小分子量透明質酸的制備方法與應用及透明質酸裂解酶基因載體和工程菌的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及透明質酸生產(chǎn)領域，更具體地說涉及一種小分子量透明質酸的制備方 法與應用及透明質酸裂解酶基因載體和工程菌。
【背景技術】
[0002] 透明質酸（HA)又名玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺雙糖單位以 β_1，3糖苷鍵和β-1，4糖苷鍵交替連接而成的線性高分子酸性粘多糖。HA廣泛分布于機 體的組織間質中并隨分布部位的的不同而展現(xiàn)出不同的生理作用，如在皮膚中有較好的保 水作用，在關節(jié)滑液中有潤滑和防磨損的作用，并對組織和血管的再生有重要作用，因而透 明質酸被廣泛應用于化妝品、食品保健、美容整形和醫(yī)藥等領域。
[0003] 近來文獻報道，小分子量的透明質酸展現(xiàn)出特有的生物活性。West等發(fā)現(xiàn)4~25 個雙糖單位的透明質酸寡糖具有促進血管生成的活性，Mr低于lOOOODa的透明質酸對于血 管的再生有顯著意義。Kim等將低分子量的透明質酸接枝到其他聚合物主鏈上制成聚合物 藥物載體，做成溫控釋放型的藥物載體。Brown分別給胸腺癌裸鼠尾靜脈注射含透明質酸 (Mr為0. 825X106)和不含透明質酸的5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤，發(fā)現(xiàn)含透明質酸的5-氟尿 嘧啶和甲氨蝶呤明顯增加藥物的療效，主要表現(xiàn)在動物體質量增加，腫瘤體積明顯減少，淋 巴結轉移率降低等。
[0004]目前，小分子量的透明質酸的制備方法主要有物理方法如超聲波降解，化學方法 如過氧化氫和次氯酸鈉降解法，和酶法降解如動物睪丸來源的透明質酸酶來酶解透明質 酸，三種方法相比，物理方法需要劇烈的條件，而且很難制備分子量在10KD以下的透明質 酸寡糖?；瘜W方法對透明質酸結構的破壞程度較大，而且生產(chǎn)過程容易對環(huán)境造成污染，而 酶法制備小分子量透明質酸條件較溫和，反應容易控制，但動物組織來源的的透明質酸裂 解酶數(shù)量有限，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，利用生物工程技術克隆和表達微生物來源的透明 質酸裂解酶基因對于小分子量透明質酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。
[0005] 關于對微生物來源的透明質酸酶的研究，其中最深入的是 Streptococcuspneumoniaea矛口Streptococcusagalactiae(groupB)〇JedrzejasMJ^ 對這兩種酶的催化機制做了詳細的闡述，兩種酶均通過β-消除機制降解大分子量的透 明質酸得到4,5-不飽和雙糖。中國專利化附032550764)提供了一種從芽孢桿菌發(fā)酵液 中分離純化透明質酸裂解酶，并用純化后的酶來制備低分子量的透明質酸鹽。中國專利 (CN101633931)利用pBV220表達載體表達透明質酸裂解酶基因并在42°C條件下誘導，不過 得到的產(chǎn)物為包涵體，需要進行蛋白的復性，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術中的不足，現(xiàn)有的酶法制備小分子量透明質酸條件較溫 和，反應容易控制，但動物組織來源的的透明質酸裂解酶數(shù)量有限，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，提 供了一種小分子量透明質酸的制備方法與應用及透明質酸裂解酶基因載體和工程菌，通過 克隆獸疫鏈球菌（Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920透明質酸裂解酶基因hylb 片段，并構建包含其基因的表達載體，轉到宿主菌后并通過宿主菌發(fā)酵獲得酶活力較高的 透明質酸裂解酶，并用該裂解酶催化大分子量透明質酸的降解，通過控制反應條件，成功且 大量的制備小分子量的透明質酸。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)。
[0008] 透明質酸裂解酶基因載體，所述基因載體將長度為2208bp的hylb基因插入載體 pET28a中，形成載體pET28a: :hylb。
[0009] 所述hylb基因來源于獸疫鏈球菌（Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920 基 因組。
[0010] 所述hylb基因始于第128個氨基酸GCC，結束于終止密碼子TAG，所述hylb基因 序列如序列1所示。
[0011] 將所述載體pET28a::hylb轉入宿主菌，即獲得透明質酸裂解酶工程菌。
[0012] 所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0013] 所述誘導條件為在20-37°C的條件下，向培養(yǎng)基中加入0-lmMIPTG誘導過夜；優(yōu) 選在20°C的條件下，向培養(yǎng)基中加入0.ImMIPTG誘導過夜。
[0014] 透明質酸裂解酶的制備方法為使用所述透明質酸裂解酶工程菌發(fā)酵獲得，按照下 述步驟進行：
[0015] 步驟1，將所述透明質酸裂解酶工程菌接種到LB培養(yǎng)基上，在37°C的條件下培養(yǎng)， 得到菌液；
[0016] 步驟2,將上述菌液轉入離心杯中，4°C離心，收集菌體；
[0017] 步驟3,將菌體置于預冷的PBS緩沖液中重懸，得到重懸后的菌體；
[0018] 步驟4,用超聲破碎儀破碎重懸后的菌體，得到破碎后的菌液；
[0019] 步驟5,將上述破碎后的菌液，在4°C的條件下離心后，收集上清液，即得透明質酸 裂解酶粗酶液。
[0020] 在所述步驟3中，所述PBS緩沖液的體積比為5:1~10:1。
[0021] 小分子量透明質酸的制備方法，按照下述步驟進行：
[0022] 步驟1，底物配制：將野生型獸疫鏈球菌發(fā)酵后所得的發(fā)酵液經(jīng)過處理提取得到 大分子量的透明質酸，將干燥后的大分子量透明質酸用超純水溶解，并控制濃度在2~ 3mg/ml，使其完全溶解，得到底物；
[0023] 步驟2,酶解：將上述底物在37°C保溫，并加入適量的透明質酸裂解酶，并反應一 段時間后，即得降解后的透明質酸溶液；
[0024] 步驟3,滅活：將上述降解后的透明質酸溶液用沸水煮沸1~2min，得到經(jīng)過滅活 的透明質酸溶液；
[0025] 步驟4,過濾：將上述經(jīng)過滅活的透明質酸溶液用0.45um濾膜過濾，除去雜質，得 到經(jīng)純化的透明質酸溶液；
[0026] 步驟5,沉淀：向上述經(jīng)純化的透明質酸溶液中加入3倍體積的無水乙醇沉淀，即 得到小分子量透明質酸沉淀；
[0027] 步驟6,冷凍干燥：將上述沉淀在-80°C條件下冷凍干燥，得到小分子量透明質酸 成品。
[0028] 在所述步驟2中，所述透明質酸裂解酶的加入量為每1L底物加入46U~ 79U(4. 6X105IU~7· 9X105IU)酶活力單位的透明質酸裂解酶。
[0029] 在所述步驟2中，所述酶解反應時間為0~6h。
[0030] 小分子量透明質酸在食品、化妝品或者醫(yī)藥領域的應用。
[0031] 本發(fā)明的有益效果為：
[0032] 1、本發(fā)明利用基因工程技術克隆了微生物來源的透明質酸裂解酶基因，并使其成 功表達，獲得了酶活力較高的可溶性酶-透明質酸裂解酶；
[0033] 2、本發(fā)明提出的酶法制備小分子量透明質酸做到了反應條件溫和，節(jié)約能源，分 子量可控等特點，易于形成工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0034] 圖1是本發(fā)明中透明質酸裂解酶基因載體的構建圖譜；
[0035] 圖2是本發(fā)明中hylb基因表達載體的PCR驗證圖，其中，Μ為DNAMarker，l為陰 性對照，2為陽性對照，以基因組為模板，3和4為PCR擴增hylb基因，大小為2208bp;
[0036] 圖3是本發(fā)明中酶切驗證圖，其中，Μ為DNAMarker;1和2為EcoRI和Xhol雙酶 切驗證質粒；
[0037] 圖4是本發(fā)明制備得到的透明質酸裂解酶SDS-PAGE蛋白電泳圖，其中，Μ為蛋 白Marker的SDS-PAGE蛋白電泳圖；1為流穿液的SDS-PAGE蛋白電泳圖；2和3為采用咪 唑含量為20mM流穿液的SDS-PAGE蛋白電泳圖；4和5為采用咪唑含量為60mM流穿液的 SDS-PAGE蛋白電泳圖；6和7為采用咪唑含量為80mM流穿液的SDS-PAGE蛋白電泳圖；8和9 為采用咪唑含量為100mM流穿液的SDS-PAGE蛋白電泳圖；10和11為采用咪唑含