一種建立肝細(xì)胞癌順鉑耐藥細(xì)胞株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肝細(xì)胞癌順鉬耐藥細(xì)胞株的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第 六，死亡率則居第三，且大多數(shù)肝癌患者診斷時(shí)已是中晚期，術(shù)后頻頻復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肝癌 患者的預(yù)后較差?；熓侵委煾伟┑闹匾侄沃唬熤谐３霈F(xiàn)且難以解決的是腫瘤 多藥耐藥性（multidrugresistance,MDR)，即腫瘤同時(shí)對(duì)多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化學(xué) 藥物產(chǎn)生交叉耐藥，它是化療失敗的主要原因。因此克服腫瘤多藥耐藥性以及防止或逆轉(zhuǎn) 腫瘤多藥耐藥的發(fā)生對(duì)于提高化療效果十分重要。而建立腫瘤耐藥細(xì)胞株對(duì)于研究腫瘤耐 藥機(jī)制、腫瘤細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)、開(kāi)發(fā)及評(píng)價(jià)新藥等具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 順鉬（cis-diaminedichloroplatinum，Q)DP)屬細(xì)胞周期非特異性藥物，具有細(xì) 胞毒性，可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程，并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用， 為臨床治療肝癌常用藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種肝細(xì)胞癌順鉬耐藥細(xì)胞株，本發(fā)明的另一目的是提供 該耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建方法。
[0005] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是以人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株LM3為誘導(dǎo)對(duì)象，設(shè)立順鉬濃度梯 度，尋找最大耐藥濃度，即、細(xì)胞可以存活并緩慢生長(zhǎng)的濃度，并以此濃度長(zhǎng)期刺激細(xì)胞4 個(gè)月以上，最終獲得人肝細(xì)胞癌順鉬耐藥細(xì)胞株LM3/CDDP細(xì)胞株。
[0006] 本發(fā)明提供了一種肝細(xì)胞癌順鉬耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建方法如下：
[0007] (1)取人肝癌細(xì)胞LM3細(xì)胞復(fù)蘇后用DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)；
[0008] (2)為找尋最適宜順鉬刺激濃度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LM3細(xì)胞種于24孔板中，分別加 入 0· 1μg/mL、0. 25μg/mL、0. 5μg/mL、lμg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL順鉬，適時(shí)傳 代或換液。
[0009] 每次傳代或換液時(shí)，均加入相應(yīng)濃度順鉬。以順鉬加入后細(xì)胞可以存活并緩慢生 長(zhǎng)的最大耐藥濃度作為篩選濃度。
[0010] 當(dāng)順鉬的濃度為0. 5μg/mL時(shí)LM3細(xì)胞可以存活但生長(zhǎng)非常緩慢；濃度小于 0. 5μg/mL時(shí)LM3細(xì)胞不但可以大量存活，還能較快生長(zhǎng)；濃度大于0. 5μg/mL時(shí)LM3細(xì)胞 全部死亡。因此，我們確定篩選濃度為0. 5μg/mL，并用該篩選濃度繼續(xù)長(zhǎng)期刺激細(xì)胞4個(gè) 月，最后篩選到能在〇. 5μg/mL順鉬刺激下快速生長(zhǎng)的LM3耐藥細(xì)胞，其最大耐藥濃度可達(dá) 3μg/mL〇
[0011] 本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述構(gòu)建方法獲得的肝細(xì)胞癌順鉬耐藥細(xì)胞株。
[0012] 本發(fā)明提供了一種肝細(xì)胞癌順鉬耐藥細(xì)胞株，該細(xì)胞株的構(gòu)建方法如下：
[0013] 復(fù)蘇人肝癌細(xì)胞株LM3細(xì)胞后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株LM3細(xì)胞接種于培養(yǎng)孔中；在培養(yǎng)孔中加 入順鉬至終濃度為0. 5μg/mL,適時(shí)傳代或換液；每次傳代或換液之后，均加入順鉬至終濃 度為0. 5μg/mL，連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月以上；篩選到仍能快速生長(zhǎng)的人肝癌細(xì)胞株LM3細(xì)胞即為 順鉬耐藥細(xì)胞株。
[0014] 本發(fā)明所述的順鉬耐藥細(xì)胞株是在0. 5μg/mL順鉬刺激4個(gè)月后，仍能快速生長(zhǎng) 的人肝癌細(xì)胞株LM3細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明所述的順鉬耐藥細(xì)胞株的最大耐藥濃度為3μg/L。
[0016] 本發(fā)明所述的順鉬耐藥細(xì)胞株命名為L(zhǎng)M3/⑶DP。
[0017] 本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、細(xì)胞周期的測(cè)定和劃痕實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)肝 癌耐藥株LM3/⑶DP的生物學(xué)特性，成功建立LM3/⑶DP耐藥株。
[0018] 本發(fā)明還提供了肝癌順鉬耐藥細(xì)胞株LM3/CDDP在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供了肝癌順鉬耐藥細(xì)胞株LM3/CDDP在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0020] 發(fā)明作用與效果
[0021 ] 本發(fā)明的建立肝細(xì)胞癌順鉬耐藥細(xì)胞株的方法簡(jiǎn)便易行，本發(fā)明可用于分析肝癌 細(xì)胞順鉬耐藥后的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)表型的變化；研究腫瘤對(duì)順鉬耐藥的分子機(jī)制和逆轉(zhuǎn)腫 瘤耐藥的方法及篩選其他抗腫瘤藥物；發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥標(biāo)志物以及篩選和評(píng)估新型抗腫瘤藥 物等，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是肝癌耐藥株LM3/⑶DP細(xì)胞的誘導(dǎo)建立驗(yàn)證圖；
[0023] 圖2是光學(xué)顯微鏡下LM3和LM3/⑶DP細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)；其中a是LM3,b是LM3/ S0RA；
[0024] 圖3是LM3和LM3/CDDP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；
[0025] 圖4是LM3和LM3/CDDP細(xì)胞細(xì)胞周期；
[0026] 圖5是LM3和LM3/⑶DP細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)圖；
[0027] 圖6是LM3和LM3/CDDP細(xì)胞中P-gpmRNA含量圖；以及
[0028] 圖7是LM3和LM3/CDDP細(xì)胞索拉非尼（Sorafenib)刺激后的生長(zhǎng)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，
[0030] 以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0031] 實(shí)施例所用的人肝癌細(xì)胞LM3細(xì)胞，以下簡(jiǎn)稱LM3細(xì)胞，購(gòu)自中科院；實(shí)施例所用 的順鉬為市售的Selleck Chemicals公司的50mg規(guī)格的產(chǎn)品。
[0032] 各附圖中的LM3C0N表示以正常LM3細(xì)胞作為對(duì)照組，LM3⑶DP表示肝癌耐藥株 LM3/CDDP。
[0033]〈實(shí)施例一〉
[0034] 肝癌耐藥株LM3/⑶DP細(xì)胞的誘導(dǎo)建立方法
[0035] (1)取LM3細(xì)胞復(fù)蘇后用DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0036] (2)為找尋最適宜順鉬刺激濃度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LM3細(xì)胞種于24孔板中，分別加入 0. 1μg/L、0. 25μg/L、0. 5μg/L、lyg/L、2yg/L、5yg/L、10yg/L順鉬，適時(shí)傳代或換液。 每次傳代或換液時(shí)，均相應(yīng)加入各濃度化療藥。以化療藥加入后細(xì)胞可以可以存活并緩慢 生長(zhǎng)的最大濃度為最佳濃度。本實(shí)施例中所指的長(zhǎng)期生長(zhǎng)指的是3個(gè)月以上的生長(zhǎng)時(shí)間。
[0037] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)順鉬的濃度為0. 5 μ g/mL時(shí)LM3細(xì)胞可以存活但生長(zhǎng)非常緩慢； 濃度小于〇.5 μ g/mL時(shí)LM3細(xì)胞不但可以大量存活，還能較快生長(zhǎng)；濃度大于0. 5 μ g/mL時(shí) LM3細(xì)胞全部死亡。因此，我們確定篩選濃度為0. 5 μ g/mL。
[0038] (3)用最佳濃度0. 5μg/L長(zhǎng)期刺激細(xì)胞4個(gè)月，得到順鉬耐藥細(xì)胞株。用該細(xì)胞與 同期培養(yǎng)的LM3細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，種于24孔板，每孔種5X104個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后加入濃度 梯度的順鉬（〇. 5~15μg/L)，96小時(shí)后拍照。所得到的耐藥細(xì)胞如圖1所示。LM3/⑶DP 細(xì)胞與LM3細(xì)胞相比在3μg/mL濃度時(shí)仍能生長(zhǎng)代謝，培養(yǎng)基顏色變黃，說(shuō)明LM3/CDDP細(xì) 胞有較好的的耐藥性（各數(shù)字表示所用順鉬濃度，單位μg/mL)。LM3/CDDP細(xì)胞的最大耐 藥濃度可達(dá)3μg/mL。
[0039]〈實(shí)施例二〉
[0040] 肝癌耐藥株LM3/⑶DP細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
[0041] 使用倒置相差顯微鏡觀察活細(xì)胞形態(tài)：分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LM3細(xì)胞和LM3/⑶DP 細(xì)胞，生理鹽水清洗換液后，在倒置顯微鏡放大倍數(shù)200倍下觀察活細(xì)胞形態(tài)。如圖2 (a) 所示，通過(guò)光鏡可以觀察到LM3細(xì)胞大小基本一致，多偽足樣多角形，部分為圓形。而如圖 2(b)所示，通過(guò)光鏡可以觀察到LM3/CDDP細(xì)胞大小不一，有圓形與多角形，且多角形形態(tài) 各異。
[0042]〈實(shí)施例三〉
[0043] 肝癌耐藥株LM3/⑶DP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
[0044] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LM3、LM3/⑶DP細(xì)胞，用0. 5%胰酶消化并計(jì)數(shù)，按每孔5000個(gè)細(xì) 胞的密度接種入96孔板并設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔再各加200μL培養(yǎng)基，放置于37°C，5%C02培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于〇h，24h，48h，72h以及96h各時(shí)間點(diǎn)吸除培養(yǎng)基，每孔各加100μLCCK8 工作液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)后，放入酶標(biāo)儀以570nm波長(zhǎng)檢測(cè)，讀出每孔的0D值并計(jì)算 平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、0D值平均值為縱坐標(biāo)，繪制成生長(zhǎng)曲線。
[0045] 結(jié)果如圖3所示。LM3、LM3/⑶DP的生長(zhǎng)曲線圖，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過(guò)多天連 續(xù)測(cè)兩細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，兩細(xì)胞生長(zhǎng)曲線形態(tài)相似，結(jié)果如圖3所示，且順鉬耐藥細(xì)胞株 LM3/⑶DP較正常腫瘤細(xì)胞株LM3的增殖速度更快，并在培養(yǎng)至96小時(shí)時(shí)曲線仍然向上，而 此時(shí)正常腫瘤細(xì)胞株LM3/C0N的生長(zhǎng)曲線趨于平緩，顯示耐藥細(xì)胞LM3/CDDP具有很好的耐 藥性。
[0046]〈實(shí)施例四〉
[0047] 檢測(cè)細(xì)胞周期
[0048] 將LM3、LM3/CDDP細(xì)胞分別種于6孔板中，(λ1%FBSDMEM同步化12h，換為10% FBSDMEM培養(yǎng)基，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，用0. 5%的胰酶、ImMEDTA的消化緩 沖液消化細(xì)胞，用70%的乙醇固定細(xì)胞，置4°C保存待測(cè)。至流式細(xì)胞儀分析之前，置于離 心機(jī)中在l〇〇〇g，即、1000倍重力加速度的條件下，離心lOmin，去除固定液。使用碘化丙陡 (PI)染色。立即上流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞周期