一組特異性結(jié)合磺胺二甲基嘧啶的核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一組特異性結(jié)合橫胺二甲基喀晚的核酸適配 體及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 橫胺二甲基喀晚（Sulfamethazine,SMz)為廣譜抗菌劑，對大多數(shù)革蘭陽性菌和革 蘭陰性菌都具有抑制作用，臨床上主要用于治療鏈球菌等感染所引發(fā)的細(xì)菌性疾病及雞球 蟲病，因而在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。目前，橫胺二甲基喀晚在動物性食品中的殘留現(xiàn)象較 為嚴(yán)重，是畜產(chǎn)品安全著重監(jiān)管的對象。我國、歐盟等國家和機構(gòu)均規(guī)定動物性食品中橫胺 類藥物總量及橫胺二甲基喀晚等單個藥物的最高殘留限量為100μg/kg。
[0003]目前對該藥物的快速殘留檢測研究主要w抗體為結(jié)合元件建立的免疫分析方法 為主。然而，抗體的制備離不開使用實驗動物，而且難W重復(fù)生產(chǎn)，再加上其對保存條件要 求嚴(yán)格，導(dǎo)致抗體的使用受到限制。 W04]核酸適配體（Aptamer)是通過指數(shù)式擴增配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX，Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)篩選得到白勺，會長旬多與許 多目標(biāo)分子（蛋白、藥物、無機或有機分子）發(fā)生高親和性和特異性結(jié)合的一類單鏈核巧酸 值NA或RNA)。與抗體相比，核酸適配體的最大優(yōu)勢在于不需要使用實驗動物，可用體外方 法分離制備，并且其更易于修飾，也更穩(wěn)定。因此，核酸適配體的出現(xiàn)為分析檢測領(lǐng)域開創(chuàng) 了一個新的局面。核酸適配體作為抗體的替代物，將其應(yīng)用到獸藥殘留檢測技術(shù)中是目前 檢測技術(shù)研究的一個重要內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的一個目的是提供一種核酸適配體。
[0006] 本發(fā)明提供的核酸適配體為如下（1)-(4)任一所示的單鏈DNA分子：
[0007] (1)如序列表中序列3所示的單鏈DNA分子； 陽00引 似如序列表中序列1所示的單鏈DNA分子；
[0009] (3)如序列表中序列2所示的單鏈DNA分子；
[0010] (4)如序列表中序列4所示的單鏈DNA分子。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種核酸適配體的衍生物。
[0012] 本發(fā)明提供的核酸適配體的衍生物為如下（1)-做中任意一種：
[0013] (1)與上述核酸適配體的核巧酸序列具有60%或60%W上同一性，且與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0014] (2)與上述核酸適配體的核巧酸序列進行雜交，且與所述核酸適配體具有相同功 能的核酸適配體的衍生物；
[0015] (3)由上述核酸適配體的核巧酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子，且與所述核酸適配體具有 相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0016] (4)由上述核酸適配體編碼的膚核酸，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核 酸適配體的衍生物；
[0017] (5)將上述核酸適配體缺失、替換或增加一個或幾個核巧酸，得到與所述核酸適配 體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0018] (6)將上述核酸適配體進行核巧酸取代或修飾，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體的衍生物；
[0019] (7)將上述核酸適配體的骨架改造為硫代憐酸脂骨架，得到與所述核酸適配體具 有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0020] (8)將上述核酸適配體的一端或中間連接信號分子和/或活性分子和/或功能基 團，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物。
[0021] 上述衍生物中，所述化）中的修飾為憐酸化、氨基化、甲基化、琉基化或同位素化； 所述（8)中的功能基團為生物素、巧光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、納米材料、蛋白或酶標(biāo)記。
[0022] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種用于識別橫胺二甲喀晚的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明提供的用于識別橫胺二甲喀晚的試劑盒包括上述核酸適配體或上述核酸 適配體的衍生物。
[0024] 本發(fā)明提供的試劑盒還包括橫胺二甲基喀晚-間隔臂-HRP。
[0025] 本發(fā)明提供的試劑盒還包括橫胺二甲基喀晚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和結(jié)合緩沖液；所述橫 胺二甲基喀晚標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為 0.lng/mL、0. 4ng/mL、l.lng/mL、3. 3ng/mL、9. 9ng/mL、 29. 6ng/血、88. 9ng/mL266.化g/血和 800ng/mL。
[00%] 本發(fā)明的最后一個目的是提供上述核酸適配體或上述核酸適配體的衍生物或上 述試劑盒的新用途。
[0027] 本發(fā)明提供了上述核酸適配體或上述核酸適配體的衍生物或上述試劑盒在如下 (1)-化）中任一種中的應(yīng)用：
[0028](1)識別或輔助識別橫胺二甲喀晚；
[0029] (2)制備識別或輔助識別橫胺二甲喀晚的產(chǎn)品；
[0030] (3)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有橫胺二甲喀晚；
[0031] (4)檢測或輔助檢測待測樣品中橫胺二甲喀晚濃度；
[0032] (5)分離或輔助分離橫胺二甲喀晚；
[0033] (6)富集或輔助富集橫胺二甲喀晚。
[0034] 上述應(yīng)用中，所述待測樣品為牛奶。
[0035]與現(xiàn)有的抗體技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：篩選所獲得的核酸適配體相對 于傳統(tǒng)抗體具有更簡便的篩選條件，無毒性，分子量小，可體外合成，性質(zhì)穩(wěn)定，易于化 學(xué)修飾和標(biāo)記，并且本發(fā)明提供的核酸適配體與橫胺二甲基喀晚的親和力高，解離常數(shù) 值issociationconstant，Kd)達到nM級，能特異性識別橫胺二甲基喀晚。
[0036] 本發(fā)明利用SELEX技術(shù)，W橫胺二甲基喀晚作為祀分子，篩選獲得了高特異性、高 親和力的核酸適配體，并基于生物素度iotin)化的核酸適配體建立了用于檢測橫胺二甲 基喀晚的直接競爭化學(xué)發(fā)光分析方法。通過實驗證明：本發(fā)明的方法簡便，靈敏度高且變異 系數(shù)小，可用于檢測牛奶中橫胺二甲基喀晚的殘留。本發(fā)明的核酸適配體將成為橫胺二甲 基喀晚殘留檢測的有力工具，基于生物素度iotin)化的核酸適配體建立的用于檢測橫胺 二甲基喀晚的直接競爭化學(xué)發(fā)光分析方法為橫胺二甲基喀晚的核酸適配體的實際應(yīng)用提 供了基礎(chǔ)，更為高效、廣泛的監(jiān)控抗菌藥物的殘留提供技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0037] 圖1為橫胺二甲基喀晚核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖1A為橫胺二甲基喀晚核酸 適配體SA07的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；圖1B為橫胺二甲基喀晚核酸適配體SA41的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。
[0038]圖2為橫胺二甲基喀晚與其核酸適配體的解離常數(shù)擬合曲線。
[0039] 圖3為橫胺二甲基喀晚核酸適配體的特異性分析。
[0040] 圖4為基于核酸適配體的化學(xué)發(fā)光檢測方法的特異性。圖4A為包含橫胺二甲基 喀晚的14種橫胺類藥物；圖4B為除圖4A外的14種橫胺類藥物。
【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實施例中的橫胺二甲基喀晚標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為 S6256-25G〇 W44] 下述實施例中的橫胺二甲基喀晚類似物標(biāo)準(zhǔn)品（橫胺甲基喀晚、橫胺苯化挫、橫 胺異惡挫、橫胺甲氧喀晚、橫胺化晚、橫胺間甲氧喀晚、橫胺哇惡嘟、橫胺喀晚、橫胺甲基異 惡挫、橫胺間二甲氧喀晚、橫胺間甲氧化嗦、橫胺甲嚷挫、氨苯橫胺、橫胺醋酷、橫胺多辛、橫 胺硝苯、柳氮橫化晚、橫胺（二）甲惡挫、橫胺甲二挫、橫酷胺基脈喀晚、橫胺苯酷、橫胺索喀 晚、橫胺脈、獻橫胺嚷挫、橫胺乙氧化嗦、橫胺漠甲喀晚、橫胺林）購自Sigma公司。
[0045] 下述實施例中的5'標(biāo)記生物素標(biāo)記的核酸適配體化iotin-SA07)由Invitrogen 公司合成。
[0046] 下述實施例中的結(jié)合緩沖液度B，pH7.6)由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及 其在結(jié)合緩沖液中的濃度為：化C1 1. 461g/250血、Tris-肥1 0. 788g/250血、MgClz· 6&0 0. 102g/250血、KC1 0. 093g/250血、CaClzO. 028g/250血、Tween20 50yL/250血。
[0047] 下述實施例中的洗脫緩沖液巧B，pH8. 0)由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及 其在洗脫緩沖液中的濃度為：Tris-肥1 0. 631g/100血、邸TA· 2化· 2&0 0. 372g/100血、 化