一種含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 菌種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中較為特殊的一類，通過使用菌種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能 夠有效保證微生物定量檢測高效、準(zhǔn)確地運(yùn)行，但目前國內(nèi)僅在出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)內(nèi)少 數(shù)幾個(gè)局在研制，大部分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是靠國外引進(jìn)。2006年，遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局所研 制的食品中微生物菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被批準(zhǔn)為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包含兩種研 制方法：一種是以模擬食品實(shí)物，添加腸桿菌、沙雷氏菌、芽孢桿菌等具有標(biāo)準(zhǔn)號、可溯源性 的菌株經(jīng)冷凍干燥制成的：另一種是以魚粉為基質(zhì)與上述細(xì)菌混合經(jīng)冷凍干燥制成的，而 我國在食品基質(zhì)的食源性致病微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)領(lǐng)域仍是空白，因此研制添加基質(zhì)的微生物 定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有重要意義。
[0003] 志賀氏菌（是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，其廣泛存在于各種食 品中。人類對志賀氏菌的易感性較高，所以在食物和飲用水的衛(wèi)生檢驗(yàn)時(shí)，常以志賀氏菌作 為指標(biāo)菌。本發(fā)明以志賀氏菌為目標(biāo)菌，通過添加無菌雞肉粉，配合凍干保護(hù)劑，經(jīng)冷凍干 燥、不確定度評估以及對特性值進(jìn)行均勻性檢測和穩(wěn)定性追蹤，得到含一定菌數(shù)的志賀氏 菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并形成了一套食品基質(zhì)的食源性致病微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其具有良好的均勻 性，且品質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控，適用于微生物高效、準(zhǔn)確的定量檢測。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種含雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其制備方法包括以下步驟： 1) 保存液的配制：將志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉用志賀氏菌增菌肉湯溶解后，劃線接種 于志賀氏菌顯色培養(yǎng)基上，36± 1°C下培養(yǎng)20h-48h;然后挑取單菌落接種于志賀氏菌增菌 肉湯中，41. 5±1 °C下培養(yǎng)16h-20h;吸取菌液于無菌離心管中，加入其體積1. 5倍、質(zhì)量 濃度為40%的無菌甘油，混合，制成保存液；保存液于-20°C存儲(chǔ)備用，使用前恢復(fù)至室溫 (22°C)后禍旋 10s; 2) 基質(zhì)預(yù)處理：將雞肉剔除脂肪組織后，冷凍干燥至脫水率為75%，然后將脫水雞肉粉 碎至組織細(xì)度為170目，采用6°C〇y輻射滅菌后分裝備用； 3) 混懸液的配制：按lg雞肉基質(zhì)加入7mL無菌水的比例，將預(yù)處理后的雞肉基質(zhì)與水 混合成基質(zhì)懸液，再加入其3倍體積的保護(hù)劑，混合制得混懸液； 4) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備：取步驟1)制備的保存液2yL于200mL志賀氏菌增菌肉湯中， 41. 5± 1 °C下進(jìn)行培養(yǎng)，并利用多功能酶標(biāo)儀定時(shí)取樣測定培養(yǎng)液的0D_ηηι值，當(dāng)0D_ηηι 為0. 270 ±0. 1時(shí)停止培養(yǎng)，得新鮮菌液，然后將新鮮菌液按混懸液體積濃度1%加入到步驟 3)制得的混懸液中，于臺式恒溫振蕩器上300r/min搖勾30min，再按2mL/瓶進(jìn)行分裝，其 含菌量為8. 4X102~2. 5X103CFU/mL，最后經(jīng)冷凍干燥，制得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)； 5)檢驗(yàn)：將所得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行菌種鑒定、均勻性驗(yàn)證、定值、穩(wěn)定性檢驗(yàn)，制得成品。
[0006] 步驟1)所得保存液的平均菌數(shù)為4. 3X107CFU/mL。
[0007] 步驟2)所用雞肉需先經(jīng)檢測不含抗生素；所用6°Coγ的輻射劑量為6KGY。
[0008] 步驟3)所述保護(hù)劑是將脫脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸與水按體積比 4:0. 1:1:0. 2:1 混合而成。
[0009] 步驟4)經(jīng)冷凍干燥后所得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中含菌量為530±24CFU/瓶。
[0010]目前含雞肉基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都存在一個(gè)重要的問題，即雞肉基質(zhì)難溶于水，這使 得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以達(dá)到滿意的均勻性。本發(fā)明通過在預(yù)處理過程中將雞肉基質(zhì)冷凍干燥、粉 碎，使所得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能達(dá)到良好的均勻性。同時(shí)，本發(fā)明所得雞肉基質(zhì)的志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 品質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控，適用于微生物高效、準(zhǔn)確的定量檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0012] 材料與方法 1. 1材料與試劑 菌源：宋氏志賀氏菌如/?/?￡^，4了0：25931，購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。
[0013] 基質(zhì)：雞胸脯肉，購自福建圣農(nóng)集團(tuán)，低溫運(yùn)輸，-20°C存儲(chǔ)備用。
[0014] 志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、 菌落計(jì)數(shù)瓊脂，北京陸橋有限公司。蔗糖(分析純)，上海試一化學(xué)劑有限公司；聚乙烯吡 咯烷酮(優(yōu)級純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸(優(yōu)級純)，上海百賽生物技術(shù)有限公 司；德運(yùn)脫脂牛奶，富祺仕貿(mào)易（上海）有限公司。
[0015] 1.2儀器與設(shè)備 KD-TBC-300M電子天平，福建科迪技術(shù)有限公司；M0DULY0-4K冷凍干燥機(jī)(配有真空 栗)，美國edword公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；M37610-33 振蕩器，金華雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司；Stomacher3500拍擊式均質(zhì)器，英國SEWARD; SpectraMaxM5多功能酶標(biāo)儀，MolecularDevices公司；SHKE4450臺式恒溫振蕩器，美國 Thermo公司；VXE380超低溫冰箱，J0UAN/德國公司；Vitek2C0MPACT30微生物鑒定儀(配套 GP鑒定卡）生物梅里埃公司；B0X389微生物鑒定儀配套麥?zhǔn)媳葷醿x，HACHCOMPANY公司； 5mL西林瓶(配套丁基膠塞)，安徽華欣藥用玻璃制品有限公司。
[0016] 1.3 方法 1. 3. 1制備保存液 標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉用志賀氏菌增菌肉湯溶解后劃線接種于志賀氏菌顯色培養(yǎng)基， 36± 1°C下培養(yǎng)20h-48h，挑取單菌落接種100mL志賀氏菌增菌肉湯中，41. 5± 1°C下培養(yǎng) 16h_20h;吸取400yL新鮮菌液（0D6M=0. 264)于無菌1. 5mL聚乙稀離心管，再吸取600yL、 質(zhì)量濃度為40%無菌甘油與之混合，即為保存液；保存液中平均菌數(shù)為4. 3X107CFU/ mL，-20°C保存?zhèn)溆?。使用前恢?fù)室溫至（22°C)后渦旋10s。
[0017] 1· 3· 2菌液0D6。。值對應(yīng)的菌數(shù)范圍 加保存液2μL于200mL志賀氏菌增菌肉湯增菌液中，設(shè)計(jì)10個(gè)平行，41. 5± 1°C下進(jìn) 行培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)8、12、16、18h時(shí)利用多功能酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)液的0D_值，同時(shí)按照 GB4789. 2-2010《動(dòng)物源性食品中抗生素類藥物殘留檢測方法：微生物抑制法》進(jìn)行菌落計(jì) 數(shù)。
[0018] 1.3.3基質(zhì)的前處理 雞肉(無抗生素殘留）剔除脂肪組織（因動(dòng)物脂肪較易氧化酸敗，使得干粉質(zhì)量下降，保 存狀態(tài)不穩(wěn)定，因此盡量剔除脂肪)，冷凍干燥后脫水率為73. 029% ;將脫水雞肉用高速萬能 粉碎機(jī)粉碎，至基質(zhì)組織細(xì)度為170目，其呈疏松粉末狀，易分散于熱水中，有少量的沉淀， 6°C〇y輻射劑量選擇6KGY，滅菌后按100g/袋分裝于自封袋中，于玻璃干燥鍋中存儲(chǔ)待用。
[0019] 1.3.4保護(hù)劑的設(shè)計(jì) 將脫脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸分別記為M、P、S、T，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，其水平 設(shè)計(jì)見表1，并選用L9 (34)正交表安排試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。每種保護(hù)劑配方液加入體積 濃度為1%的新鮮菌液（0D6QQ=0.215)，于臺式恒溫振蕩器上混勾（300r/min，30min)，分別按 2mL/瓶分裝于無菌西林瓶中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)見表3。以保護(hù)率為指標(biāo)，得出保 護(hù)率最高的保護(hù)劑配方。
[0020] 保護(hù)率況計(jì)算公式：
式中：G為凍干前菌數(shù)（CFU/mL) ;G為凍干后菌數(shù)（CFU/mL) 表1單因素水平設(shè)計(jì)

1. 3. 5混懸液的配制 將預(yù)處理后的雞肉基質(zhì)與無菌水混合成基質(zhì)懸液，再加入保護(hù)劑混合后得混懸液。根 據(jù)基質(zhì)脫水率(估為75%)設(shè)計(jì)混懸液的配制方案，其方法見表4。將新鮮菌液（0D_=0. 270) 按混懸液體積1%添加至混懸液中，于臺式恒溫振蕩器上300r/min振蕩30min，2mL/瓶分裝 于西林瓶中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)見表5。根據(jù)混懸液保護(hù)率盡（計(jì)算參見公式1) 得出最優(yōu)配制方式。
[0021] 凍干后樣品復(fù)原方法：樣品于室溫（22°C)下放置lOmin，然后加2mL生理鹽水渦旋 l〇s，靜置lOmin。
[0022] 表4混懸液的配制設(shè)計(jì)
1. 3. 6混懸液含菌數(shù)的確定 1. 3. 6. 1凍干樣品含菌數(shù)短期下降率 按照1. 3. 5得出的最優(yōu)混懸液配制方式配制lOOmL混懸液，根據(jù)保護(hù)率馬及新鮮菌液 含菌數(shù)，設(shè)計(jì)混懸液含菌數(shù)(添加混懸液體積1%的菌液)。充分混勻后按2mL/瓶分裝于西 林瓶中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥參數(shù)見表5。
[0023] 凍干后樣品于-20°C條件保存，并分別于0、7、14、28、40天時(shí)取樣計(jì)數(shù)，計(jì)算凍干 樣品菌數(shù)的短期下降率疋。
[0024] 菌數(shù)下降率疋的計(jì)算公式為：
式中：G為凍干后當(dāng)日菌數(shù)（CFU/瓶)；為-70°C條件下存儲(chǔ)η天后的菌數(shù)（CFU/瓶)；疋為第η天菌數(shù)下降率（％) 1. 3. 6. 2混懸液菌數(shù)的確定 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含菌數(shù)預(yù)期值為：200~600CFU/瓶(即100~300CFU/mL)。根據(jù)保護(hù)率爲(wèi)及 計(jì)算混懸液最小含菌數(shù)K及最大含菌數(shù)/2。
[0025] 最小含菌數(shù)?；的計(jì)算公式為：
則添加新鮮菌液的量應(yīng)保證混懸液含菌數(shù)< /2。
[0026] 1. 3. 7批量制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)凍干樣品 按照上述工藝流程制備6個(gè)批次，每批次100個(gè)樣品，共計(jì)540個(gè)樣品，批次編號為：SH1~SH6,固定鋁蓋后存于-20°C待測。
[0027] 1.3.8志賀氏菌的驗(yàn)證 對制備后的凍干樣品利用VITEK2程序進(jìn)行志賀氏菌的鑒定。
[0028] 1. 3. 9均勻性驗(yàn)證 按隨機(jī)表抽樣，每批樣品抽取15瓶，在控制同樣實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測樣品的含菌數(shù) (CFU/瓶)，對結(jié)果進(jìn)行方差分析。
[0029] 1. 3. 10凍干樣品的定值 定值結(jié)果表示為：標(biāo)準(zhǔn)值土總不確定度。標(biāo)準(zhǔn)值參考1. 3. 8結(jié)果。
[0030] 1. 3. 10. 1菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法的不確定度評估 將新鮮培養(yǎng)菌液根據(jù)〇D6。。值估計(jì)濃度約為2. 0X10sCFU/mL~3.OX10sCFU/mL，稀釋至 適當(dāng)濃度，吸取lmL于平板計(jì)數(shù)，平行兩次，以結(jié)果的對數(shù)值進(jìn)行驗(yàn)證，用合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差 來評估計(jì)數(shù)帶來的不確定度。