一種條斑紫菜抗菌肽的純化方法及其氨基酸序列的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種利用條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)，經(jīng)過蛋白質(zhì)酶解、純化和序列分析， 獲得條斑紫菜抗菌膚并明確其氨基酸序列。
【背景技術(shù)】：
[0002] 紫菜（Po巧hyra)屬紅藻口煙lodophyta)紅毛菜科度angiacea)，廣泛分布于從寒 帶到亞熱帶的潮間帶水域。條斑紫菜（Por地yrayezoensis)是我國重要的經(jīng)濟(jì)海藻之一， 其蛋白質(zhì)含量高達(dá)36. 31%，雄踞海藻之首。研究表明，由特定酶降解蛋白質(zhì)已明確成為生 物活性膚的良好來源。因此，條斑紫菜蛋白質(zhì)可望成為活性膚的重要來源，具有潛在的應(yīng)用 前景。
[0003] 隨著致病菌抗藥性問題日益突出，尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一 條有效途徑。由于海洋生物資源的特殊性，人們對從海洋生物中開發(fā)更多新的抗菌特效藥 物，寄予了極大的希望。
[0004] 本發(fā)明著眼于W條斑紫菜為原料，經(jīng)蛋白質(zhì)提取、純化、酶解再純化制備一種對金 黃色葡萄球菌有抑制作用的多膚，并測定其氨基酸序列，為條斑紫菜和壇紫菜的高值化利 用提供新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種W條斑紫菜為原料制備一種新型抗菌膚的方法，并就 其氨基酸序列進(jìn)行測定。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的主體工藝包括條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)初步純化、酶 解、分級、純化及序列分析等步驟，其中
[0007] 條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)的初步純化：先將條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)溶液W30%飽 和度硫酸錠沉淀，離屯、去除沉淀，上清液硫酸錠飽和度調(diào)至50%，離屯、，將沉淀經(jīng)透析除鹽， 制成水溶性蛋白質(zhì)II凍干粉。
[000引水溶性蛋白質(zhì)II的酶解與分子量分級：將水溶性蛋白質(zhì)IIW胃蛋白酶降解，胃蛋 白酶使用量為底物蛋白質(zhì)質(zhì)量的1/1000,介質(zhì)抑1. 5,在40°C酶解2小時。將酶解液超濾， 保留分子量< 5KD級分并凍干保存。 陽009] 抗菌膚純化：取分子量< 5邸級分適量，上Se地adexG-25層析柱，蒸饋水洗脫，控 制流速0. 7血/min,每4分鐘收集1管，洗脫結(jié)束后，分別在220皿和280皿下比色得洗脫曲 線（圖1)，活性測定后將峰2凍干得膚樣品A。取A適量上Se地adexC-25層析柱，分別在 220nm和280nm下比色得到洗脫曲線（圖2)，經(jīng)活性測定得知峰2具強(qiáng)抑菌活性，凍干得膚 樣品B備用；
[0010] 抗菌膚序列分析：對膚樣品B進(jìn)行混合質(zhì)譜測序數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析，確定膚段 氨基酸序列為：TPDSEAL分子量：732,等電點(diǎn)（pi) :9. 59.該抗菌膚質(zhì)譜圖見圖3.
[0011] 本發(fā)明純化過程簡便，所得抗菌膚產(chǎn)品純度高。
【附圖說明】
[0012] 圖1是Se地adexG-25層析洗脫曲線
[0013] 圖2是Se地adexC-25層析洗脫曲線
[0014] 圖3是抗菌膚質(zhì)譜圖
【具體實(shí)施方式】：
[0015] 下面通過實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述：
[0016] 先將條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)溶液（含蛋白質(zhì)100. 0克）W30 %飽和度硫酸錠沉 淀，離屯、去除沉淀，上清液硫酸錠飽和度調(diào)至50%，離屯、，將沉淀經(jīng)透析除鹽，制成水溶性蛋 白質(zhì)II凍干粉21. 1克；取10克W蒸饋水溶解后W胃蛋白酶降解，胃蛋白酶使用量為底物 蛋白質(zhì)質(zhì)量的1/1000,調(diào)節(jié)介質(zhì)抑1. 5,在40°C酶解2小時，將酶解液超濾分級得分子量 < 5邸級分凍干粉2. 2克；取分子量< 5邸級分適量，上Se地adexG-25層析柱，蒸饋水洗 脫，控制流速0. 7血/min,每4分鐘收集1管，洗脫結(jié)束后，分別在220皿和280皿下比色得 洗脫曲線（圖1)，將峰2凍干得膚樣品A;取A適量上Se地adexC-25層析柱，分別在220皿 和280nm下比色得到洗脫曲線（圖2)，將峰2凍干得膚樣品B備用；對膚樣品B進(jìn)行混合質(zhì) 譜測序數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析，確定膚段氨基酸序列為：TPDSEAL分子量：732,等電點(diǎn)（pi): 9. 59〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種條斑紫菜抗菌肽的純化方法及其氨基酸序列，包括如下步驟： 條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)的初步純化：先將條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)溶液以30%飽和度 硫酸銨沉淀，離心去除沉淀，上清液硫酸銨飽和度調(diào)至50%，再離心，將沉淀經(jīng)透析除鹽，制 成水溶性蛋白質(zhì)II凍干粉； 水溶性蛋白質(zhì)II的酶解與分子量分級：將水溶性蛋白質(zhì)II以適量蒸餾水溶解后以胃 蛋白酶降解，胃蛋白酶使用量為水溶性蛋白質(zhì)II質(zhì)量的1/1000,介質(zhì)PHI. 5,在40°C酶解2 小時，將酶解液超濾，保留分子量< 5KD級分并凍干保存； 抗菌肽純化：取分子量<5KD級分適量以蒸餾水溶解后上S印hadexG-25層析柱，蒸餾 水洗脫，控制流速0. 7mL/min，每4分鐘收集1管，洗脫結(jié)束后，分別在220nm和280nm下比 色得洗脫曲線，將峰2凍干得肽樣品A;取A適量上S印hadexC-25層析柱，分別在220nm和 280nm下比色得到洗脫曲線，將峰2凍干得肽樣品B; 抗菌肽序列分析：對肽樣品B進(jìn)行混合質(zhì)譜測序數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析，確定肽段氨基 酸序列為：TTOSEAL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種條斑紫菜抗菌肽的純化方法，該方法包括條斑紫菜水溶性蛋白質(zhì)的初步純化、水溶性蛋白質(zhì)II的酶解與分子量分級、抗菌肽純化及抗菌肽序列分析等步驟。本發(fā)明對條斑紫菜中水溶性蛋白質(zhì)經(jīng)過飽和度為30～50％硫酸銨鹽析分級獲得水溶性蛋白質(zhì)II，再經(jīng)胃蛋白酶降解、超濾分級獲得分子量＜5KD級分，先上Sephadex？G-25層析柱，蒸餾水洗脫，洗脫曲線峰2組分上Sephadex？C-25層析柱繼續(xù)純化，洗脫曲線峰2組分凍干即得抗菌肽TPDSEAL，該抗菌肽對金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑制作用。本發(fā)明純化方法簡便快捷，可用于以我國資源豐富的條斑紫菜為原料制備抗菌肽，對條斑紫菜的高值化利用具有重要意義。
【IPC分類】C12P21/06, C07K7/06, C07K1/16
【公開號】CN105255977
【申請?zhí)枴緾N201510448341
【發(fā)明人】魏玉西, 于佳, 徐傳金, 于春燕, 宋惠平, 王文秀
【申請人】青島大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年7月24日