用于制備交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)物的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于制備交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)物的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及多糖的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及將透明質(zhì)酸(HA)交聯(lián)和制造交聯(lián) 的HA產(chǎn)物的新的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 用于醫(yī)學(xué)用途的最廣泛使用的生物相容聚合物中的一種是透明質(zhì)酸(HA)。它是天 然存在的多糖，屬于糖胺多糖(GAG)的組。HA和其他GAG是帶有陰性電荷的雜多糖鏈，其具有 吸收大量水的能力。HA和衍生自HA的產(chǎn)物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和整容領(lǐng)域中被廣泛地使用，例 如在粘性手術(shù)期間和作為皮膚填充劑。
[0004] 吸水凝膠或水凝膠廣泛地被用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。它們通常通過(guò)使聚合物化學(xué)交聯(lián) 成無(wú)限網(wǎng)絡(luò)來(lái)制備。盡管天然的HA和某些交聯(lián)的HA產(chǎn)物吸收水直到它們完全被溶解，然而 交聯(lián)的HA凝膠通常吸收某些量的水直到它們被飽和，即它們具有有限的液體保持能力或溶 脹度。
[0005] 因?yàn)樵诖蟛糠只畹挠袡C(jī)體中，HA除了其分子量之外以相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在，所以 它給出最少的反應(yīng)并且允許高級(jí)的醫(yī)學(xué)用途。HA分子的交聯(lián)和/或其他改性是改進(jìn)其體內(nèi) 耐降解性或耐久性所必需的。此外，這樣的改性影響HA分子的液體保持能力。作為其結(jié)果， HA已經(jīng)是許多改性嘗試的主題。
[0006] 當(dāng)從生物相容的聚合物制備凝膠時(shí)，有利地是確保低的交聯(lián)度以便保持高的生物 相容性。然而，常需要更致密的凝膠以具有合適的生物醫(yī)學(xué)效果，并且在這樣的情況下生物 相容性將常被損失。
[0007] 涉及植入物的一些已知的軟組織填充治療偶爾遭受植入物或其部分從合意的治 療部位移開(kāi)的缺點(diǎn)。
[0008] WO 87/07898公開(kāi)用于制備HA膜的方法。應(yīng)避免任何凝膠形成直到交聯(lián)步驟，其包 括將環(huán)氧活化的HA的水溶液干燥成膜。在該方法中固有的是在交聯(lián)步驟中的所有其他組分 必須是揮發(fā)性的。
[0009] WO 2004/092223公開(kāi)在大體上不除去環(huán)氧化物下，通過(guò)干燥HA和環(huán)氧化物交聯(lián)劑 的混合物產(chǎn)生交聯(lián)的HA凝膠的方法。
[0010] 同樣地，WO 2011/109129和WO 2011/109130公開(kāi)在交聯(lián)劑的存在下在非變性條件 下通過(guò)干燥HA產(chǎn)生HA線狀物的工藝。
[0011] US 5,827,937公開(kāi)用于制備具有高的交聯(lián)度的多糖的工藝。
[0012] WO 00/046253公開(kāi)包括兩種類(lèi)型的交聯(lián)步驟的方法，每一種均在交聯(lián)劑的存在 下，用于提高HA的交聯(lián)度。
[0013] US 2007/0066816公開(kāi)用于制備雙交聯(lián)的HA的工藝，其包括在兩個(gè)步驟中分別用 環(huán)氧化物和碳化二亞胺交聯(lián)HA底物。
[0014] US 6，852，255公開(kāi)包括交聯(lián)HA的水溶液隨后使交聯(lián)的HA成型的方法，使交聯(lián)的HA 成型例如通過(guò)有機(jī)溶劑的添加以沉淀交聯(lián)的HA。
[0015] US 4,716,224涉及用于產(chǎn)生對(duì)酶分解具有提高的抵抗性的交聯(lián)的HA的方法。它提 及HA可以在交聯(lián)劑的添加之前被沉淀。
[0016] KR 2007/0004159公開(kāi)通過(guò)使HA在固相中經(jīng)受在有機(jī)溶劑中的交聯(lián)劑來(lái)制備交聯(lián) 的HA的方法。
[0017] EP 2199308涉及通過(guò)在交聯(lián)劑的添加之前將HA粉末分散在含水乙醇中產(chǎn)生交聯(lián) 的HA的方法。
[0018] US 6,921，819公開(kāi)用于交聯(lián)HA的方法，其中將多官能交聯(lián)劑在其水合期間與固態(tài) 的HA反應(yīng)。
[0019] 盡管本領(lǐng)域中的這些進(jìn)展，然而仍舊需要制造具有合適的液體保持能力和降解分 布，但又具有保留的生物相容性的交聯(lián)的HA產(chǎn)物的可選的方法。特別地，合意的是，使獲得 具有合意的凝膠強(qiáng)度(例如其可以作為液體保持能力被測(cè)量）的HA凝膠產(chǎn)物所需要的改性 度最小化。
[0020] 發(fā)明概述
[0021] 本發(fā)明的目的是提供用于制造交聯(lián)的透明質(zhì)酸(HA)產(chǎn)物的新的方法，其滿(mǎn)足以下 要求的一個(gè)或更多個(gè)：
[0022]-交聯(lián)劑的低的并入
[0023]-有限的副反應(yīng)，例如與周?chē)橘|(zhì)和鹵化物離子的有限的副反應(yīng)
[0024]-受控的反應(yīng)條件
[0025]-良好的工藝重復(fù)性
[0026]-適于按比例放大至工業(yè)工藝
[0027]-有限的總工藝時(shí)間
[0028] -足夠的凝膠強(qiáng)度以抵抗植入時(shí)的變形和移動(dòng)
[0029] -允許在方法步驟中使用多種類(lèi)型的劑(例如，緩沖劑、堿、酸、鹽）。
[0030] 為實(shí)現(xiàn)由本說(shuō)明書(shū)明顯的這些目標(biāo)和/或其他目標(biāo)，已經(jīng)意識(shí)到，本發(fā)明的潛在目 的是提供用于制造交聯(lián)的HA產(chǎn)物的方法，該交聯(lián)的HA產(chǎn)物具有低的至中等的改性度 (degree of modification)，而同時(shí)具有如通過(guò)低的至中等的液體保持能力（liquid retention capacity)或溶脹度（swelling degree)示出的高的凝膠強(qiáng)度。
[0031] 本發(fā)明提供通過(guò)控制對(duì)于具體的交聯(lián)劑與HA的改性效率，即控制在產(chǎn)生合意的強(qiáng) 度的凝膠中交聯(lián)程序的效率，多方面控制HA交聯(lián)方法。本發(fā)明因此允許用令人驚訝地低的 HA化學(xué)改性制造具有合意的強(qiáng)度(有限的溶脹度）的凝膠。這是有利的，以便使生物相容性 問(wèn)題最小化，但通常還改進(jìn)了 HA交聯(lián)工藝的控制。
[0032] 本發(fā)明的目的還是提供用于制造交聯(lián)的HA產(chǎn)物的方法，其中高比例的結(jié)合的交聯(lián) 劑在(至少)兩端被連接，即以實(shí)現(xiàn)高的交聯(lián)效率。
[0033] 本發(fā)明的另外的目的是提供具有低的至中等的改性度并且同時(shí)低的至中等的液 體保持能力(或溶脹度)的交聯(lián)的HA產(chǎn)物。
[0034]本發(fā)明的目的是提供對(duì)變形具有高的抵抗性的交聯(lián)的HA產(chǎn)物。
[0035]對(duì)于將由本公開(kāi)內(nèi)容明顯的這些目的和其他目的，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供用 于制造交聯(lián)的透明質(zhì)酸(HA)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：（a)通過(guò)使HA與一種或更多種多官 能的交聯(lián)劑在水溶液中反應(yīng)來(lái)開(kāi)始HA的交聯(lián)以獲得活化的HA; (b)將未反應(yīng)的交聯(lián)劑從活 化的HA中除去；以及(c)通過(guò)在不添加任何另外的交聯(lián)劑下，使活化的HA經(jīng)受另外的交聯(lián)條 件，完成活化的HA的交聯(lián)以獲得交聯(lián)的HA產(chǎn)物;其中完成交聯(lián)步驟(c)在液體沉淀介質(zhì)和沉 淀形式的活化的HA的懸浮液中進(jìn)行。
[0036] 此方法提供最終交聯(lián)步驟的良好的控制，因?yàn)樗鼉H發(fā)生在固體(沉淀)相中。獲得 的產(chǎn)物獨(dú)特在于，盡管具有低的HA的改性度，它是具有低的溶脹度的凝膠。令人高度驚訝 地，具有有限的溶脹度的凝膠產(chǎn)物完全可以獲得為具有這樣低的改性度。
[0037] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一種實(shí)施方案中，除去步驟(b)包括：（bl)使活化的HA在液 體沉淀介質(zhì)中沉淀以獲得包含液體沉淀介質(zhì)和沉淀形式的活化的HA的懸浮液；以及(b2)將 未反應(yīng)的交聯(lián)劑從沉淀的、活化的HA的懸浮液中除去。任選地，除去子步驟(b2)包括用液體 沉淀介質(zhì)洗滌沉淀的、活化的HA。從沉淀形式的活化的HA中除去交聯(lián)劑是有利的，因?yàn)樗?速產(chǎn)生非常清潔的中間體產(chǎn)物，即不具有仍舊未反應(yīng)的交聯(lián)劑。此交聯(lián)劑移除步驟在大規(guī) 模工藝中也是非常有用的。
[0038] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一種實(shí)施方案中，完成交聯(lián)步驟(c)包括：（cl)使活化的 HA在液體沉淀介質(zhì)中沉淀以獲得包含液體沉淀介質(zhì)和沉淀形式的活化的HA的懸浮液；以及 (c2)通過(guò)在不添加任何另外的交聯(lián)劑下，使沉淀的、活化的HA的懸浮液經(jīng)受另外的交聯(lián)條 件，完成活化的HA的交聯(lián)以獲得交聯(lián)的HA產(chǎn)物。
[0039]在根據(jù)本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，液體沉淀介質(zhì)包含大于65wt%的水溶性 有機(jī)溶劑，并且優(yōu)選地70_80wt%的水溶性有機(jī)溶劑和20-30wt%的水。
[0040] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，水溶性有機(jī)溶劑包含一種或更多種低級(jí) 烷基醇或者是由一種或更多種低級(jí)烷基醇組成，并且優(yōu)選地乙醇。
[0041] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的特定的實(shí)施方案中，開(kāi)始交聯(lián)步驟(a)提供凝膠形式的活 化的HA。此凝膠形式有助于下游步驟，例如處理、成型、洗滌和沉淀。
[0042]在根據(jù)本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，交聯(lián)劑選自由二乙烯砜、多環(huán)氧化合物 和雙環(huán)氧化合物組成的組。交聯(lián)劑的優(yōu)選的組由1，4_丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)、1，2_乙 二醇二縮水甘油醚（EDDE)和二環(huán)氧辛烷組成，并且特別是1，4_丁二醇二縮水甘油醚 (BDDE) 0
[0043] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的特定的實(shí)施方案中，該方法還包括以下步驟：（d)使來(lái)自步 驟(c)的沉淀的、交聯(lián)的HA產(chǎn)物經(jīng)受非沉淀?xiàng)l件；以及(e)將非沉淀形式的交聯(lián)的HA產(chǎn)物分 離。
[0044] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，該方法還包括將交聯(lián)的HA產(chǎn)物滅菌的步 驟。
[0045]根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供具有0.35或35 %或更高、并且優(yōu)選地在35-80 %例如 40-80%或50-80%的范圍內(nèi)的有效交聯(lián)劑比（effective cross-linker ratio)的交聯(lián)的 HA產(chǎn)物。有效交聯(lián)劑比（CrR)描述已經(jīng)結(jié)合兩個(gè)(或更多個(gè))二糖(僅HA-X-HA)的總結(jié)合的交 聯(lián)劑(HA-X-HA和HA-X)的比例，其中X是交聯(lián)劑。有效交聯(lián)劑比可以例如通過(guò)在HA凝膠的酶 催化降解之后的LC-MS來(lái)確定。作為一個(gè)例子，有效交聯(lián)劑比的確定可以，例如使用來(lái)自金 黃節(jié)桿菌（Arthrobacter aurescens)的軟骨素酶AC或來(lái)自普通變形桿菌（Proteus vulgaris)的軟骨素酶ABC，將HA凝膠酶催化降解成由主要二糖（Adi-HA)組成的片段和包 含1-8個(gè)二糖的具有結(jié)合的交聯(lián)劑(HA-X)的片段之后使用LC-MS通過(guò)HA-X片段的確定來(lái)做 出。然后，片段可以采用尺寸排阻色譜法(SEC)被分離，以及采用質(zhì)譜法(MS)被檢測(cè)。采用在 (Kenne等人，Carbohydrate Polymers91 (2013)410-418)中概述的原則并且在LC-MS取得方 法中針對(duì)所使用的特定的交聯(lián)劑校正/修正HA-X片段和HA-X-HA片段的質(zhì)量，該方法可以容 易地適于任何多官能的交聯(lián)劑。
[0046]在根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的HA產(chǎn)物的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)物具有每克HA 4-500mL的溶 脹度，并且優(yōu)選地每克HA 15-300mL的溶脹度。
[0047]根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供包含根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的HA產(chǎn)物、以及任選地緩沖劑 和/或張度劑(tonicity agent)的含水組合物。
[0048]根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供預(yù)填充的注射器，該預(yù)填充的注射器用根據(jù)本發(fā)明的 交聯(lián)的HA產(chǎn)物或其含水組合物來(lái)預(yù)填充。
[0049]根據(jù)第五方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的HA產(chǎn)物或其含水組合物在整容手 術(shù)例如皮膚填充、體形塑造和面部塑造中，在醫(yī)學(xué)手術(shù)例如皮膚填充、體形塑造、組織粘連 的預(yù)防、通道的形成、失禁治療、和矯形外科應(yīng)用中，以及用于使皮膚保濕(hydrating)和/ 或使皮膚有生機(jī)的用途。
[0050]根據(jù)第六方面，本發(fā)明提供經(jīng)歷整容手術(shù)或醫(yī)學(xué)手術(shù)的受試者的治療的方法，包 括將根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的HA產(chǎn)物或其含水組合物施用于需要其的受試者。
[0051 ] 附圖簡(jiǎn)述
[0052]圖1示出用于交聯(lián)HA的示意圖方法。
[0053]圖2示出用于交聯(lián)HA的方法的示意圖的延續(xù)。
[0054]圖3示出在最終交聯(lián)步驟中，不同的反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的HA顆粒的有效交聯(lián)劑 比（CrR)。
[0055]圖4示出交聯(lián)的HA凝膠的熱誘導(dǎo)的降解。
[0056]圖5示出交聯(lián)的HA凝膠的過(guò)氧自由基誘導(dǎo)的降解。
[0057] 實(shí)施方案的編號(hào)清單
[0058] 1. 一種用于制造交聯(lián)的透明質(zhì)酸(HA)產(chǎn)物的方法，所述方法包括
[0059] (a)通過(guò)使HA與一種或更多種多官能交聯(lián)劑在水溶液中反應(yīng)來(lái)開(kāi)始HA的交聯(lián)以獲 得活化的HA;
[0060] (b)將未反應(yīng)的交聯(lián)劑從所述活化的HA中除去；以及
[0061] (c)通過(guò)在不添加任何另外的交聯(lián)劑下，使所述活化的HA經(jīng)受另外的交聯(lián)條件完 成所述活化的HA的交聯(lián)以獲得交聯(lián)的HA產(chǎn)物;其中所述完成交聯(lián)步驟(c)在液體沉淀介質(zhì) 和沉淀形式的所述活化的HA的懸浮液中進(jìn)行。
[0062] 2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中除去步驟(b)包括：
[0063] (bl)使所述活化的HA在液體沉淀介質(zhì)中沉淀以獲得包含所述液體沉淀介質(zhì)和沉 淀形式的所述活化的HA的懸浮液；以及
[0064] (b2)將未反應(yīng)的交聯(lián)劑從沉淀的、活化的HA的所述懸浮液中除去。
[0065] 3.根據(jù)實(shí)施方案2所述的方法，其中除去子步驟(b2)包括用液體沉淀介質(zhì)洗滌所 述沉淀的、活化的HA。
[0066] 4.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述完成交聯(lián)步驟(c)包括：
[0067] (cl)使所述活化的HA在液體沉淀介質(zhì)中沉淀以獲得包含所述液體沉淀介質(zhì)和沉 淀形式的所述活化的HA的懸浮液；以及
[0068] (c2)通過(guò)在不添加任何另外的交