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      體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞及其制備方法和應(yīng)用

      文檔序號:9519214閱讀:2444來源:國知局
      體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞及其制備方法和應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體是涉及體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞及其制備方法和應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002]眼免疫炎癥性疾病,泛指一類發(fā)病機制以眼部免疫炎癥反應(yīng)為主的疾病。由于眼部結(jié)構(gòu)與生理功能的獨特性,臨床上多種眼病的發(fā)病機制以免疫反應(yīng)為主,包括了眼化學(xué)傷、角膜移植排斥、葡萄膜炎等。
      [0003]隨著我國企業(yè)尤其是鑄造業(yè)和化學(xué)工業(yè)的迅速發(fā)展,熾熱物質(zhì)、酸或堿性化學(xué)物品等濺入眼部引起嚴重的眼化學(xué)傷事故日漸增多,目前我國300萬-350萬角膜盲病人中有30%以上是因酸性、堿性化學(xué)傷、熱燒傷及機械性外傷等眼表損傷引起。由于致傷物的直接損害及其引起的后續(xù)炎癥反應(yīng),嚴重者最終都表現(xiàn)為角膜溶解、大量新生血管和假性胬肉形成、角膜失去透明性,使其致盲率高達57.4%,僅有32.2%的患眼視力能達到0.1以上。尤其令人遺憾的是眼表損傷常常累及雙眼,且以青壯年及兒童患者居多,已成為個人、家庭、社會沉重的經(jīng)濟負擔(dān)與精神負擔(dān)。目前眼化學(xué)傷的治療原則是恢復(fù)眼表的完整性和眼表上皮細胞的正常表型,傳統(tǒng)的角膜復(fù)明手術(shù),如穿透性角膜移植對這類患者很難湊效。盡管目前有多種的改良的治療方式被應(yīng)用于眼化學(xué)傷,如羊膜移植、羊膜提取液、人工培養(yǎng)的角膜緣上皮移植術(shù)等,但仍無法控制眼化學(xué)傷所導(dǎo)致的角膜溶解穿孔、瞼球粘連、眼表干細胞衰竭、角膜新生血管等嚴重并發(fā)癥,使其致盲率仍高達57.4%。因此,尋找一種安全、有效的治療眼化學(xué)傷的方法刻不容緩。
      [0004]角膜盲是我國第二大致盲眼病,角膜移植是治療角膜盲的最有效手段。目前,角膜移植面臨的最大挑戰(zhàn)仍是術(shù)后植片免疫排斥,尤其對于嚴重化學(xué)傷、感染等高危病例,其10年內(nèi)術(shù)后排斥率高達60% _90%,其后果直接導(dǎo)致植片溶解,手術(shù)失敗。對于術(shù)后角膜移植免疫排斥,現(xiàn)今常用的藥物有糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素A(CsA)、他克莫司(FK506)等。糖皮質(zhì)激素局部長期使用可導(dǎo)致青光眼、白內(nèi)障、切口愈合不良,全身使用的副作用更多;CsA分子量大,水溶性差,不易穿透角膜,藥物載體毒性大;FK506的免疫抑制作用強,但長期應(yīng)用可導(dǎo)致腎功能損害、糖耐量降低和神經(jīng)系統(tǒng)功能受損,而且價格昂貴。因此,目前臨床上尚無特異性強、副作用低的抗角膜移植排斥的新型藥物。
      [0005]葡萄膜炎廣義上是指葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管及其玻璃體的炎癥,是一類常見的病因復(fù)雜、反復(fù)發(fā)作、難于治愈的眼病,所致盲多為不可治盲,故在致盲眼病中占有重要的地位。其發(fā)病率約為0.5%,在美國約占致盲眼病的10%,在非感染性致盲性眼病中占第3位。葡萄膜炎的發(fā)病機制尚未完全明了,一般認為與自身免疫反應(yīng)有關(guān),屬Thl細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。
      [0006]目前葡萄膜炎的治療尚缺乏有效的措施,臨床多采用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療,力求迅速抑制炎癥,減少組織破壞。但這種缺乏特異針對性的治療手段,常導(dǎo)致許多嚴重的并發(fā)癥,使組織器官遭受不可逆的損傷。因此尋找一種療效好、副作用又少的方法是治療葡萄膜炎的重要策略。調(diào)節(jié)性巨噬細胞(R-ΜΦ)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種巨噬細胞的亞型,屬于選擇性激活巨卩蜜細胞(alternatively activated macrophages, Aa ΜΦ or M2ΜΦ)中的一種。研究發(fā)現(xiàn)R-ΜΦ具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。R-ΜΦ能夠分泌大量營養(yǎng)因子、抗炎因子,抑制炎癥,促進傷口愈合。最近的研究發(fā)現(xiàn),R-ΜΦ能夠抑制Τ細胞激活和增殖,抑制Thl和Thl7分化和功能,誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞生成,從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),促進免疫耐受。因此,應(yīng)用體外誘導(dǎo)的R-ΜΦ是一種新的有前景的治療炎癥性和免疫性疾病的方法,這其中也包括了各種眼免疫炎癥性疾病的治療。目前已公開的文獻中,體外誘導(dǎo)的R-ΜΦ采用IL-10, TGF-beta,糖皮質(zhì)激素以及免疫復(fù)合物聯(lián)合IL-1受體拮抗劑或者TLR誘導(dǎo),但均存在不穩(wěn)定、容易向Ml型促炎巨噬細胞分化的缺點。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞的制備方法,由該方法得到的調(diào)節(jié)性巨噬細胞,具有很好的穩(wěn)定性,且對于眼免疫炎癥性疾病治療具有很好的應(yīng)用前景。
      [0008]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
      [0009]—種體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞的制備方法,包括以下步驟:
      [0010](1)取大鼠骨髓細胞,進行培養(yǎng),培養(yǎng)時在培養(yǎng)基中加入重組大鼠巨噬細胞集落刺激因子,得貼壁生長的巨噬細胞;
      [0011](2)在培養(yǎng)基中,加入全反式維甲酸以及腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β (TGF-β),繼續(xù)培養(yǎng)3天以上,誘導(dǎo)巨噬細胞極化為調(diào)節(jié)性巨噬細胞。
      [0012]在其中一個實施例中,步驟⑵加入的全反式維甲酸在培養(yǎng)基中的濃度為80-120nmol/L,加入的腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β在培養(yǎng)基中的濃度為8_12ng/ml。
      [0013]在其中一個實施例中,步驟⑵加入的全反式維甲酸在培養(yǎng)基中的濃度為lOOnmol/L,加入的腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β在培養(yǎng)基中的濃度為10ng/ml。
      [0014]在其中一個實施例中,步驟(2)的培養(yǎng)時間至少為三天以上,5天效果最佳,6天后效果沒有增加,優(yōu)選為3-6天。
      [0015]在其中一個實施例中,步驟(1)為:取大鼠骨髓細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)時加入重組大鼠巨噬細胞集落刺激因子,于37°C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9d,每隔2天半量換液,得貼壁生長的巨噬細胞。
      [0016]本發(fā)明的另一目的是提供上述制備方法得到的體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞。
      [0017]本發(fā)明的另一目的是提供一種上述體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞的應(yīng)用。
      [0018]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
      [0019]體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞在制備治療眼免疫性炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。
      [0020]在其中一個實施例中,所述眼免疫性炎癥疾病為眼化學(xué)傷。
      [0021]在其中一個實施例中,所述眼免疫性炎癥疾病為角膜移植排斥。
      [0022]在其中一個實施例中,所述眼免疫性炎癥疾病為葡萄膜炎。
      [0023]本發(fā)明采用全反式維甲酸以及TGF-beta體外誘導(dǎo)R-ΜΦ,可避免現(xiàn)有技術(shù)不穩(wěn)定、容易向Ml型促炎巨噬細胞分化的缺點,可很好地保持R-ΜΦ的穩(wěn)定,并有效地保持R-ΜΦ抗炎以及免疫調(diào)節(jié)功能的穩(wěn)定性。
      [0024]本發(fā)明得到的體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞,對眼免疫性疾病具有很好的治療作用,特別是針對眼化學(xué)傷、角膜移植排斥、葡萄膜炎等眼免疫性疾病具有很好的療效。
      [0025]本發(fā)明體外誘導(dǎo)ATR-ΜΦ可用于抗角膜移植排斥的新型藥物,是臨床上治療抗角膜移植排斥的很好的選擇。
      [0026]本發(fā)明體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞(ATR-ΜΦ)可上調(diào)多種抗炎因子,對葡萄膜炎起到了有效的免疫抗炎作用且副作用少,將會是未來臨床上非常有發(fā)展前景的一種治療手段。
      【附圖說明】
      [0027]圖1:ΜΦ和ATR-ΜΦ的鑒定。其中,Α:ΜΦ免疫熒光法(400X)和流式細胞儀檢測ΜΦ標記⑶lib的表達;B:ATR-M<i)抑制T細胞的通過細胞數(shù)量依賴的方式;(^PD:ELISA檢測LPS激活后ΜΦ和ATR-ΜΦ分泌的促炎癥因子TNF- a、IL-6和抗炎因子TGF- β、IL-10 ;Ε:流式細胞儀檢測R-ΜΦ的標記物⑶163和⑶206的表達。
      [0028]圖2.ATR-ΜΦ的穩(wěn)定性優(yōu)于R-ΜΦ。A:促炎因子IFN- γ處理后,ATR-ΜΦ抑制Τ細胞增殖的作用明顯優(yōu)于R-ΜΦ處理后,ATR-ΜΦ產(chǎn)生的促炎因子TNF-α、IL-6明顯少于R-ΜΦ,而ATR-ΜΦ產(chǎn)生的抗炎因子TGF-β、IL_10明顯多于R-ΜΦ ;D:IFN-y處理后,ATR-ΜΦ表達⑶163和⑶206的比例明顯多于R-ΜΦ。
      [0029]圖3:ATR-M(i)促進大鼠角膜化學(xué)傷傷口愈合。㈧:已建立適度的角膜化學(xué)傷大鼠模型,a:角膜上皮缺損,熒光染色圖片;b:角膜傷口愈合,上皮完整;c:角膜潰瘍形成;d:角膜穿孔;(B):局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯縮短角膜化學(xué)傷傷口愈合時間;(C)局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯減少角膜潰瘍和穿孔的發(fā)生率。
      [0030]圖4:ATR-M(i)延長大鼠角膜移植后植片的生存時間。㈧:已建立大鼠移植模型,a:角膜移植術(shù)后;b:角膜移植術(shù)后第3天,角膜植片透明;c:角膜移植術(shù)后第6天,角膜植片開始水腫;d:角膜移植術(shù)后第9天,角膜植片排斥;(B):局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯延長角膜角膜移植排斥的發(fā)生時間,減少角膜移植排斥的發(fā)生率;(C)局部結(jié)膜下注射ATR-ΜΦ明顯延長角膜植片的生存時間。
      [0031]圖5:ATR-ΜΦ減輕大鼠葡萄膜炎炎癥。(A):已建立大鼠葡萄膜炎模型,a:正常大鼠眼前段山:自身免疫性大鼠葡萄膜炎眼前段(白色尖頭:瞳孔纖維素滲出導(dǎo)致瞳孔膜閉);(B):靜脈注射ATR-ΜΦ明顯減輕大鼠葡萄膜炎的癥狀。
      【具體實施方式】
      [0032]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容,特舉以下實施例結(jié)合附圖詳細說明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑,均為市售產(chǎn)品。
      [0033]實施例1
      [0034]本實施例體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細胞的制備方法,包括以下步驟:
      [0035](1)大鼠骨髓來源巨噬細胞的分離與純化
      [0036]取大鼠骨髓細胞用含10%胎牛血清(Gibco,Grand Island, NY, USA) U00U/ml盤尼西林、100yg/ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、20 μΜβ -巰基乙醇(以上試劑均購自Sigma, St.Louis, MO, USA)的RPMI 1640 (Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入重組大鼠巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF ;PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA,終濃度50ng/ml)于培養(yǎng)基中,調(diào)整細胞數(shù)為2X 10~6/mL。于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,隔2d半量換液,得貼壁細胞。
      [0037](2)全反式維甲酸(all trans-retinoic acid, atRA)聯(lián)合腫瘤轉(zhuǎn)化因子-β (TGF- β )
      [0038]誘導(dǎo)巨.細胞極化為調(diào)節(jié)性巨卩蜜細胞(Regulatory macrophages)(簡稱ATR-ΜΦ):
      [0039]加入(100nmol/L)全反式維甲酸(Sigma,St.Louis, M0)以及 lOng/ml TGF-β (R&DSystems, Minneapolis, MN, USA)于培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細胞5天,得到ATR-ΜΦ。
      [0040](
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