緊上游引入一個EcoRⅠ位點(5’-gagcgaattcATGACCATGACCCTTCACAC SEQ ID NO.6，小寫的核苷酸代表EcoRⅠ位點，下劃線的大寫核苷酸為第一密碼子)，在3’端另一引物從ER的終止密碼子開始，也引入一個EcoRⅠ位點(5’-gagcgaattc ACTGATCGTGTTGGGGAAGC SEQ ID NO.7，小寫核苷酸代表EcoRⅠ位點，下劃線大寫核苷酸代表終止密碼子)。將所得PCR片段純化，用EcoRⅠ消化，然后克隆在表達載體pCDNA3(Invitrogen)的相同位點上。該載體稱為pCMV-ER。還在pCDNA3載體中克隆了與GAL4 DNA結(jié)合域融合的不同缺失突變的GAX(pCMV-GALDB/GAX，見實施例9)。b)報道基因根據(jù)Martinez等(Martinez等，1991，分子細胞生物學，11,2937-2945)描述的策略構(gòu)建了報道基因，只是所用的克隆載體為pG5CAT(Clontech,CAT=氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。我們合成了一種含有兩個特異位點(黑體字母)的雙鏈寡核苷酸(如下)，一個位點是GAL4的DNA結(jié)合域識別的位點(Gal-17mer,Carey等，1989，分子生物學雜志，209,423-432)，另一個位點是“雌激素反應性元件”(EstrogenRosponsive Element,ERE,Beato H.1989，細胞56,335-344)的保守序列，其與雌激素的受體結(jié)合。該寡核苷酸接頭突出的5’XhoⅠ位點和3’XbaⅠ位點，以便能將其克隆在pG5CAT的XhoⅠ和XbaⅠ位點上。SEQ ID N°8tcgagAGGTCATATTGACCTaagcttCGGGTCGGAGTACTGTCCTCCGACTGCcatatgtcTCCAGTATAACTGGAttcgaaGCCCAGCCTCATGACAGGAGGCTGACGgtatacagatcXhoⅠERE Gal-17mer XbaⅠ該報道基因(pEREG1CAT，圖4，實施例11)的原理為，ER為一轉(zhuǎn)錄活化子，其(對于鼠ER來說)具有組成性活性，ER與其天然配體17-β雌二醇結(jié)合時該活性提高。Matinez等用該系統(tǒng)研究ER與第二轉(zhuǎn)錄因子NF1間的協(xié)同作用，其中NF1的轉(zhuǎn)錄活化域已與酵母GAL4蛋白的DNA結(jié)合域(GALDB)融合。因而該報道基因能報道僅由這些轉(zhuǎn)錄因子之一或其合作引起的轉(zhuǎn)錄率，而沒有由內(nèi)源分子引起的干擾。該系統(tǒng)使我們得以研究與GALDB融合的GAX蛋白全部或部分的轉(zhuǎn)錄活性(圖5,6，實施例12,13)。
構(gòu)建了在CMV啟動子控制下表達熒光素酶基因的質(zhì)粒(pCMV-Luc)。將含有CMV啟動子的pCDNA3載體(Invitrogen)的PCR片段(5’和3’側(cè)翼有BamHⅠ位點)克隆至載體pGL3-Basic(Promega)的BglⅡ位點中獲得這一構(gòu)建體。該質(zhì)粒在以下所有暫時轉(zhuǎn)染實驗中用作內(nèi)標。14)暫時其轉(zhuǎn)染實驗在鼠胚成纖維細胞NIH-3T3(ATCC)中進行了所有研究。這些細胞常規(guī)保持在補有100U/ml青霉素(GIBCO)、100μg/ml鏈霉素(GBCO)、2mM谷氨酰胺(GBCO)和10％胎牛血清(SVF,GIBCO)的DMEM(GIBCO)中。該培養(yǎng)基簡稱為DMEM-GPS/SVF。
為了進行暫時轉(zhuǎn)染實驗，將NIH-3T3以100000細胞/孔的密度接種在一個24孔培養(yǎng)板(Falcon)上，每孔中有1ml DMEM-GPS/SVF。16-20小時后，細胞粘附和涂布后，用0.5ml DMEM-GPS(無SVF)洗滌，然后重懸在0.5ml DMEM-GPS中。然后在每個培養(yǎng)孔中加入50μl轉(zhuǎn)染混合物。該混合物如下表3中所示獲得。
表3

*編號為1-4的不同混合物設計用來分別研究啟動子EREG1CAT的基礎活性、單獨ER或GADB/GAX的活性，及最終ER和GALDO/GAX的共同效應。**pCDNA3用來補充每種混合物至共10μg。***lipofactamine(Gibco)以8/1的比例使用(1ipofectamine/DNA)。
在標準培養(yǎng)條件下將細胞與不同的轉(zhuǎn)染混合物于37℃接觸4小時。轉(zhuǎn)染混合物中的DMEM-GPS然后用1ml DMEM-GPS/SVF代替，再將細胞保持培養(yǎng)24小時。每次轉(zhuǎn)染至少在4個孔中進行。
在24小時末，用0.5ml Dulbecco’s PBS(GIBCO)洗滌細胞，收集在0.5ml 0.2％胰蛋白酶的PBS溶液(GIBCO)中。用10μl SVF中和胰蛋白酶。以10000g離心該細胞懸液2分鐘，取出上清液，然后將細胞重懸于150μl 0.25 M Tris-HCl pH7.8中。50μl該懸液用于根據(jù)試劑盒“Luciferase Assay System”(熒光素酶檢測系統(tǒng))(Promega)用LUMAT LB 9501熒光光度計(EG&G Berthold)測定熒光素酶的活性。剩余的150μl中的細胞胞漿蛋白通過5次凍/融循環(huán)(液氮/37℃)來提取。這些提取物就熒光素酶活性被歸一化，然后它們用于按Goman等(Gorman等，1982，分子細胞生物學，5,1044-1051)描述的方法測定CAT活性。15)Ki蛋白與GAX間的體外相互作用用Far-Western印跡方法進行測定。
作為Western印跡，是在變性凝膠上電泳分離蛋白質(zhì)、然后蛋白質(zhì)被電轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，并直接或間接地免疫檢測。而Far-Western印跡是增加了固定在硝基纖維素膜上的靶與溶液中的因子間蛋白相互作用步驟的Western印跡。a)電泳將樣品在蛋白質(zhì)變性緩沖液中95℃加熱10分鐘，其中緩沖液含有50mM Tris pH6 8、2％SDS(十二烷基硫酸鈉)、10％甘油、300mMβ-硫基乙醇和0.1％溴酚藍。將10ml樣品加載在14％Tris-甘氨酸丙烯酰胺凝膠(Tris-Glycine Gels,Novex)上。在蛋白質(zhì)分離緩沖液(35mM SDS,1.92M甘氨酸和85mM Tris pH8.3)中在120V的恒電壓下遷移1小時。通過有色可轉(zhuǎn)移的分子量標準(MultiMark TM Multi-Colored Standard,Novex)的平行遷移可確定蛋白質(zhì)的分子量。準備兩份凝膠，其中之一用考馬氏藍(30％甲醇，60％水，10％乙酸，0.1％考馬氏藍)平行染色。染色進行1小時。更換幾次脫色溶液(30％甲醇，10％乙酸，60％水)在幾小時內(nèi)進行脫色。該方法的檢測限為50ng蛋白質(zhì)。該染色凝膠使我們能看到加載的所有蛋白。另一份凝膠用于“Far-Western印跡”。b)向硝基纖維素膜的半干轉(zhuǎn)移將硝基纖維素膜(Amersham的Hybond C)和膠放在3張用轉(zhuǎn)移緩沖液(150mM甘氨酸、25mm Tris、20％甲醇，足量水至1升，pH8.3)預浸的Whatman濾紙間。在2.5mA/cm2膠下進行轉(zhuǎn)移40分鐘(MilliblotTM-Graphite Electroblotter Ⅱ儀器，Millipore)。C)蛋白-蛋白相互作用將該膜在含5％(w/v)脫脂牛奶粉(Gloria)和0.2％(v/v)Tween20的PBS中攪拌及室溫下飽和30分鐘。然后在攪拌及室溫下在含5％(w/v)脫脂牛奶粉(Gloria)、0.2％(v/v)Tween 20和75μg KI的5mlPBS中浸泡1小時。保溫結(jié)束后，在含0.2％(V/V)Tween 20的PBS中洗滌3次，每次10分鐘。為了顯現(xiàn)固定在硝基纖維素膜上的GST-GAX與mycKi之間的相互作用，如對GST-GAX那樣用抗myc表位的小鼠單克隆抗體(Santa Cruz)和與過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG的多克隆抗體(Nordic Immunology)現(xiàn)示。
實施例實施例1構(gòu)建能表達GAX與GAL4 DNA結(jié)合域的融合蛋白的載體使用雙雜合系統(tǒng)篩選文庫需要GAX蛋白與反式激活蛋白GAL4的DNA結(jié)合域融合。該融合蛋白的表達用載體pGBT10(參見材料和方法)實現(xiàn)，在該載體中我們在GAL4的DNA結(jié)合域(GAL4DB)序列的同一閱讀框中引入了編碼GAX蛋白部分或全部的片段。一個特別的片段含有來自phGAX的EcoRⅠ-SalⅠ片段，將其插入在pGBT10的EcoRⅠ-SalⅠ位點上，得到質(zhì)粒pCM199。
對該構(gòu)建物進行了測序，驗證了GAX蛋白確實在相應于GAL4DB的片段的相同開放讀碼框架中。實施例2肺融合文庫的篩選融合文庫的篩選可以鑒定出產(chǎn)生與GAL4的反式活化域融合的蛋白且能與GAX蛋白或其功能域相作用的克隆。這種相互作用使得可以重建一個反式活化子，后者將能夠誘導YCM79菌株中報道基因URA3、BLE和LacZ的表達。
為了進行這種篩選，我們選擇了用從人肺得到的cDNA制備的融合文庫。該文庫是以細菌形式提供給我們的，首先純化了文庫的質(zhì)粒DNA。2.1)融合文庫質(zhì)粒DNA的制備按Clontech提供的方法(見材料和方法，§10)提取了肺cDNA文庫的質(zhì)粒DNA。在此制備過程中，保持該文庫的代表性是很重要的，即保持構(gòu)成文庫的獨立質(zhì)粒的數(shù)目，其為7×106質(zhì)粒。
為了防止在該制備過程中的文庫質(zhì)粒的丟失，我們構(gòu)建的質(zhì)粒DNA是從相當于文庫代表性3倍多一些的獨立細菌菌落即25×106個菌落中獲得的。2.2)肺文庫的轉(zhuǎn)化和通過β-半乳糖苷酶活性試驗的選擇在篩選中需要保持融合文庫的每一個獨立質(zhì)粒與質(zhì)粒GAL4 DB-GAX同時存在于至少一個酵母中的概率。為了保持這種概率，重要的是具有良好的酵母轉(zhuǎn)化效率。為此，我們選擇了能達到每μg DNA轉(zhuǎn)化105個細胞這樣的效率的酵母轉(zhuǎn)化方法。另外，由于兩個不質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母會降低這種效率，我們優(yōu)選使用用質(zhì)粒pGAL4DB-GAX預先轉(zhuǎn)化的酵母。這種酵母菌株用100μg融合文庫質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化。這樣的DNA量據(jù)估計(見材料和方法)使我們得到了4.2×107轉(zhuǎn)化細胞，這一數(shù)字大于構(gòu)成文庫的獨立質(zhì)粒的數(shù)目。根據(jù)這一結(jié)果，我們可以認為文庫中幾乎所有質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化了酵母。轉(zhuǎn)化細胞的選擇(從而能重建功能性GAL4反式活化子)在培養(yǎng)基YNB+Lys+Met+His+Ade上進行。該選擇后獲得了190個具有Ura+和bGal+表型的克隆。實施例3所選質(zhì)粒的插入片段的鑒定顯示與Ki的相互作用從酵母中提取質(zhì)粒，引入細菌中，然后如在材料和方法部分所述進行準備。用寡核苷酸CTATTCGATGATGAAGATACCCC(SEQ ID No:1)進行測序，所述寡核苷酸與GAL4TA的臨近肺cDNA文庫插入位點(距EcoRⅠ位點52bp)的區(qū)域互補。
這些序列與得自數(shù)據(jù)庫GENBank和EMBL(歐洲分子生物學實驗室)的序列的比較表明，如此鑒定的質(zhì)粒之一帶有與Ki因子相同的cDNA，Ki因子是在患狼瘡的病人中發(fā)現(xiàn)的一種自身抗原。該質(zhì)粒被命名為pCM282。當與pCM199共轉(zhuǎn)化至酵母中時，該質(zhì)粒能夠活化如下表1中所示的報道基因。該表還顯示這種活化是特異性的，這提示Ki能與GAX特異性地相作用。
表1<

實施例4構(gòu)建能在酵母中表達GAX的不同缺失體與GAL4 DNA結(jié)合域的融合蛋白的載體本實施例描述了編碼Gax蛋白不同突變體的載體的構(gòu)建，可用于確定該蛋白的結(jié)構(gòu)/功能，特別是顯示活性功能域和負責與Ki蛋白相互作用的功能域。
C-末端153個氨基酸的缺失是按如下獲得的將質(zhì)粒pCM199用EagⅠ-SalⅠ消化，然后除去小片段，末端用klenow處理被鈍化，并再連接。這樣獲得的質(zhì)粒稱為pCM238。它編碼帶有GAX的1-104殘基的蛋白。
pCM199用Bgl2和SalⅠ完全消化，用Klenow處理后再連接載體，從而保留了GAX的頭32個氨基酸。所得質(zhì)粒稱為pCM244。它編碼帶有GAX的1-32殘基的蛋白。
pCM199用Bgl2和SalⅠ完全化消化分離到約270bp和572bp的片段。第一個片段被克隆在pGBT11的BamHⅠ-SalⅠ位點上，得到質(zhì)粒pCM245，其表達C-末端79個氨基酸與GAL4DB的融合蛋白。第2個片段被克隆在pGBT10的BamHⅠ位點上，得到質(zhì)粒pCM246，其表達35-222氨基酸與GAL4DB的融合蛋白。
pCM246用Dra3和pst1消化，用T4聚合酶處理后，質(zhì)粒自身再閉合得到質(zhì)粒pCM280。它編碼帶GAX33-63殘基的蛋白。
質(zhì)粒pCM199用NdeⅠ和PsiⅠ消化，將插入片段克隆在質(zhì)粒pAS1中，得到質(zhì)粒pCM301。該質(zhì)?？杀磉_缺失頭32個氨基酸的GAX蛋白與GAL4DB的融合蛋白。它編碼帶有GAX33-302殘基的蛋白質(zhì)。
這些不同載體所表達的融合蛋白的結(jié)構(gòu)示于圖1中。實施例5:GAX與KI作用區(qū)的定位酵母菌株yCM79用實施例1和4中描述的不同載體及pCM282或pGAD424同時轉(zhuǎn)化。如材料和方法部分所述測定β-gal活性。結(jié)果示于下表2中。
表2

>
這些結(jié)果顯示出GAX與KI因子相作用的區(qū)域(表2)。實際上，從那些在缺失后使活性喪失的區(qū)域，可推知它們是相互作用所必需的，但不是充分的。因而，1-32和104-223區(qū)看來對與KI的相互作用很重要。pCM328沒給出β-gal的陽性信號提示存在酵母中的相互作用所必需的C-末端104-302區(qū)域。實施例6不同組織中的mRNA表達和暫時表達的蛋白質(zhì)的核定位為了鑒定GAX的配體，我們用與GAL4TA融合的肺cDNA文庫(實驗室制備，見實施例2)轉(zhuǎn)化了我們的雙雜合酵母菌株，其中已含有能表達GAL-GAX(1-302)融合蛋白的質(zhì)粒作為誘餌。擴增前我們獲得了41百萬以上的獨立克隆，其中只有190個克隆中表達三個選擇基因(即URA3基因、LacZ基因和BLE基因)。在這190個克隆中鑒定了9個編碼不同蛋白的cDNA。我們對編碼抗原Ki的cDNA特別感興趣。
Ki基因看來是遍在的，如用從不同組織提取的mRNA(人多組織Northern印跡，Clontech)對其表達進行的Northern印跡分析(圖1)所示，顯示約3kb的mRNA?？梢宰⒁獾酱嬖谠谛呐K和骨骼肌中進行不同成熟化的mRNA形式。
按如下方法構(gòu)建了能在哺乳動物細胞中表達與HA標記融合的Ki蛋白的載體將質(zhì)粒pCM282的NcoⅠ-XhoⅠ片段插入在質(zhì)粒pASI的NcoⅠ-XhoⅠ位點上，獲得質(zhì)粒pCM322。然后將質(zhì)粒pCM322的EcoRⅠ-DraⅠ片段插入在表達載體pCDNA3的EcoRⅠ-EcoRⅤ位點上。所得質(zhì)粒pCM323能在哺乳動物細胞中表達Ki與HA標記的融合蛋白。
通過間接免疫熒光法顯示，在用該嵌合體轉(zhuǎn)染的細胞中KiHA定位在核中(圖2)。實施例7與S標記及myc標記融合的Ki蛋白的表達和純化將下列寡核苷酸一起雜交、磷酸化，然后與預先用NcoⅠ消化的pET29B連接。
CATCAAGCTTATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGCTTC(SEQ ID N°2)和CATGGATCCACGTGCAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATAAGCTT(SEQ ID N°3)
所得質(zhì)粒命名為pCM320。編碼Ki蛋白的基因用寡核苷酸CGCGGATCCCATGGCCTCGTTGCTG(SEQ ID No:4)和GTAGAGCTCGAGTCAGTACAGAGTCTCTGC(SEQ ID No:5)進行PCR擴增。所得片段用BamHⅠ和XhoⅠ消化，然后在連接后引入質(zhì)粒pBCks的BamHⅠ-XhoⅠ位點，獲得質(zhì)粒pCM305。然者然后用BamHⅠ和XhoⅠ消化。所釋放的插入片段連接在pCM320的BamHⅠ和XhoⅠ位點上，得到質(zhì)粒pCM321。按供應商(Novagen)的說明從pCM321進行蛋白的表達和純化。實施例8與GST融合的GAX蛋白的表達和純化將用質(zhì)粒pGEX-2T-h-GAX轉(zhuǎn)化的BL-21菌落在30ml含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB中37℃預培養(yǎng)過夜。將5ml該預培養(yǎng)物在500ml含氨芐青霉的LB中37℃下培養(yǎng)，直到600nm處的光密度達到0.7。用0.1mM IPTG 30℃ 2小時誘導GST-GAX的表達。將培養(yǎng)物以6000rpm離心10分鐘。將細菌沉淀重懸于10ml冷PBS中，然后分配在10個Eppendorf管中。按如下提取細菌蛋白用12秒處理、24秒中止的循環(huán)進行聲處理10分鐘，然后以15000離心15分鐘。將上清液再合并，其含有用于純化的可溶部分。余下的沉淀為不可溶部分。
通過GST在谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖小珠上的親和作用純化GAX。
細菌聲處理后得到的上清液室溫下在搖床上與樹脂保溫1小時。然后將連有蛋白的樹脂以1000rpm離心10分鐘。除去上清液，在搖床上用50ml含1％Triton X-100的PBS洗滌樹脂3次?？捎昧蚯杷犭覐臉渲舷疵揋ST-GAX。在搖床上用1.5倍于樹脂體積的硫氰酸胍，20mM Tris pH7.5,0.15M NaCl和0.1％Triton X-100洗脫30分鐘。洗脫液對PBS透析過夜，以除去硫氰酸胍。將蛋白保存在4℃PBS中。將蛋白酶抑制劑的等量混合物(1mg/ml亮抑蛋白酶肽、1mg/ml胃酶抑制劑、1mg/ml抑蛋白酶肽、50mM芐脒)以1/200加入蛋白制備物中。實施例9蛋白Ki和GAX間的體外相互作用為了研究GAX和Ki的體外相互作用，我們在大腸桿菌中制備了兩種重組嵌合蛋白。GST-GAX在谷胱甘肽偶聯(lián)樹脂上利用谷胱甘肽與轉(zhuǎn)移酶(GST)的催化位點而被純化；帶有myc表位和S表位的SmycKi在蛋白S偶聯(lián)的樹脂上純化。
所示量的牛白蛋白、蛋白GST或用凝血酶消化(GST和GAX間所造的位點)后的GST-GAX、以及遞增量的GST-GAX在聚丙烯酰胺變性凝膠上分離，然后用考馬氏藍染色(圖3A)。
從與A相同的凝膠上將蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。該膜在SmycKi存在下在含抗myc表位的小鼠單克隆抗體(Cruz)的溶液中，最后在用于檢測抗myc抗體的溶液中相繼保溫。
我們的結(jié)果清楚地顯示Ki特異性地劑量依賴性地識別GST上GAX，而用牛白蛋白或GST沒有觀察到任何反應。還注意到用凝血酶消化后，Ki總與GAX相作用(圖3B)。實施例10構(gòu)建能在哺乳動物細胞中表達GAX不同缺失體與GAL4 DNA結(jié)合域之融合蛋白的載體10.1質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒pCM199和pCM301用HindⅢ消化。將插入片段以正確方向克隆在pCDNA3(Invitrogen)的HindⅢ位點上，分別產(chǎn)生質(zhì)粒pCM291和pCM327，其能夠在哺乳動物細胞中表達融合蛋白。
將質(zhì)粒pCM238、pCM244、pCM301、pCM246和pCM280用HindⅢ和NaeⅠ消化。將插入片段以正確方向插入在pCDNA3(Invitrogen)的HindⅢ-EcoRⅤ位點上，分別得到質(zhì)粒pCM292、pCM326、pCM327、pCM294和pCM295，其能在哺乳動物細胞中表達融合蛋白。10.2.病毒載體的構(gòu)建根據(jù)一個特別方案，本發(fā)明涉及能在體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達上文定義的核酸的病毒載體的構(gòu)建和應用。
特別涉及腺病毒，已鑒定了不同的血清型，其結(jié)構(gòu)和特性相差無幾。在這些血清型中，本發(fā)明優(yōu)選使用2或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或源自動物的腺病毒(見WO94/26914)。在可用于本發(fā)明的源自動物的腺病毒中，可舉出源自狗、牛、鼠(例如Mayl,Beard等，病毒學(Virology75(1990)81)、羊、豬、禽或猴(如SAV)的腺病毒。優(yōu)選，源自動物的腺病毒是狗腺病毒，更優(yōu)選腺病毒CAV2[例如manhattan株或A26/61株(ATCC VR-800)]。優(yōu)選，在本發(fā)明中使用源自人或狗的腺病毒或其混合物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的缺陷腺病毒含有ITR、衣殼化序列和本發(fā)明的核酸。更優(yōu)選地，在本發(fā)明腺病毒的基因組中，至少E1區(qū)是非功能化的。目標病毒基因可通過本領域技術人員已知的任何技術致非功能化，特別是在目標基因中全部刪除、取代、部分缺失或加入一個或多個堿基。這種修飾可以在體外(對分離的DNA)或就地進行，例如用遺傳工程技術或用致突變劑處理。其他區(qū)域也可以被修飾，特別是E3區(qū)(WO95/02697)、E2區(qū)(WO94/28938)、E4區(qū)(WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697)和L5區(qū)(WO95/02697)。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的腺病毒包含在E1和E4區(qū)中的缺失。根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，在E1區(qū)中有缺失，在缺失處插入E4區(qū)和本發(fā)明的核酸序列(參見FR9413355)。在本發(fā)明的病毒中，E1區(qū)中的缺失優(yōu)選在腺病毒Ad5序列上從455核苷酸延伸至3329核苷酸。
本發(fā)明的重組缺陷病毒可通過本領域技術人員已知的任何技術制備(Levrero等，基因，101(1991)195,EP185 573；Graham,EMBO J.3(1984)2917)。特別地，這些病毒是通過腺病毒和帶有本發(fā)明的核酸序列或核酸序列的組合之間的同源重組制備的。這種同源重組是在所述腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染在適當?shù)募毎抵泻蟀l(fā)生的。所用的細胞系優(yōu)選應(ⅰ)可用所述元件轉(zhuǎn)化，及(ⅱ)帶有能補充腺病毒基因組缺陷部分的序列，優(yōu)選呈能避免重組危險的整合形式。作為細胞系的例子，可舉出人胚腎細胞系293(Graham等，普通病毒學雜志(J.Gen.Virol.)36(1977)59)，在其基因組中特別含有腺病毒Ad5基因組的左側(cè)部分(12％)或能夠補充E1和E4功能的細胞系，如在專利申請WO94/26914和WO95/02697中或在Yeh等“病毒學雜志”(J.Virol.)70(1996)559中描述的那些。
然后按分子生物學和常規(guī)技術回收和純化經(jīng)復制的腺病毒。
對于腺相關病毒(AAV)，涉及那些DNA大小被相對減小、能整合在其感染細胞的基因組中的病毒，所述整合是穩(wěn)定的和位點特異性的。它們能感染大范圍的細胞，而不影響細胞的生長、形態(tài)或分化。另外，它們看來不會引起人類疾病。AAV的基因組已被克隆、測序和鑒定。它包括約4700個堿基，在各末端含有一個約145個堿基的反向重復區(qū)(ITR)，后者作為病毒復制的起始區(qū)?；蚪M的其余部分分為兩個主要區(qū)域，具有衣殼化功能基因組的左側(cè)部分，其含有涉及病毒復制和病毒基因表達的rep基因；基因組的左側(cè)部分，其含有編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
在文獻中已描述了衍生于AAV的載體在體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移中的應用(特別見WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368,US5,139,941,EP488 528)。這些申請描述了不同的AAV衍生的構(gòu)建體，其中rep和/或cap基因被刪除，代之以目的基因，還描述了它們在體外(對培養(yǎng)細胞)或體內(nèi)(直接在機體中)轉(zhuǎn)移所述目的基因的應用。
本發(fā)明的缺陷重組AAV可通過在人攜帶病毒(如腺病毒)感染的細胞系中，含本發(fā)明的核酸序列或序列組合兩邊為兩個AAV反向重復區(qū)(ITR)的質(zhì)粒與含AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染而制得。可用的細胞系例如為293細胞系。其他生產(chǎn)系統(tǒng)例如描述在專利申請WO95/14771、WO95/13365、WO95/13392或WO95/06743中。所產(chǎn)生的重組AAV然后用常規(guī)技術純化。
對于皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，重組載體的構(gòu)建在文獻中有大量描述特別見Breakfield等，新生物學家(New Biologist)3(1991)203；EP453242,EP178220,Bernstein等，遺傳工程(Genet.Eng.)7(1985)235,McCormick，生物技術(BioTechnology)3(1985)689等。特別地，逆轉(zhuǎn)錄病毒是選擇性感染分裂細胞的整合性病毒。因而它們構(gòu)成有益的可用于癌癥的載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組主要包括兩個LTR、一個衣殼化序列和三個編碼區(qū)(gag,pol和env)。在逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的重組載體中，gag,pol和env基因一般被部分或全部缺失，代之以目標外源核酸序列。這些載體可從不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備，例如特別是MoMuLV(莫洛尼鼠類白血病病毒，也稱為MoMLV)、MSV(莫洛尼鼠類肉瘤病毒)、HaSV(Havrey肉瘤病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞氏肉瘤病毒)或弗羅德病毒。為了構(gòu)建含有本發(fā)明核酸序列或序列組合的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，構(gòu)建了特別含有LTR、衣殼化序列和所述核酸序列的質(zhì)粒，然后用于轉(zhuǎn)染稱為衣殼化細胞的細胞系，該細胞系可反式提供質(zhì)粒中缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒的功能。一般地說，衣殼化細胞系能夠表達gag、pol和env基因。這種衣殼化細胞系在現(xiàn)有技術中已有描述，特別是PA317細胞系(US4861719)、PsiCRIP細胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12細胞系(WO89/07150)。另外，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可在LTR處帶有修飾，以消除轉(zhuǎn)錄活性、及帶有擴展的衣殼化序列，即含有gag基因的一部分(Bender等，病毒學雜志(J.Virol.)61(1987)1639)。所產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒然后按常規(guī)技術純化。10.3化學載體上述實施例中描述的核酸或質(zhì)粒性表達載體可以在體內(nèi)或離體施用。實際上已證明裸核酸可以轉(zhuǎn)染細胞。但為了改善轉(zhuǎn)移效率，本發(fā)明中優(yōu)選使用轉(zhuǎn)移載體。這可以是一種病毒載體(實施例9.2)或一種合成的轉(zhuǎn)染試劑。
在已開發(fā)的合成載體中，本發(fā)明優(yōu)選使用聚賴氨酸、(LKLK)n、(LKKL)n(PCT/FR/00098)、聚亞乙基亞胺(WO96/02655)和DEAE葡聚糖型陽離子聚合物或陽離子脂類或脂轉(zhuǎn)染試劑。它們具有聚集DNA和促進其與細胞膜結(jié)合的特性。在脂轉(zhuǎn)染試劑中，可舉出脂多胺(Lipofectamine,Transfectam等)，不同的陽離子或中性脂類(DOTMA、DOGS、DOPE等)以及源自核的肽。另外，已提出由受體介導的靶向轉(zhuǎn)染概念，這是利用由陽離子聚合物產(chǎn)生的DNA聚集作用和由陽離子聚合物和膜受體(存在于欲轉(zhuǎn)入細胞類型的表面上)間的化學偶聯(lián)產(chǎn)生的復合物在膜上的定向結(jié)合。已描述了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體或肝細胞脫唾液酸糖蛋白受體的靶向作用。利用這種化學載體的本發(fā)明組合物的制備按本領域技術人員已知的任可技術實現(xiàn)，一般是各種成分的簡單接觸。實施例11提供一種能研究GAX轉(zhuǎn)錄活性的方法我們使用了暫時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來研究GALDB-GAX融合所特有的轉(zhuǎn)錄活性，以及它們對轉(zhuǎn)錄活化子如雌激素受體(ER)或與GALDB融合的單純皰疹毒的VP16蛋白酸活化域的影響。為了定量測定兩個因子或多個因子組合的轉(zhuǎn)錄活性，我們構(gòu)建了在一個人工啟動子控制下表達細菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的靶基因(報道基因)。該啟動子含有位于CAT基因復制起始位點上游的來自腺病毒Ad2 E1B基因(E1B TATA)的TATA盒并將預起始復合物(TFIID+TFII A,B,E,F)定位，后者吸引Ⅱ型RNA聚合酶(PolⅡ)，后者將啟動CAT基因的轉(zhuǎn)錄。在該基礎啟動子的上游我們插入了將被嵌合體GALDB-GAX或GALDB-VP16所識別的GALDB結(jié)合位點(17聚體)。我們還在該17聚體的上游克隆了雌激素反應性元件(ERE),ER與其結(jié)合可活化轉(zhuǎn)錄。該報道基因?qū)⑹刮覀兡軌蜓芯繄D示的各種不同的組合，轉(zhuǎn)錄活性的活化或抑制將體現(xiàn)為細胞中CAT量的變化。在轉(zhuǎn)染后使用了測定細胞提取物中CAT酶活性的方法，以測定轉(zhuǎn)錄效應。
ER和GAL4-VP16是很強的轉(zhuǎn)錄活化子。ER使CAT活性提高100倍以上，GAL4-VP16提高約85倍。ER和GAL4-VP16的共表達造成CAT活性達到非活化報道基因的300倍以上，大于所表達的兩個單一活化子之和。這提示盡管空間體積大，ER和GAL4-VP16可以占有并活化同一個啟動子(圖4B)。實施例12融合蛋白GALDB-GAX的轉(zhuǎn)錄活性研究和轉(zhuǎn)錄抑制功能域的鑒定GAX基因在人體中編碼302個氨基酸的蛋白。該蛋白的一級結(jié)構(gòu)具有其功能仍未知的不同功能域。GAX屬于稱為具有同源框(HOMEOBOX)的基因家族。同源框是這些蛋白識別存在于靶基因啟動子(控制基因表達)上的特異性DNA序列并與之結(jié)合所必需的。迄今，還沒有鑒定出GAX所識別的任何DNA序列。GAX在其N-末端具有未知功能的富組氨酸(HIS)殘基的區(qū)域。
為了了解GAX功能，對人GAX基因的不同區(qū)域進行了缺失，以產(chǎn)生截短的蛋白，包括在其N-末端和C-末端中的缺失，相對于GAX全長1-302的每個缺失突變體中的數(shù)字顯示其第一個和最后一個氨基酸(圖5)。由于不知道GAX天然識別的DNA序列，我們創(chuàng)造了不同缺失突變體與來自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的外源DNA結(jié)合域(GALDB)的嵌合體(與后者的N-末端部分融合)。構(gòu)建了表達載體以在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中暫時表達不同的嵌合體。
單獨表達或在ER存在下表達不同的GAL-GAX嵌合體，以研究它們各自對基礎轉(zhuǎn)錄或?qū)R的轉(zhuǎn)錄活性的影響。
全長GAX作為GAL-GAX1-302融合蛋白使CAT活性與非活化報道基因相比降低了8倍以上。當GAX N-末端的32個氨基酸缺失時(GAL-GAX33-302)微弱地影響這種抑制作用，但再缺失表達GAXC-末端部分的區(qū)域時(GAL-GAX33-222)就完全消除了這種抑制作用。這32個氨基酸在GAL-GAX1-32中已足以降低CAT活性(圖6A)。
GAL-GAX1-302和ER的共表達造成CAT活性比僅用ER獲得的活性低25倍以上。這種抑制作用如在A中一樣是起因于GAX的頭32個氨基酸(比較GAL-GAX1-302、GAL-GAX33-302和GAL-GAX33-222)。N-末端這32個氨基酸(GAL-GAX1-32)僅降低ER活性2倍(比較GAL-GAX 1-32,GAL-GAX1-104)，并至少需要殘基33-222存在以達到最大活性(圖6B)。
研究了當其缺失時使活性喪失的那些序列，結(jié)論是它們是相互作用所必需的但不是充分的。
所給出的結(jié)果表明GAX抑制所用報道基因的轉(zhuǎn)錄。這種抑制基本上起因于N-末端的肽(1-32)，后者的最佳活性需要GAX33-222區(qū)的存在，優(yōu)選Gax33-104區(qū)的存在。
利用與GAL4的DNA結(jié)合域融合的GAX的不同缺失突變體，我們得以在酵母中(通過雙雜合系統(tǒng)，實施例5)鑒定出對與Ki相互作用重要的GAX區(qū)。這是N-末端直到222殘基的部分。如我們在前文中所顯示的那樣，該區(qū)域含有GAX的抑制功能域。實施例13GAX與PCNA間的體外相互作用13.1人“增殖性細胞核抗原”(PCNA)的cDNA克隆和重組蛋白的生產(chǎn)PCNA的cDNA克隆是通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR實現(xiàn)的。第一步逆轉(zhuǎn)錄(RT)是用Pharmacia的“第一鏈cDNA合成”試劑盒進行的。按P.Chomczynski和N.Sacchi(分析生物化學(Ana1.Biochem.)1987,162:156-159)描述的方法從初級培養(yǎng)的人平滑肌細胞(Clonetics)提取了總RNA。將10μg該總RNA重溶于20μl水，于65℃加熱10分鐘，在冰上冷卻，然后與11μl RT試劑盒的“大量第一鏈反應混合物”(克隆的FPLCpure鼠逆轉(zhuǎn)錄酶，無RNase/DNase BSA,dATP,dCTP,dGTP和dTTP)、1μlDTT和1μl引物pD(N)6混合。將該RT反應混合物于37℃保溫1小時。在90℃加熱5分鐘停止反應，然后在冰上冷卻。
第二步是PCNA cDNA的PCR擴增。PCR反應所用的引物如下15′-CGCGgaattcTGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCAGG-3′F E A R L V Q G25′-GGTCgaattcTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATC-3′* S G E E D E I K這兩個引物引入了一個EcoRⅠ位點(下劃線的小寫字母)。這些引物中所含的PCNA的氨基酸示于相應的密碼子下方，用其代碼(大寫字母)表示。*代表PCNA的終止密碼子。
將如上所述的RT反應混合物8μl補充至終體積50μl，并含有以下量和終濃度的物質(zhì)50pmol引物1、50pmol引物2、1單位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)、5μl MgCl2(25mM)、2μl 4種脫氧核糖核苷酸的200mM混合物(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)和5μl濃縮10倍的PCR緩沖液(Perkin Elmer)。
在MicoampTM管(Perkin Elmer)中借助于PTC-100TM熱循環(huán)儀(MJResearch,Inc.)進行PCR擴增。該擴增由如下步驟組成95℃變性2分鐘，然后是30個循環(huán)的95℃變性15秒，55℃雜交30秒和72℃延伸1分鐘。這30個循環(huán)后者是5分鐘的補充延伸，然后將PCR反應混合物保存在10℃。
PCNA在載體PCRⅡ(Invitrogen)中的實際克隆是用克隆試劑盒“Original TA CloningKit”(Invitrogen)進行的。3μl PCR產(chǎn)物、1μl 10X連接緩沖液、2μl載體pCRⅡ(25ng/μl)、3μl水和1μl T4 DNA連接酶在16℃下保溫16小時。
2ml該連接反應混合物用于如前所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TG1。然后將這些細菌在37℃培養(yǎng)16小時，培養(yǎng)基為含1.5％瓊脂、100μg/ml氨芐青霉素并存在X-gal(用于選擇重組克隆的藍白，β-半乳糖苷酶的α互補)的LB固體培養(yǎng)基。
將重組克隆(白色菌落)懸浮于10μl水中，用上述RT反應后的PCR相同的條件下驗證，只是向反應中加入0.01％(v/v)終濃度的Triton X-100。
多個陽性克隆用于進行DNA的微量制備，對其中PCNA插入片段的5’部分位于pCRⅡ EcoRⅤ位點下游的克隆測序，并保留用于以下的克隆步驟。
按如下方法進行PCNA在質(zhì)粒pET29中的克隆將來自PCRⅡ-PCNA的PCNA EcoRⅤ-HindⅢ片段插入在pET-29的EcoRⅤ-HindⅢ位點上。該質(zhì)粒然后用于生產(chǎn)嵌合重組蛋白S-PCNA。S-PCNA的轉(zhuǎn)化、生產(chǎn)和純化步驟與用于生產(chǎn)抗原Ki與myc表位融合蛋白的那些相同。13.2 GAX與PCNA體外相互作用的研究本研究采用了與實施例9中所用的相同方法，以研究重組蛋白GST-GAX與SmycKi間的相互作用。
遞增量的重組GST和嵌合體GST-GAX(50、250、500和700ng)在14％變性聚丙烯酰胺凝膠(Novex)上分離。將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，后者然后在含有重組蛋白S-PCNA的溶液中保溫，然后用抗PCNA的單克隆抗體(Santa Cruz)進行PCNA的免疫標記。
圖7顯示只在高劑量GST(500和750ng)下GST與PCNA間才有弱的相互作用。GST-GAX對PCNA的親和力遠高于PCNA與GST的親和力。
GAX與PCNA間的這種特異性相互作用提示GAX的抗增殖活性由PCNA的螯合來介導。Ki可與GAX及PCNA同時相作用的特性有利于形成二元或三元復合物，后者可能在細胞周期的進展中起重要作用(活化或抑制)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱RHONE-POULENC RORER S.A.
(B)街道Raymond ARON大街20號(C)城市安東尼(E)國家法國(F)郵編92165(ⅱ)發(fā)明名稱含有GAX蛋白中涉及轉(zhuǎn)錄抑制和/或與其他蛋白相作用的功能域的多肽，相應的核酸及其應用(ⅲ)序列數(shù)8(ⅳ)計算機可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID No:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQ ID No:1的描述CTATTCGATG ATGAAGATAC CCC 23(2)SEQ ID No:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQ ID No:2的描述CATCAAGCTT ATGGAGCAGA AGCTGATCTC CGAGGAGGAC CTGCAGCTTC 50(2)SEQ ID No:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度53個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQ ID No:3的描述CATGGATCCA CGTGCAGGTC CTCCTCGGAG ATCAGCTTCT GCTCCATAAG CTT 53(2)SEQ ID No:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQ ID No:4的描述CGCGGATCCC ATGGCCTCGT TGCTG25(2)SEQ ID No:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQ ID No:5的描述GTAGAGCTCG AGTCAGTACA GAGTCTCTGC 30(2)SEQ ID No:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQID No:6的描述GAGCGAATTCATGACCATGA CCCTTCACAC30(2)SEQ ID No:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQ ID No:7的描述GAGCGAATTC ACTGATCGTG TTGGGGAAGC 30(2)SEQ ID No:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度60個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬無(ⅲ)反義無(ⅹⅰ)SEQ ID No:8的描述TCGAGAGGTC ATATTGACCT AAGCTTCGGG TCGGAGTACT GTCCTCCGAC TGCCATATGTCTCCAG TATAACTGGA TTCGAAGCCC AGCCTCATGACAGGAGGCTGACGGTATACAGATC
權利要求
1．一種多肽，其特征在于它為具有轉(zhuǎn)錄抑制活性和/或正面或負面影響DNA復制的GAX蛋白片段的部分或全部。
2．根據(jù)權利要求1的多肽，其特征在于它至少包含人GAX蛋白的1-32殘基。
3．根據(jù)權利要求1或2的多肽，其特征在于它至少包含人GAX蛋白的140-230殘基。
4．一種多肽，其特征在于它至少包含選自人GAX蛋白1-32、33-302和1-104片段的一個片段。
5．一種多肽，其特征在于它為GAX蛋白能與Ki蛋白相互作用的片段。
6．根據(jù)權利要求5的多肽，其特征在于它為GAX蛋白的1-32或104-223片段。
7．一種多肽，其特征在于它為GAX蛋白能與PCNA相互作用的片段。
8．一種多肽，其特征在于它為GAX蛋白能與Ki和/或PCNA相互作用并與這些蛋白形成至少二元或至少三元復合物的片段。
9．一種多肽，其特征在于除具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的GAX蛋白片段外，它還含有至少一個不同來源的片段。
10．根據(jù)權利要求9的多肽，其特征在于所述不同來源的片段具有一種生物活性，是一種標記或靶向元件。
11．編碼權利要求1-9之一的多肽的核酸。
12．根據(jù)權利要求11的核酸，其特征在于它為一種cDNA。
13．含有在一種啟動子控制下的權利要求11或12的核酸的表達盒。
14．含有權利要求11或12的核酸或權利要求13的表達盒的表達載體。
15．根據(jù)權利要求14的載體，其特征在于它為一種病毒載體。
16．根據(jù)權利要求15的載體，其特征在于它為一種腺病毒。
17．根據(jù)權利要求15的載體，其特征在于它為一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。
18．GAX蛋白或權利要求1-9的多肽抑制基因轉(zhuǎn)錄和/或正面或負面影響DNA復制的應用。
19．抑制Ki蛋白或PCNA活性的化合物在抑制平滑肌細胞增殖中的應用。
20．與Ki蛋白和/或PCNA形成二元或三元復合物的化合物在正面或負面影響細胞周期進展中的應用。
21．一種藥物組合物，其特征在于它包含至少一種權利要求1-9之一的多肽或權利要求14-17之一的載體。
22．一種篩選和/或鑒定與GAX蛋白或GAX一個功能域相互作用的多肽的方法，其特征在于其中使用權利要求1-9之一的多肽。
23．根據(jù)權利要求22的方法，其特征在于其中使用選自GAX蛋白1-32和33-302片段的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有GAX生物活性中所涉及的GAX功能域的多核苷酸。特別是參與GAX與其他分子或與負責一種生物活性的功能域相互作用的功能域。本發(fā)明還涉及含有GAX功能域的嵌合分子。還涉及GAX抑制基因表達的應用，以及抑制GAX與某細胞配體之相互作用的化合物在調(diào)節(jié)GAX活性中的應用。還涉及篩選和/或鑒定GAX的細胞配體的方法。
文檔編號C12N15/12GK1237980SQ9719982
公開日1999年12月8日 申請日期1997年10月16日 優(yōu)先權日1996年10月18日
發(fā)明者D·布拉尼雷斯, A·夫尼爾, A·馬弗迪, C·馬斯里奧 申請人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司