專利名稱：條斑紫菜tps基因及其在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及條斑紫菜TPS基因及其在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上第二大糧食作物，稻米是世界上約一半人口的主食，在我國水稻是第一大糧食作物。對水稻的耐鹽特點(diǎn)已經(jīng)有了基本的闡述([1]胡時(shí)開，陶紅劍，錢前， 等·水稻耐鹽性的遺傳和分子育種的研究進(jìn)展.分子植物育種，2010,8(4) :629-640 ； [2] 張素紅，劉立新，劉忠卓.水稻耐鹽研究與育種進(jìn)展.北方水稻，2009，39 (3) :118-121 ； [3] 祁棟靈，翰龍植，張三元.水稻耐鹽/堿性鑒定評(píng)價(jià)方法.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2005，6 (2) 226-231.)。水稻的耐鹽特點(diǎn)是1)水稻由淡水沼澤植物演化而來，其耐鹽性較差，對鹽脅迫比較敏感；幻水稻在苗期與生殖生長期是鹽脅迫敏感期；幻不同品種耐鹽性差很大，耐鹽性高的品種非常缺乏。實(shí)際上土壤鹽漬化是限制水稻種植面積擴(kuò)大的主要因子，另外鹽脅迫也是造成水稻減產(chǎn)的最重要環(huán)境因子。因此，挖掘耐鹽基因、培育耐鹽水稻品種是擴(kuò)大我國水稻栽培面積、增加水稻產(chǎn)量的重要途徑，對提高我國糧食產(chǎn)量、保障糧食安全具有積極的意義。海藻糖具有抵御鹽、干旱等脅迫保護(hù)生物細(xì)胞的作用，將海藻糖合成相關(guān)基因?qū)胧荏w植物提高其耐鹽、抗旱等抗逆性是植物基因工程研究的一個(gè)熱點(diǎn)。研究表明在大腸桿菌、酵母菌及高等植物中，海藻糖的合成分別由6-磷酸海藻糖合成酶(TPQ與6-磷酸海藻糖酯酶(TPP)依次催化完成。將TPS或TPP基因單獨(dú)導(dǎo)入受體植物可提高其耐鹽等抗逆性，但往往伴隨轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育不正常、植株出現(xiàn)畸形的現(xiàn)象，不符合實(shí)際需要。2002年，美國學(xué)者Garg等將大腸桿菌中編碼TPS酶的基因(otsA)與編碼TPP酶的基因(otsB)融合在一起，將融合基因(TPSP)導(dǎo)入水稻品種，在組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子與脅迫相應(yīng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，分別獲得了耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)基因植株的海藻糖含量可提高3-10倍，在IOOmM的NaCl溶液中轉(zhuǎn)基因水稻苗表現(xiàn)良好，而非轉(zhuǎn)基因植株
([4]GargA K, Kim J K, Owens T G, et al. Trehalose accumulation in rice plants confers hightolerance levels to different abiotic stresses[J]. Proc. Natl. Acad. Sci.，2002，99 :15898-15903.)。2003 年，韓國學(xué)者 Jang 等采用類似的技術(shù)途徑，將otsA與otsB形成的融合基因?qū)胨疽搏@得了形態(tài)發(fā)育正常、對IOOmM的 NaCl 表現(xiàn)抗性的轉(zhuǎn)基因水稻植株([5] Jang I C, Oh S J，Seo J S，et al. Expression of abifunctional fusion of the Escherichia coli genes for trehalose-6-phosphate synthaseand trehalose-6-phosphate phosphatase in transgenic rice plants increases trehaloseaccumulation and abiotic stress tolerance without stunting growth [J], Plant Physiol.，2003，131 :516-524.)。但目前還沒有同時(shí)具有 TPS 和 TPP 結(jié)構(gòu)域的天然基因轉(zhuǎn)化植物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中水稻耐鹽性差且沒有同時(shí)具有TPS和TPP結(jié)構(gòu)域的天然基因轉(zhuǎn)化植物的情況，本發(fā)明提供了條斑紫菜TPS基因及其在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用，所述TPS基因既有TPS結(jié)構(gòu)域，又有TPP結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)天然的雙結(jié)構(gòu)域TPSP基因，將TPS基因轉(zhuǎn)入水稻中，可以顯著提高水稻的耐鹽性。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供了條斑紫菜TPS基因，其序列表如SEQ ID No 1所示。所述TPS基因在225-1650堿基處有TPS結(jié)構(gòu)域，在1800-2475堿基處有TPP結(jié)構(gòu)域?？寺∷鯰PS基因的引物有三對，其名稱和序列如下第一對弓I物是 TPSRl (GACTCATATGACCCCCGGGCCTATCACTA)與 3Kpn I (CATGATGCTGTACAGCGCAAG)，分別與該基因第1-22堿基和第1339-1359堿基對應(yīng)；第二對引物是 Tr e 1 (CTACGCGCGTCACTTTCTCTC)與 TPSa2 (CACTCCTTCGAATTCTTCTTG)，分別與該基因第 861-88 堿基 1 和第 2034-2054 堿基對應(yīng)；第三對弓丨物是TPSb 1 (CAAGAAGAATTCGAAGGAGTG)與 TPSb2 (GACTAAGCTTCTACTGGCTC GGCAACGAGGAC)，分別與該基因第2034-2054和堿基第2706-2727堿基對應(yīng)。本發(fā)明還提供了所述的條斑紫菜TPS基因的植物表達(dá)載體，進(jìn)一步的，所述植物載體為 pCAMBIA2300-PyTPS。本發(fā)明還提供了所述條斑紫菜TPS基因在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)將條斑紫菜TPS基因轉(zhuǎn)入水稻，對水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測的引物為Pl 5' -CTACGCGCGTCACTTTCTCTC-3‘，P2 5' -CATGATGCTGTACAGCGCAAG-3‘；用引物Pl和P2擴(kuò)增出499bp的PyTPS基因的一段序列，其序列表如SEQID No 2所示。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)對條斑紫菜TPS基因轉(zhuǎn)入水稻，對水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測的引物為P3 5' -AGGGAGGACGCACAATCCCACTAT-3‘，P4 5' -GCACGCAAGCGGAGAGAAAGTGACG-3‘；用引物P3與P4擴(kuò)增出 IOOObp的一段序列，它包含有如SEQ ID No :3所示的 892bp的PyTPS基因的序列。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)對水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測的反應(yīng)體系為25 μ L， 其中2. 5mmol/L的dNTPs 1 μ L，濃度為10 μ mol/L的上游和下游兩種引物各1 μ L，10XPCR buffer 2· 5 μ L，模板 DNA 1 μ L, 5U/ μ L 的 Taq 聚合酶 0. 2 μ L ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性 ^iin ；94°C變性 lmin，59°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ； 最后72°C延伸IOmin ；4°C保溫，共；35個(gè)循環(huán)。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)水稻轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽濃度為5%。-8%。。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
1、本發(fā)明從大型食用海藻條斑紫菜中克隆了 TPS基因(PyTPS)，測序結(jié)果表明該基因既有TPS結(jié)構(gòu)域，又有TPP結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)天然的雙結(jié)構(gòu)域TPSP基因；而現(xiàn)有技術(shù)中采用的TPSP基因都是經(jīng)體外重組形成的融合基因。2、用條斑紫菜的TPS基因轉(zhuǎn)化水稻，該TPS基因來自生產(chǎn)養(yǎng)殖可食用的藻類，目的基因的來源是安全的，其安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國內(nèi)外同類研究所采用的目的基因。3、TPS轉(zhuǎn)基因水稻植株形態(tài)發(fā)育正常，轉(zhuǎn)基因水稻苗抗0. 8% NaCl的脅迫；相比現(xiàn)有研究中轉(zhuǎn)基因水稻只耐IOOmM NaCKO. 58% NaCl)的脅迫，本發(fā)明將TPS轉(zhuǎn)基因應(yīng)用于水稻可顯著提高其耐鹽性。4、對轉(zhuǎn)基因水稻中的TPS基因進(jìn)行了連續(xù)6代(T6)的跟蹤檢測，進(jìn)行了遺傳傳遞和遺傳穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明TPS基因在轉(zhuǎn)基因植株中能穩(wěn)定地遺傳，結(jié)果具有更強(qiáng)的可靠性。現(xiàn)有技術(shù)中只報(bào)道了 T2代的結(jié)果和T4代的結(jié)果。5、轉(zhuǎn)化體系非常有效。在較短的時(shí)間內(nèi)可以獲得大量轉(zhuǎn)基因植株，這是獲得大量轉(zhuǎn)基因苗并從中篩選出耐鹽性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株的重要前提。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清林疋。


圖1是本發(fā)明中pCAMBIA2300_PyTPS的結(jié)構(gòu)圖。圖2是本發(fā)明中愈傷組織分化獲得的不定芽與植株，1. G418抗性愈傷及不定芽； 2.再生植株。圖3是本發(fā)明中Tl轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)5%。的NaCl 了處理后的結(jié)果，圖中除了對照 TP309以外，其余都是Tl轉(zhuǎn)基因植株。圖4是本發(fā)明中對Tl轉(zhuǎn)基因株系H191進(jìn)行3-12%。NaCl抗鹽梯度測定，各處理所用的 NaCl 濃度:1·水(對照)；2. 3%o ；3. 6%。；4. 8%。；5. 10%。；6. 12%。·。圖5是本發(fā)明中T2轉(zhuǎn)基因株系的卡那霉素抗性鑒定，1.對照TP309 ；2.卡那霉素抗性雜合轉(zhuǎn)基因株系；3.卡那霉素抗性純合轉(zhuǎn)基因株系。圖6是本發(fā)明中T2轉(zhuǎn)基因株系的PCR檢測結(jié)果，A.引物為Pl與P2;B.引物為 P3 與 P4 ；C.引物為 NPTII-F 與 NPTII-R,圖中:M. DNA markerD2000 ；PCR 模板 DNA 為 1-4.轉(zhuǎn)基因株系H155 ;5-8.轉(zhuǎn)基因株系H199 ；9-12.轉(zhuǎn)基因株系Y308 ； 13.對照TP309 ； 14. pCAMBIA2300-PyTPS 質(zhì)粒；15.對照(水)。圖7是本發(fā)明中T2轉(zhuǎn)基因株系的Southern雜交結(jié)果，Μ. λ DNA/Hindlll ； 1-2. H155 ； 3-4. H191 ；5-6. Y308 ；7-8. TP309。圖8是本發(fā)明中T2轉(zhuǎn)基因株系的RT-PCR分析，A. PyTPS ；B. OsActinl，1. TP309經(jīng)水處理；2. TP309經(jīng)8%。的NaCl溶液處理；3. H155經(jīng)水處理；4. H155經(jīng)8%。的NaCl溶液處理；5. H191經(jīng)水處理；6. H191經(jīng)8%。的NaCl溶液處理；7. Y308經(jīng)水處理；8. Y308經(jīng)8%0的 NaCl溶液處理。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1一、實(shí)驗(yàn)材料1.基因、菌種與水稻品種本發(fā)明克隆了條斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPQ基因(PyTPS)，大腸桿菌 DH5 α、根癌農(nóng)桿菌菌株AGLl由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室實(shí)驗(yàn)室保存，轉(zhuǎn)基因的受體材料為水稻(Oryza sativa L.)品種“臺(tái)北309”(TP309)(湖南雜交水稻研究中心提供)。2.植物培養(yǎng)基水稻轉(zhuǎn)化中采用的培養(yǎng)基有六種1)誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基:MS+2,4-D 2mg/L+CH 0. 3g/L+ 脯氨酸 2. 8g/L+ 蔗糖 45g/ L+phytage 3. Og/L, pH5. 8 ；2)愈傷繼代培養(yǎng)基:MS+2，4-D 2mg/L+CH 0. 3g/L+ 脯氨酸 0. 5g/L+ 蔗糖 30g/ L+phytage 3. Og/L, pH 5. 8 ；3)共培養(yǎng)培養(yǎng)基:CC+AS 20mg/L+CH lg/L+ 脯氨酸 0. 5g/L+KT0. 8mg/L+NAA 0. 2mg/L+ 麥芽糖 25mg/L+phytage 3. Og/L, pH 5. 2 ；4)篩選培養(yǎng)基:CC+2,4-D 2mg/L+ 麥芽糖 20mg/L+ 甘露醇 36. 43mg/L+Cef400mg/ L+G418100-150mg/L+phytage 3. Og/L,pH 5.8 ；5)分化培養(yǎng)基:MS+NAA 0. 2mg/L+TDZ lmg/L+KT 1. 6mg/L+CH lg/L+ 山梨醇 30g/ L+ 蔗糖 30g/L+phytage 3. 8g/L, pH 5. 8 ；6)生根壯苗培養(yǎng)基 d/^MS+MET 2mg/L+ 蔗糖 20g/L+phytage 3. Og/L, pH 5. 8。二、實(shí)驗(yàn)方法本發(fā)明包括以下具體實(shí)驗(yàn)步驟1. PyTPS基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建(1)擴(kuò)增 PyTPS 基因條斑紫菜(Porphyra yezoensis)由中國科學(xué)院海洋研究所提供，通過RACE-PCR 及RT-PCR擴(kuò)增、克隆了 PyTPS基因，獲得了重組質(zhì)粒pET22b-PyTPS。構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)， 以重組質(zhì)粒pET22b-PyTPS為模板進(jìn)行PCR獲得PyTPS全長基因。PCR時(shí)采用P5與P6引物。P5 TCTAGAATGACCCCCGGGCCTATCACTA (Xba I)，(SEQ ID No 10)；P6 GTCGACCTACTGGCTCGGCAACGAGGAC (Sal I)，(SEQ ID No :11)。PyTPS基因全長2727bp，測序顯示該基因的序列是(SEQ ID No 1)ATGACCCCCGGGCCTATCACTACCGATGCCGCTGCTGGTGTTGGCGTGGACACGATGGACGGCACGATGAAGTGGGAGCTCTTTGAGGAGAACCGCACCCTTACTACCCGCTCCGGCCAAATGATTGTGAACGACGGGGAGTTTGGGAAGTGGAATGATACTGATGAGGGGCGTGTCAAGTGCTTTCTGACGCCGGACGAAGGCTTTGGTGACGCCATCGAGAGCCTAGTCATTGTGCTGTACCGACTGCCTATCATTGCGAAGCGCGACGCGACCACGGGAGCTTGGAGCTTCAAATGGGACGATGACGCCCTCTACCTAACTTCCACCGGTTTGCGGAAGGGCTTGGAGCAGCTTAAGGTGGCACCTCTCTGGGTGGGCATATTGAACTCCGACGACGAGGTGCCCCGGCAAGAGCGTGAAGGGGTCGCCGACCGGCTGTTGGAG
GAGTTCAACTGCGTTCCCGTCTTCATCCCGCACGACACGCTGAAGCAGTT
ATACCAGGGCTTCTGCAAAGGCACCCTCTGGCCGCTTTTTCACATGGTGT
CGTCGGCGACAGACCACACGGAACACACTACCCGCTTTGACGACCGCCT
TTGGCGTGTTTACATGAACGTCAACCGGATGTTCCGGGACAAGGTGGTGG
AGGTGTACGATGGGGACCGAGCACTCATTTGGGTACACGACTACCACCTG
ATGCTTTTGCCGCAGGCATCGCGCTCGCGCCTGTCAGGTGTGAAGATTGG
CTTCTTTCTCCATATTCCGTGGCCTTCGTCAGAAGTGTACCGCGTGCTGCC
GTGGCGGAACGAACTGCTGAAGGGCATGCTTTCCGCGACGTTGCTGGGC
TTCCATCTTTTCGACTACGCGCGTCACTTTCTCTCCGCTTGCGTGCGGCTG
CTTAACCTGGAGCACGAGGCGAACAGGGGCTCCCTCGGTCTGGAGTACG
ACGGTCGCCACGTTATGCTGCGCGTGAGTCACATTGGCGTGGACCCAGAG
CGCTTTTCCGAGGGCCTGAGCGCGCCGTCGCTGACGGACCGGGTTGCCG
AGTTCAAGGAGCGGTTTGCGGATTGCACAGTCCTCGGTGCCGTGGACGA
CCTTGACCTCATCAAGGGCATTGCCCTCAAGCTGATGGGTTTCCAGCGGT
ATCTCGATTCCGCCCCCAAGATGCGAGGAAAGGTCGTACTTGTGCAAGTT
GCCATCCCAAAGGCGGCCCGCGTCAAGGAGTCTGTGCGTAACGAGATTC
GGGAGCTGGTGGCTGCCATCAACAACAAACACGGCGATGGGTCGGGGCG
GCGACCCGTATGGTACCTGGAAGAGAGCATCTCCTTTGAAAGCCGCCTTG
CGCTGTACAGCATCATGGATGCACTGGTGGTGACCCCCATCCGTGACGGC
CTCAACCTCATCCCATACGAGTACATTGTATCGACGTCCGAGGGGAAGGG
CCAGCTAATTCTTTCGGAGTTTACTGGCTGCTCGCGGGCGCTCTCATCTGC
GGAACGTGTCAACCCGTGGGACTTGGAGAAGCTGTCCAACGTCCTTGAC
ATGGTCGTTCAGAAGGCCATTGCCGCGGCGCCCGAGGTGGAGCTGAAGC
GTCGGGCGGACAAGGCCTACGTGTCGGCCCACTCGTCCCAGCAGTGGGC
GCAGTCGTTTTTGCATGACTTGAAGGAGGCGTCAGAGCCGGCACAGGTC
GTTGTCAAGGTGGGTCCGCTGGCCGGCTTGCCTGGTGTACTGGCCTACGA
CGAGTTCACCCTTCTCAACCGCTCGGCGGTTCTGCGCGCCTACAAGGCCG
CCAAGAGGCGCTTGTTCCTGTTTGACTATGATGGGACGCTGACCTCCATC
ACCGATCAGTCGTCCCAGATGGCCCACGCGTGGGCGCGGCCGAGCGAGG
CTGTGGCCGCCAACTTGGACACTTTGTCAAAGGACCCGCTCAACGATGTC
TACATCATGTCTGGCCGCAAGACTGAGGTGCTTGAAGCCGGCCTCAACAA
CTCCCCCACGATTGGGATTGCAGCTGAGCACGGCTTCTTCTACCGCAAGA
AGAATTCGAAGGAGTGGAACAGGCTGTTGGAGGATGCGGACCTGTCATG
GATGGAGTTGGCATTGCGTATCATGCTTATGTACACGGACCGTACGGACGG
ATCCTACGTGGAGCAGAAGAAGGCTGGCCTCGTGTGGCACTACCTGGAC
GCGGACCGGGAATTTGGCTCGTGGCAGGCGAAGGAGATGCGTGACCATC
TTGAGTCGCTGCTTTCTCCCTTCTCTGTGCAGGTGGTCACAGGCTATGGAT
GGCTTCAGGTCCGGATGGCTGCGATGAACAAGGGCGTTATGGTCGAGAC
GATTCTTCGCGATATGCCCGAGCCCCCGGACTTTGTGCTCTGCTGTGGCGA
CGACCGCACGGATGAGGACATGTTTGCGTATCTGGACACTCATCTGGACCCTTCTGTGAAGCAGTTCACTTGCACAGTGGGCGTCAAGCCGAGCCACGCGCGCTACTACCTGCACTCATCCAATGAGGTGGGCGCGCTTCTGGAGACGCTGGTAACTGGAAGCTACCCGCGCGGCGTGCGCCCTCGCCCGCGTGGTGGTTCTGTGTCCCTTGCGGACCTTGTACCCGACGACGAAGGCTCCTCCAGCACACCGGCGGTGCCGCAGAGGACCAACGGACCTCGGACAAGCGCGTCGGGTCAGAAGAGACGAGGTCTGGCGTCCTCGTTGCCGAGCCAGTAG(2) PyTPS基因與克隆載體pMD18-T及植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S_0CS的連接回收PCR產(chǎn)物，并在T4 DNA連接酶作用下與載體pMD18_T(購買于TaKaRa)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci獲得了抗氨芐青霉素的菌落。提取重組質(zhì)粒， 用Ml I和)(ba I進(jìn)行雙酶切，回收含PyTPS基因的酶切片段，并克隆到植物表達(dá)載體 PCAMBIA2300-35S-0CS (購自澳大利亞Cambia公司)的對應(yīng)位點(diǎn)中，獲得該基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300-35S-0CS-PyTPS，簡稱為 pCAMBIA2300_PyTPS，其結(jié)構(gòu)圖如圖 1 所示。2、根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-PyTPS導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGLl時(shí)采用液氮速凍法。3、水稻品種TP309的轉(zhuǎn)化3. 1水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)水稻成熟種子去穎殼后，在超凈臺(tái)上用70%乙醇消毒1 2min，然后用20%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒30min，無菌水漂洗3 4次，再將種子放在無菌濾紙上吸干水分后，放在誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上，每皿30 40粒種子，26°C暗培養(yǎng)約7 IOd后，將萌發(fā)的芽去除，剝下成熟胚盾片長出的愈傷組織，轉(zhuǎn)入愈傷繼代培養(yǎng)基，在相同條件下繼代培養(yǎng)一周后，挑選繼代培養(yǎng)后致密性好，色澤淡黃的愈傷組織用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。3. 2農(nóng)桿菌的培養(yǎng)農(nóng)桿菌AGLl (pCAMBIA2300-PyTPS)在含有50mg/L卡那霉素的YEB平板上劃線， 培養(yǎng)48-7池。挑單菌落接種到含有卡那霉素和利福平各50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基
中，于^°C，200rpm培養(yǎng)Mh，直到0D600 = 0.5以上，離心并收集農(nóng)桿菌細(xì)胞。用Iml AAM+AS(乙酰丁香酮，其終濃度為20mg/L)培養(yǎng)基稀釋上述農(nóng)桿菌細(xì)胞后，加到IOOml的 AAM培養(yǎng)基中，于^°C，IOOrpm培養(yǎng)2h。3. 3農(nóng)桿菌感染與水稻的遺傳轉(zhuǎn)化將繼代培養(yǎng)一周后的愈傷組織放入無菌三角瓶中，加入適量上述農(nóng)桿菌浸染液， 于，SO-IOOrpm培養(yǎng)20分鐘。倒掉浸染液，取出愈傷組織，在無菌濾紙上吸去多余菌液， 放在超凈臺(tái)上吹(約2-3小時(shí))，轉(zhuǎn)移到鋪有一層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上，愈傷應(yīng)擺放整齊，相互之間不要疊放，28°C暗培養(yǎng)2 3d。3.4 G418抗性愈傷的篩選與分化將共培養(yǎng)后的愈傷組織接種在篩選培養(yǎng)基(CC+2，4_D ^ig/L+麥芽糖20mg/L+ 甘露醇 36. 43mg/L+Cef 400mg/L+G418 100mg/L+phytage 3. Og/LpH 5. 8)上，28°C 暗培養(yǎng) 20 25d后，將一篩愈傷組織轉(zhuǎn)入二篩培養(yǎng)基(CC+2，4-D ang/L+麥芽糖20mg/L+甘露醇 36. 43mg/L+Cef 400mg/L+G418150mg/L+phytage 3. Og/L pH 5. 8)，大部分愈傷組織在篩選 IOd左右開始褐化，然后在褐化組織的邊緣選取重新長出的乳白色的抗性愈傷組織。
從經(jīng)2-3輪篩選后長出的抗性愈傷組織中挑選乳黃色致密性好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至，l^i/d光照條件下的分化培養(yǎng)基上，一般經(jīng)過20d左右，有綠點(diǎn)出現(xiàn)，30-40d后進(jìn)一步分化出小芽。3. 5植株再生、南繁加代當(dāng)小芽長至約Icm時(shí)，移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右，選擇高約6-8cm，根系發(fā)達(dá)的小苗用(Pl與P2)和(P3與P4)兩對引物逐株進(jìn)行PyTPS基因的PCR檢測，得到TO代轉(zhuǎn)基因植株793株(如圖2所示)。將轉(zhuǎn)基因植株在^TC，Wh/d光照條件下練苗2-3天。 用溫水洗去培養(yǎng)基，移栽入土，全都移栽到溫室中，當(dāng)植株長到16-18cm時(shí)，挑選了 100個(gè)健壯TO單株，當(dāng)年種到了海南島基地，南繁加代，有95株成活并于第二年初收到了種子(Tl)。4.轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻的每個(gè)世代都須用(Pl與P2)和(P3與P4)兩對引物進(jìn)行導(dǎo)入的PyTPS 基因的PCR檢測鑒定。對轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行PCR檢測的引物有3對。第一對引物Pl (如 SEQ ID No :4) :(5' -CTACGCGCGTCACTTTCTCTC-3 ‘)，P2(如 SEQ ID No :5) :(5' -CATGATGCTGTACAGCGCAAG-3‘)；第一對引物Pl和P2，擴(kuò)增產(chǎn)物為 500bp的PyTPS基因的一段序列，其序列表如下所示(如SEQ ID No 2)CTACGCGCGTCACTTTCTCTCCGCTTGCGTGCGGCTGCTTAACCTGGAGCACGAGGCGAACAGGGGCTCCCTCGGTCTGGAGTACGACGGTCGCCACGTTATGCTGCGCGTGAGTCACATTGGCGTGGACCCAGAGCGCTTTTCCGAGGGCCTGAGCGCGCCGTCGCTGACGGACCGGGTTGCCGAGTTCAAGGAGCGGTTTGCGGATTGCACAGTCCTCGGTGCCGTGGACGACCTTGACCTCATCAAGGGCATTGCCCTCAAGCTGATGGGTTTCCAGCGGTATCTCGATTCCGCCCCCAAGATGCGAGGAAAGGTCGTACTTGTGCAAGTTGCCATCCCAAAGGCGGCCCGCGTCAAGGAGTCTGTGCGTAACGAGATTCGGGAGCTGGTGGCTGCCATCAACAACAAACACGGCGATGGGTCGGGGCGGCGACCCGTATGGTACCTGGAAGAGAGCATCTCCTTTGAAAGCCGCCTTGCGCTGTACAGCATCATG。第二對引物P3(如 SEQ ID No :6) :(5' -AGGGAGGACGCACAATCCCACTAT-3‘)；
P4(如 SEQ ID No :7) :(5' -GCACGCAAGCGGAGAGAAAGTGACG-3‘)；第二對引物P3與P4根據(jù)基因上游35S啟動(dòng)子和PyTPS基因序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物為 IOOObp的片段，該片段包括約200bp的載體序列與892bp的PyTPS基因的序列，892bp 的PyTPS基因的序列如下所示(如SEQ ID No 3)ATGACCCCCGGGCCTATCACTACCGATGCCGCTGCTGGTGTTGGCGTGGACACGATGGACGGCACGATGAAGTGGGAGCTCTTTGAGGAGAACCGCACCCTTACTACCCGCTCCGGCCAAATGATTGTGAACGACGGGGAGTTTGGGAAGTGGAATGATACTGATGAGGGGCGTGTCAAGTGCTTTCTGACGCCGGACGAAGGCTTTGGTGACGCCATCGAGAGCCTAGTCATTGTGCTGTACCGACTGCCTA
TCATTGCGAAGCGCGACGCGACCACGGGAGCTTGGAGCTTCAAATGGGACGATGACGCCCTCTACCTAACTTCCACCGGTTTGCGGAAGGGCTTGGAGCAGCTTAAGGTGGCACCTCTCTGGGTGGGCATATTGAACTCCGACGACGAGGTGCCCCGGCAAGAGCGTGAAGGGGTCGCCGACCGGCTGTTGGAGGAGTTCAACTGCGTTCCCGTCTTCATCCCGCACGACACGCTGAAGCAGTTATACCAGGGCTTCTGCAAAGGCACCCTCTGGCCGCTTTTTCACATGGTGTCGTCGGCGACAGACCACACGGAACACACTACCCGCTTTGACGACCGCCTTTGGCGTGTTTACATGAACGTCAACCGGATGTTCCGGGACAAGGTGGTGGAGGTGTACGATGGGGACCGAGCACTCATTTGGGTACACGACTACCACCTGATGCTTTTGCCGCAGGCATCGCGCTCGCGCCTGTCAGGTGTGAAGATTGGCTTCTTTCTCCATATTCCGTGGCCTTCGTCAGAAGTGTACCGCGTGCTGCCGTGGCGGAACGAACTGCTGAAGGGCATGCTTTCCGCGACGTTGCTGGGCTTCCATCTTTTCGACTACGCGCGTCACTTTCTCTCCGCTTGCGTGC。第三對引物NPT II-F(如 SEQ ID No :8) (5‘ -TCCGGTGCCCTGAATGAACT-3‘)；NPT II-R(如 SEQ ID No 9) (5' -GGCGATACCGTAAAGCACGA-3‘)。第三對引物NPT II-F和NPT II-R，擴(kuò)增產(chǎn)物為 580bp的載體pCAMBIA2300上卡那霉素抗性基因的片段。4. 1水稻葉片總DNA的提取取葉片0. 2g左右，在1. 5mL的EP管中加入液氮研磨，然后加入500μ L65°C預(yù)熱的抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA, 500mM NaCl, 1. 5% SDS)，65°C 水浴 30min (要不時(shí)輕輕晃動(dòng))。加入200 μ L 5Μ醋酸鉀，冰浴30min，然后加入500 μ L氯仿，輕輕混勻后，冰浴lOmin。9，OOOrpm離心lOmin，取上清，加入0. 6倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，-20°C放置30min，12，OOOrpm離心IOmin沉淀DNA，并用70%的乙醇洗兩遍，吹干后溶于 50 μ L ρΗ7. 5的TE緩沖液中。需要較大量的DNA時(shí)(例如Southern雜交分析)，可用上述方法在大離心管中提取。4. 2 PCR 反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25 μ L，其中dNTPs (2. 5mmol/L) 1 μ L，上游和下游兩種引物 (10ymol/L) # IyL, 10XPCR buffer 2.5yL，模板 DNA 1 μ L (0· 1_0· 2 μ g)，Taq 聚合酶 (5U/yL)0. 2yL0 PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性^iin ；接下來35個(gè)循環(huán)為94°C變性lmin， 59°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ；最后 72°C延伸 IOmin :4°C保溫。5. Tl代轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性篩選從Tl代種子每個(gè)株系各取50粒，進(jìn)行催芽壯苗處理獲得Tl代幼苗。處理方法是先在37°C條件下催芽3天；出完芽后進(jìn)行壯苗，在M°C，14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)12天。將得到的Tl代幼苗先用3-5%。的NaCl溶液處理13天，每隔2天換一次 NaCl溶液，保持NaCl溶液的濃度，進(jìn)行耐鹽性篩選時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的TP309為對照。獲得了抗5%。的NaCl而且PCR陽性的Tl植株78個(gè)(如圖3所示)。將這78個(gè)Tl代轉(zhuǎn)基因株在正常條件下種植，擴(kuò)繁，形成株系，分別收獲種子0 ，保存?zhèn)溆谩?br> 對上面初篩選出抗5%。NaCl的這78個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，另取Tl代種子50粒按初篩相同方法再用6-12%。的NaCl溶液進(jìn)行進(jìn)一步的耐鹽梯度測定，有5個(gè)株系在8%。的NaCl 溶液處理下雖然幼苗高度稍有降低，但生長基本正常，NaCl的濃度再高，植株受害嚴(yán)重(如圖4所示)，而且復(fù)水后難以恢復(fù)正常生長，所以我們認(rèn)為這5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的抗鹽濃度為 8%。。對篩選出的少數(shù)高度抗鹽的株系，進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。6.對高度抗鹽的T2代轉(zhuǎn)基因株系的進(jìn)一步鑒定對經(jīng)過耐鹽性篩選，最后獲得的高度抗鹽的少數(shù)T2代轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步進(jìn)行一下鑒定。對上面篩選得到的抗鹽T2轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了卡那霉素抗性、PCR、Southern以及 RT-PCR分析6. 1卡那霉素抗性測定對獲得的高度抗鹽而且PyTPS基因PCR檢測結(jié)果為陽性的T2轉(zhuǎn)基因株系，各取其種子60粒，在37°C溫箱中浸種催芽72h，然后置于含有滅菌水的培養(yǎng)皿中于溫室(1 光照1 黑暗)中培養(yǎng)。待芽長至大約Icm左右時(shí)，加入卡那霉素(達(dá)到濃度為100mg/L) 對幼苗進(jìn)行卡那霉素抗性表現(xiàn)的鑒定，并以未轉(zhuǎn)基因的TP309為對照。用100mg/L卡那霉素對5個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因水稻幼苗進(jìn)行處理，前四天變化不明顯， 而到第5d時(shí)對照和非抗性幼苗莖的中部明顯變白，而抗性幼苗仍然保持綠色，到第7d時(shí)停止處理，并換用滅菌水培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)5d后觀察結(jié)果。5個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因株系中有三個(gè)株系 (H155，H191和TO08)的所有幼苗全部都為綠色，表現(xiàn)為純合抗性(如圖5所示)；另外兩個(gè)株系(H759和TO71)有白色植株出現(xiàn)，表現(xiàn)為雜合抗性，而對照TP309的所有幼苗都變成白色，沒有抗性。6. 2 PCR 檢測把卡那霉素抗性測定表現(xiàn)純和抗性的株系移栽到田間，生長至分孽完成后，取葉片按前面4. 1所述方法提取轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)基因的對照株系的基因組DNA，溶于pH7. 5的 TE中，用于PCR檢測和Southern雜交分析。把得到的三個(gè)對卡那霉素表現(xiàn)純合抗性的株系用前面材料中介紹的三對PCR引物對導(dǎo)入的PyTPS和NPTII基因進(jìn)行全面PCR檢測，結(jié)果表明所有引物在這三個(gè)株系中都擴(kuò)增出了預(yù)期的產(chǎn)物，即這三個(gè)T2轉(zhuǎn)基因株系都含有導(dǎo)入的目的基因PyTPS和抗菌素選擇基因NPTII (如圖6所示)。6. 3 Southern 雜交分析進(jìn)行Southern雜交分析時(shí)。每種DNA樣品各取樣10 μ g，用限制性內(nèi)切酶EcoRI 37°C酶切過夜。完全酶切后，在50V的電壓下，跑0. 8%瓊脂糖凝膠10-12小時(shí)進(jìn)行電泳分離。電泳后將凝膠用0. 25M HCl脫嘌呤lOmin，在0. 4M NaOH溶液中變性30min，用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將 DNA轉(zhuǎn)至Hybond N+尼龍膜(AmershamPharmaria Biothech,USA)上，用于 Southern 雜交。一段包括質(zhì)粒上部分35S啟動(dòng)子和部分目的基因序列的約500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 采用隨機(jī)引物法用a-32P-dCTP標(biāo)記后，用作探針。65°C溫育20h，進(jìn)行Southern雜交分析。用 2XSSC/0. SDSUXSSC/0. 1% SDS 和 0. 5X SSC/0. 1 % SDS 洗膜液，在 65°C 的條件下依次振蕩漂洗。洗膜完畢后，用濾紙將尼龍膜吸干，保鮮膜包裹，置于磷屏(Amersham Pharmacia Biotech, USA)中進(jìn)行放射自顯影。對上面得到的3個(gè)T2轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果顯示出對照TP309中都沒有雜交信號(hào)，而所有的轉(zhuǎn)基因植株均有雜交信號(hào)，H155有兩條雜交帶，H191和TO08 只有一條雜交帶，這表明外源基因在H155中有兩個(gè)拷貝，在H191和TO08的中只有一個(gè)拷貝。Southern雜交結(jié)果表明PyTPS基因已整合到這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的基因組中(如圖7所示)°6. 4 RT-PCR 分析經(jīng)過前面各項(xiàng)檢測篩選出的少數(shù)T2轉(zhuǎn)基因株系的種子和未轉(zhuǎn)基因的對照種子萌發(fā)，幼苗用8%。的NaCl溶液脅迫處理12小時(shí)后取樣，參照Zhang等(Plant Physiol, 2004, 134 :1500-1513)的方法提取總RNA。取2 μ g經(jīng)DNAaseI處理的總RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 反應(yīng)體積25 μ 1，獲得第一鏈cDNA。取1 μ L第一鏈cDNA產(chǎn)物為模板，用引物3NGSP2和 TPS4(表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行表達(dá)分析，同時(shí)以水稻Actinl基因保守序列設(shè)計(jì)的引物OsActinl-F和OsActinl-R(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，以其擴(kuò)增產(chǎn)物046bp)的表達(dá)強(qiáng)度作為內(nèi)對照。對經(jīng)過上面篩選得到的3個(gè)T2轉(zhuǎn)基因株系幼苗進(jìn)行RT-PCR分析的結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)條件下對照TP309在水處理與鹽脅迫條件下均無擴(kuò)增產(chǎn)物，3個(gè)T2轉(zhuǎn)基因株系在水處理與鹽脅迫下均擴(kuò)增出相應(yīng)目的片段，這說明導(dǎo)入的PyTPS基因在鹽脅迫和非脅迫條件下都在轉(zhuǎn)錄水平上得到了表達(dá)，但在鹽脅迫條件下比非脅迫條件下表達(dá)量要高些(如圖8所示)°上述3個(gè)T2轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)過隨后連續(xù)多代的栽培、篩選鑒定，現(xiàn)在已到T6代，已
基本穩(wěn)定、純合。把卡那霉素抗性、PCR檢測、Southern雜交和RT-PCR分析都呈陽性的株系保留，繼續(xù)生長，收獲種子(T3)。表1 :T2代轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測用的PCR引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物
權(quán)利要求
1.條斑紫菜基因，其序列表如SEQID No: 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的條斑紫菜775基因，其特征在于所述775基因在225-1650堿基處有TPS結(jié)構(gòu)域，在1800-M75堿基處有TPP結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的條斑紫菜775基因，其特征在于克隆所述775基因的引物有三對，其名稱與序列如下第一對引物是 TPSRl (GACTCATATGACCCCCGGGCCTATCACTA)與 3Kpn I (CATGATGCTGTACAGCGCAAG)，分別與條斑紫菜 77^ 基因第 1-22 堿基和第 1339_1；359 堿基對應(yīng)；第二對引物是 Trel (CTACGCGCGTCACTTTCTCTC)與 TPSa2 (CACTCCTTCGAATTCTTCTTG), 分別與條斑紫菜基因第861-881堿基和第2034-20Μ堿基對應(yīng)；第三對引物是 TPai (CAAGAAGAATTCGAAGGAGTG)與(GACTAAGCTTCTACTGGCTCGGCAACGAGGAC)，分別與條斑紫菜基因第20:34-20 堿基和第2706-2727堿基對應(yīng)。
4.含有權(quán)利要求1所述的條斑紫菜775基因的植物表達(dá)載體。
5.、根據(jù)權(quán)利要求4所述的條斑紫菜775基因的植物表達(dá)載體，其特征在于所述植物載體為 pCAMBIA2300-/y^^。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的條斑紫菜775基因在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用。
7.、根據(jù)權(quán)利要求6所述的條斑紫菜775基因在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于將條斑紫菜775基因轉(zhuǎn)入水稻，對水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測的引物為Pl 50 - CTACGCGCGTCACTTTCTCTC-30,P2 50 -CATGATGCTGTACAGCGCAAG- 30 ；用引物Pl和P2擴(kuò)增出499bp的基因的一段序列，其序列表如SEQ ID No:2所示ο
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的條斑紫菜775基因在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于對紫菜775基因轉(zhuǎn)入水稻，對水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測的引物為P3 5' -AGGGAGGACGCACAATCCCACTAT-3‘，P4 50 -GCACGCAAGCGGAGAGAAAGTGACG-30 ；用引物P3與P4擴(kuò)增出 IOOObp的一段序列，它包含有如SEQ ID No:3所示的892bp 的775基因的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的條斑紫菜775基因在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于對水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測的反應(yīng)體系為25 μ ，其中2. 5 mmol/L WdNIPs ImL, 濃度為10 mmol/L的上游和下游兩種引物各1 mL，10'PCR buffer 2.5 mL，模板DNA 1 mL, 5U/mL 的 Taq 聚合酶 0. 2mL ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性 4 min ； 94°C變性 1 min，59°C退火 1 min，72°C延伸 1 min ； 最后72°C延伸10 min ；4°C保溫，共；35個(gè)循環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的條斑紫菜775基因在提高水稻耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于水稻轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽濃度為5%。-8%。。
全文摘要
本發(fā)明克隆了條斑紫菜TPS基因(PyTPS)，構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體并將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株獲得了工程菌株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻品種獲得了轉(zhuǎn)基因水稻，再經(jīng)過栽培和練苗獲得T0單株并收到了T1種子，用T1代轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)的幼苗進(jìn)行了PCR檢測和抗鹽性測定，獲得了T1代轉(zhuǎn)基因抗鹽株系，對T2代進(jìn)行卡那霉素抗性測定、PCR測定和Southern雜交，結(jié)果均表明PyTPS基因已整合到轉(zhuǎn)基因株系的基因組中。本發(fā)明中的PyTPS基因既有TPS結(jié)構(gòu)域，又有TPP結(jié)構(gòu)域；PyTPS基因來源是安全的；PyTPS轉(zhuǎn)基因水稻植株形態(tài)發(fā)育正常；PyTPS基因在轉(zhuǎn)基因植株中能穩(wěn)定地遺傳；且轉(zhuǎn)化體系非常有效。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102286494SQ20111027701
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者喬利仙, 馮艷賓, 王力, 王斌, 王晶珊, 王瑋, 翁曼麗, 郭寶太, 金德敏, 隋炯明 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)