專利名稱：物質(zhì)的測定方法及試片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)根據(jù)試樣中的分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)，生成可檢測物質(zhì)例如染料，通過測定該可檢測物質(zhì)來測定生物成分或環(huán)境試樣等分析對象物質(zhì)的方法，以及涉及該方法中使用的試片。
背景技術(shù)：
有關(guān)檢測并定量分析試樣中的分析對象物質(zhì)、例如體液中的尿或血等生物成分，食品、醫(yī)藥、自然環(huán)境中存在的微量物質(zhì)、工業(yè)化學(xué)物質(zhì)、廢棄物中的微量物質(zhì)等的方法，已經(jīng)涉及采用分析對象物質(zhì)參與的反應(yīng)系統(tǒng)、測定反應(yīng)生成的色素等可檢測物質(zhì)的方法。
這類方法例如有，在過氧化物酶(POD)存在下，使分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)生成的過氧化氫與被氧化性顯色劑(色素前體)進行氧化還原反應(yīng)，對生成的色素化合物進行比色定量的方法等，這種方法由于十分簡便在臨床檢查中被廣泛使用。此外，還有一種方法是，利用酶等使電子傳遞物質(zhì)(介體)與分析對象物質(zhì)之間產(chǎn)生氧化/還原反應(yīng)，根據(jù)生成的電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體在電極上還原/氧化時的電化學(xué)應(yīng)答測定分析對象物質(zhì)。
但是，采用以往的方法時，如果分析對象物質(zhì)量少，測定的靈敏度不足，不能得到高精度的測定結(jié)果，因此，人們希望研制出提高測定靈敏度的高精度的測定方法。
以往的方法還有一個缺點是，反應(yīng)時間很長，因此測定需要耗費很長時間，或者，到達檢測反應(yīng)結(jié)束需要很長時間，因此采用根據(jù)反應(yīng)速度進行定量的速率法時定量精度較差。為了解決上述問題，以往有人對反應(yīng)系統(tǒng)加熱，以提高反應(yīng)速度或者提高參與反應(yīng)的試劑的濃度等方法。但是，采用反應(yīng)系統(tǒng)加熱的方法時，為了進行加熱需要有熱源，使分析變得復(fù)雜化。另外，在生成物質(zhì)是熱不穩(wěn)定的情況下，檢測發(fā)生困難，因此不能采用這種方法。另一方面，提高試劑濃度的方法，由于檢測的本底計數(shù)上升和分析成本的增加，也不實用。另外還有一種方法是，為了提高反應(yīng)速度而添加催化劑等，但有很多檢測反應(yīng)目前還找不到適宜的催化劑，這種方法也未達到實用程度。如上所述，以往的方法存在許多不足，因而迫切希望更簡單、反應(yīng)速度快、能迅速進行測定的新方法。
此外，在生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)中，包括生成對反應(yīng)溶劑不溶解的物質(zhì)的場合，存在下面不利的問題(1)在間歇式自動生化檢驗裝置等使用液體試劑進行光學(xué)檢測的測定時，如果反應(yīng)生成的色素不溶解于溶劑，它們就會析出，附著在測定池的壁上，遮住入射光和透射光，或者造成分注嘴污染，使測定難以進行。
(2)同樣，在使用液體試劑進行光學(xué)檢測時，如果生成不溶性副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物就會析出，附著在測定池的壁上，遮住入射光和透射光，或者造成分注嘴污染，或者由于聚集而引起散射或遮光等，使測定難以進行。
(3)在將試樣點滴或滲透到試片中，使之反應(yīng)，用光學(xué)方法檢測生成的色素的測定過程中，如果生成的色素不溶解于試樣溶劑，這些色素就會不均勻地沉淀到試片基材上，或者色素產(chǎn)生聚集，導(dǎo)致測定精度惡化。
(4)在間歇式自動生化檢驗裝置等使用液體試劑的電極測定過程中，如果生成不溶性副產(chǎn)物，電極表面就會被不溶性沉淀物覆蓋，引起電極污染，使電化學(xué)應(yīng)答降低，導(dǎo)致測定精度惡化。
不溶性與難溶性的差別在于不溶解于溶劑的程度，在本發(fā)明中，下文中所述的不溶性也可以由難溶性替換。
另一方面，特別是在生成的可檢測物質(zhì)于反應(yīng)溶劑中不溶解的場合，采用以往的方法時，可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)系統(tǒng)不均一，反應(yīng)不能迅速進行，因此有時導(dǎo)致反應(yīng)速度和測定靈敏度低下，例如在使用酶的反應(yīng)系統(tǒng)中，有時生成物會沉淀到酶附近，阻礙反應(yīng)的進行。
因此，利用在進行反應(yīng)的反應(yīng)溶劑中生成不溶性副產(chǎn)物的反應(yīng)來測定的方法幾乎都不能使用。因此，不得不選擇采用不生成不溶性生成物的反應(yīng)檢測系統(tǒng)，或者采用合成化學(xué)方法使生成物可以溶解于反應(yīng)溶劑中，研制、開發(fā)新的檢測反應(yīng)系統(tǒng)，但是，這樣的反應(yīng)系統(tǒng)十分有限。要研制、開發(fā)只生成可溶性物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)需要大量的人力和物力。另外，為了實現(xiàn)可溶解化、乳化或分散等狀態(tài)，需要添加表面活性劑，但添加表面活性劑對于測定成本是不利的，而且還妨礙反應(yīng)進行，有許多副作用，未必是一個好的解決辦法。因此，迫切需要以更簡單的方式解決上述問題，研制出在不溶性生成物存在的條件下也能進行測定的新方法。
另外，利用生成上述過氧化氫的反應(yīng)系統(tǒng)測定分析對象物質(zhì)的方法，有許多反應(yīng)隨著氧化而產(chǎn)生過氧化氫，因此這些方法是重要的測定方法。但以往的方法由于下述原因不能保證容易地進行準(zhǔn)確地測定，即在這些測定方法中，色素化合物等可檢測物質(zhì)的量或濃度必須與過氧化氫等特定物質(zhì)在某些情況下定量相關(guān)，由于過剩的過氧化氫的強氧化性或生物試樣中的抗壞血酸等的強還原性，使比色定量法中的氧化還原系統(tǒng)受到影響，上述色素化合物等可檢測物質(zhì)被分解，致使測定產(chǎn)生誤差。
例如，在這些測定方法中，葡萄糖等分析對象物質(zhì)受葡糖氧化酶等氧化酶的作用一下子生成過量的過氧化氫時，除了色素前體與過氧化氫的反應(yīng)外，還出現(xiàn)生成的色素與過氧化氫的反應(yīng)。結(jié)果，生成的色素在它形成的同時就被過氧化氫所分解，導(dǎo)致退色。
另外，過氧化物酶使過氧化氫生成富有反應(yīng)性的超氧化物等活性氧類，如果試樣中存在這樣的過氧化物酶，或存在具有類似作用的過渡金屬離子及其配合物，活性氧類就會與生成的色素反應(yīng)，使之分解、褪色。這種干擾也會給測定帶來一些麻煩。此外，生成色素等可檢測物質(zhì)的反應(yīng)在暴露于大氣中的狀態(tài)下進行時，生成的色素被空氣中的氧或溶解在反應(yīng)液中的氧所氧化，發(fā)生分解和褪色。
因此，人們進行了各種試驗，尋找可以提供不易分解的穩(wěn)定物質(zhì)的色素前體以及添加各種穩(wěn)定化劑等，但結(jié)果都不甚理想。
另外，在生物試樣中含有抗壞血酸、尿酸、膽紅素等還原性物質(zhì)，它們對氧化還原反應(yīng)的影響很大，特別是在抗壞血酸共存條件下如何準(zhǔn)確進行測定，多年來一直是臨床分析中研究的課題。除了上述色素前體的探索之外，人們還進行了各種嘗試，研究利用酶的選擇分解、利用添加過碘酸的分解、利用鐵-乙二胺四乙酸螯合物的氧化分解、利用半透膜的選擇分離等抑制干擾手段(參見太田宜秀、小川豐《臨床檢查》34(4)，502-504(1990)；特公平1-41223；特公平2-4861；特公平4-18630；特開平5-95795；特開平7-155196)。
此外還有一種方法是，利用除氧化還原反應(yīng)之外的各種公知的反應(yīng)(例如酸堿反應(yīng)之類的縮合反應(yīng)，或重氮鹽的偶聯(lián)反應(yīng)、配合物形成反應(yīng)等)生成與特定的分析對象物質(zhì)存在定量關(guān)系的色素(例如偶氮系色素等)，用光學(xué)方法對生成的色素進行定量，從而測定特定的分析對象物質(zhì)。這些方法在分析化學(xué)手冊中有詳細的描述，是一些重要的方法。但是，有的時候，這樣生成的色素是不穩(wěn)定的化合物，會被環(huán)境中的氧及試樣中的氧化性物質(zhì)或還原性物質(zhì)、試樣中的氫離子或堿、光等的作用所分解，在測定這樣的物質(zhì)時，例如，要求操作迅速，或者要求在用氮置換大氣的環(huán)境或遮光的環(huán)境中進行操作，不然的話就會產(chǎn)生誤差。
另外，在使用電子傳遞物質(zhì)(介體)的方法的場合，還有一種方法是，在酶反應(yīng)進行一預(yù)定時間，這期間電子傳遞物質(zhì)發(fā)生氧化/還原，使電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體蓄積起來，經(jīng)過一定時間后，蓄積的電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體在電極上還原/氧化，產(chǎn)生很大電化學(xué)應(yīng)答，從而能以高的靈敏度測定分析對象物質(zhì)，但是，有時蓄積的電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體被與其共存的還原性物質(zhì)或氧化性物質(zhì)所還原/氧化，發(fā)生分解反應(yīng)，致使測定產(chǎn)生誤差。
如果可檢測物質(zhì)不發(fā)生分解，保持穩(wěn)定，測定時能保證定量關(guān)系，且通過時間積分可以得到更高的S/B比(信噪比)，這樣就可以改善分析精度及提高靈敏度。因此，為了研制可以穩(wěn)定地生成容易測定的可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)，迄今為止人們作出了大量的努力。例如在許多化學(xué)手冊中記載了迄今所研制的生成穩(wěn)定可檢測物質(zhì)的反應(yīng)所用各種試劑。
但是，探索這樣的生成穩(wěn)定物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)要耗費大量的人力和時間，尋求生成穩(wěn)定、易檢測的可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)的努力一直沒有間斷。因此，即使目前使用的測定方法中，許多情況下不得已要把由pH值、水分、氧化還原物質(zhì)等共存物、光等分解的不穩(wěn)定物質(zhì)也作為檢測物質(zhì)進行測定。
另一方面，通過測定基于試樣中的分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)而生成的色素等可檢測物質(zhì)來測定分析對象物質(zhì)，用于檢查和分析尿等液體試樣中的成分的分析用試片，通常由進行液體試樣的吸收、擴散、反應(yīng)、檢測等一系列分析過程的試驗部分和支承試驗部分的支承部分構(gòu)成，必要時還有傳感器、試樣吸入裝置等。上述試驗部分由擔(dān)負(fù)各種功能的層或區(qū)域等部分組成，一般地說，這些部分包括用于吸入試樣并將其導(dǎo)入試驗部分的試樣吸入部；用于使試樣在試驗部分中均勻滲透、擴散的擴散滲透部；含有與試樣中所含分析對象物質(zhì)反應(yīng)的試劑的試劑部；引起檢測反應(yīng)等反應(yīng)的反應(yīng)部；利用吸附或分配等類似于色譜的作用將試樣中的成分和檢測反應(yīng)生成的色素分離的展開部；利用試樣移動的時間調(diào)整反應(yīng)進行的時間控制部；利用吸附作用截留或除去試樣中的成分或生成的色素等的保持部；通過反射率、透射吸收或熒光等檢測色素的檢測部；吸收過剩的試液、添加的洗滌液和展開液、防止逆流的吸收部等。
在實際的試片中，這些擔(dān)負(fù)上面各種作用的部分不一定是分別獨立存在的，例如檢測部與試樣吸入部、試劑部、反應(yīng)部合而為一的石蕊試紙就是一個部分兼有幾種作用。
此外，還可以舉出具有擴散層(兼作試樣吸入層)、檢測層(兼作試劑層和反應(yīng)層)、或含有與兼作試劑層的反應(yīng)層獨立的檢測層的單層型或多層型的試片。其中有許多是用粘結(jié)層粘貼在支承體上。有的時候，還有在反應(yīng)層與檢測層之間具有用于除去干擾成分的展開層或保持層的試片。還有的時候，擴散層兼作展開層，通過粘結(jié)層與試劑層連接。在通過測定反射率進行檢測的場合，有時在檢測層的前后還要設(shè)置反射層。試樣被滴到兼作試樣吸入層的擴散層上，均勻地擴散、溶解試劑層內(nèi)的試劑，進行反應(yīng)，因而例如由色素前體生成色素。在試劑層和反應(yīng)層兼作檢測層的場合，色素可以直接進行測定，而在具有獨立的檢測層的場合，要等生成的色素進一步移動到檢測層時再進行測定。(參見H.G.Curme，等.，Clinical Chemistry，24(8)，1335-1342(1978)、B.Walter，Analytical Chemistry，55(4)，498A(1983)、近藤朝士「ぶんせき」1984(7)，534、近藤朝士「ぶんせき」1986(6)，387、分析化學(xué)手冊第8頁(日本分析化學(xué)會編改訂第4版、丸善(1991))、特開平6-213886(北島昌夫等))。
再有，還可以舉出利用試樣平面移動的試片，該試片包括濾紙小片上的試片末端的展開液浸透部，與之相鄰的試樣吸入部，靠近其中央兼作試劑部(其上固定有酶)的反應(yīng)部，在其頂端兼作試劑部(固定其上的色素前體等)、反應(yīng)部和保持部的檢測部。在這種場合，將試樣滴到試樣吸入部后，利用毛細管作用使展開液從試片的末端開始滲透，從而使試樣移動，在兼作第1試劑部(其上固定有酶)的反應(yīng)部樣品與酶反應(yīng)，生成過氧化氫，生成的過氧化氫借助展開液而移動，在兼作第2試劑部(固定有色素前體等)和反應(yīng)部及保持部的檢測部中使色素前體顯色，吸附并保持生成的色素等(可檢測物質(zhì))。因為與展開液移動的同時，過氧化氫移動，與此同時發(fā)生顯色反應(yīng)，分析對象物質(zhì)的量增加時，顯色的幅度增長，從而可以測定物質(zhì)。(參見M.P.Allen，等人.，ClinicalChemistry，39(9)，1591-1597(1990)’、D.Noble，Analytical Chemistry，65(23)，1037A(1993))。
這樣的試片可以用于尿化驗、生化檢驗、免疫色譜檢驗等。作為免疫色譜試片的例子，例如將固定有抗體的濾紙(可以說整個包括試劑部、反應(yīng)部、展開部、保持部和檢測部)的一端，在由作為試劑的酶連接抗原和含有抗原(分析對象物質(zhì))的試樣混合而成的展開液中浸漬，使之展開，同時在作為第2試劑的顯色液(含有色素前體)中展開，這時，預(yù)先存在的酶連接抗原部分被展開及被捕集而呈帶狀顯色。顯色帶的長度與試樣中的抗原含量成正比。(參見R.F.Zuk，等人.，ClinicalChemistry，31(7)，1144-1150(1985))。
作為免疫色譜試片的另一個例子，可以舉出，在小片膜濾器上的一端配備有兼作試樣吸入部的試劑部(第1抗體固定化著色膠乳)，在靠近中央配備有兼作展開部的試劑部(識別與第1抗體之抗原相同的抗原，但表位不同的第2抗體)，還配備有展開部，另外，配備有兼作試劑部(抗第1抗體抗體)和保持部的檢測部。將試樣滴加到試樣吸入部時，抗原(分析對象物質(zhì))與第1抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，免疫復(fù)合體直接與試樣同時移動，在兼作展開部的試劑部中它與第2抗體發(fā)生層疊反應(yīng)。但是，未形成免疫復(fù)合體的過剩的第1抗體，隨試樣移動的同時通過展開部，在兼作試劑部(抗第1抗體抗體)和保持部的檢測部中被捕捉。通過測定固定第1抗體的著色膠乳(含有作為可檢測物質(zhì)的色素)的顯色，可以測定分析對象物質(zhì)。(參見M.W.Davidson，AnalyticalTroceedings，29，459(1992))。
但是，在上述各種試片中，與分析成分反應(yīng)生成的色素在試樣液、反應(yīng)液等中往往具有溶解性，結(jié)果產(chǎn)生許多問題，如色素洗脫入大量溶液中，向擴散層反沖，以及具有多個試驗部的多項目試紙中的色素等附著到鄰接的試驗部上等等。另外，伴隨著干燥，色素等向試驗部的邊緣移動，中央部位的濃度減小，周邊部位的濃度增大。
這些現(xiàn)象使得測定的靈敏度、準(zhǔn)確性和精度降低，這些問題對于浸漬在試樣液中測定的尿試紙中特別突出，無論哪一種試樣都普遍存在這個問題。
為了解決這個問題，人們曾經(jīng)提出了下列方法在試驗部上覆蓋保護層，防止試劑洗脫出(特開平2-38861)；由吸收性好的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體(多孔質(zhì)層、多孔性膜)構(gòu)成的試驗部均勻吸收試樣，防止鄰接的試驗部的液體間交匯的方法(特開平2-6541)；選用生成不溶性色素的反應(yīng)方法；利用不溶性、疏水性的粘結(jié)劑(固著劑)捕捉生成的色素的方法(特開平7-181174)；在多項目試紙中擴大鄰接的試驗部間的距離的方法；控制、調(diào)整浸漬時間的方法；控制測定時間，在擴散發(fā)生之前進行測定的方法等。但是，在試驗部上覆蓋保護層或用沉淀凝固法等制成多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，使試紙的制造工藝過于復(fù)雜。如果選用生成不溶性色素的反應(yīng)，則產(chǎn)生抑制酶活性的生成物。以疏水性高分子作為粘結(jié)劑的試片，帶來水性試樣溶液的吸收惡化等缺點。另外，對多項目試片來說，通常一個傳感器要在多個試驗部間移動，進行反射光測定，因此如果擴大試驗部間的距離，勢必要增大面積，對于傳感器的移動不利。其它的方法都有各自尚待解決的問題，例如，控制浸漬時間的方法在尿檢驗中帶來很多麻煩，控制檢測時間的方法在其與反應(yīng)時間的關(guān)系上不容易掌握等。這些問題目前尚未發(fā)現(xiàn)令人滿意的解決辦法。
另外，上述使用電子傳遞物質(zhì)(介體)、根據(jù)氧化/還原時的電化學(xué)應(yīng)答測定分析對象物質(zhì)的方法，以及根據(jù)與特定的離子形成配位鍵或離子鍵的配合物(離子載體)所形成的配合物在液膜電極中的移動、測定伴隨的膜電位來測定作為分析對象物質(zhì)之離子的方法，作為重要的測定方法已廣為人知，但使用電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體或配位化合物的電極，通常在不溶性的聚合物中添加電子傳遞物質(zhì)或配合物，以防止電子傳遞物質(zhì)或配合物的洗脫或擴散，同時，為了使電子移動迅速起見，使電子傳遞物質(zhì)或配合物保持在電極表面附近，但由于聚合物中物質(zhì)的移動受到限制，試樣中的分析對象物質(zhì)或由分析對象物質(zhì)生成的中間物質(zhì)，與不溶性聚合物中的電子傳遞物質(zhì)或配合物的反應(yīng)受到阻礙，同樣也未找到一個令人滿意的解決方案。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是，提供測定基于分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)而生成的色素等可檢測物質(zhì)，來高靈敏度測定分析對象物質(zhì)的測定方法。這里所說的測定包括定量測定和定性測定兩方面的含義。
本發(fā)明的另一目的是，在上述分析對象物質(zhì)的測定方法中，提供使上述可檢測物質(zhì)穩(wěn)定化來提高測定精度并實現(xiàn)高靈敏度的方法。
本發(fā)明的又一目的是，在上述測定方法中提高化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度、從而可以迅速進行測定的新方法。
本發(fā)明的再一個目的是，利用包括生成不溶性物質(zhì)反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)的上述方法，來提供高靈敏度的測定方法。
此外本發(fā)明還有一個目的是，提供可以抑制色素等擴散、洗脫，而準(zhǔn)確地進行檢查和分析并且操作簡便的分析用試片。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在層狀無機化合物存在下，進行形成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)，或者使試片上用于檢測可檢測物質(zhì)的檢測部等試驗部分中含有層狀無機化合物，可以實現(xiàn)上述目的，從而完成本發(fā)明。
因此本發(fā)明提供一種分析物的測定方法，該方法利用試樣中的分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)，測定上述可檢測物質(zhì)，從而測定分析對象物質(zhì)，其特征是，在包含可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)中，存在層狀無機化合物(以下稱為“本發(fā)明的測定方法”)。
另外，本發(fā)明提供了上述物質(zhì)測定方法，該方法包括在上述反應(yīng)系統(tǒng)中添加層狀無機化合物，使可檢測物質(zhì)吸附在該層狀無機化合物上之步驟(以下稱為“本發(fā)明的第1方法”)。
在本發(fā)明的第1方法中，通過使生成的可檢測物質(zhì)吸附在層狀無機化合物上，可以實現(xiàn)高靈敏度的測定。即，例如使可檢測物質(zhì)吸附在層狀無機化合物上并沉降，結(jié)果提高了光學(xué)或電化學(xué)檢測時的測定靈敏度。在這種場合，有時可檢測物質(zhì)吸附在層狀無機化合物上，作為膠態(tài)凝聚物沉降下來，但并不一定必須凝聚。
此外，本發(fā)明提供了分析物的測定方法，其特征是，使上述反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物，以抑制可檢測物質(zhì)的分解(以下稱為“本發(fā)明的第2方法”)。
在本發(fā)明的第2方法中，使生成待測定的可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物，幾乎在可檢測物質(zhì)生成的同時，或者在被共存的物質(zhì)分解之前，該可檢測物質(zhì)與上述層狀無機化合物形成復(fù)合體，從而可以抑制可檢測物質(zhì)由于反應(yīng)系統(tǒng)中共存的物質(zhì)的作用而被分解。
另外，本發(fā)明還提供了分析物的測定方法，其特征是，通過在層狀無機化合物存在下進行上述可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)，提高上述生成反應(yīng)的反應(yīng)速度(以下稱為“本發(fā)明的第3方法”)。
在本發(fā)明的第3方法中，通過在層狀無機化合物存在下進行可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)，可以提高上述生成反應(yīng)的反應(yīng)速度，可迅速進行測定，不僅大幅度縮短測定時間，而且可以縮短到達檢測反應(yīng)終點所需要的時間，結(jié)果，在根據(jù)反應(yīng)速度進行定量測定的鑒定法中可以提高測量精度。提高可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)速度的機理目前尚不十分清楚，據(jù)認(rèn)為是由于上述生成反應(yīng)的反應(yīng)起始物質(zhì)或反應(yīng)中間體附著在層狀無機化合物上，在表面上濃縮，從而提高了反應(yīng)速度。
另外，本發(fā)明還提供了分析物的測定方法，其特征是，構(gòu)成上述反應(yīng)系統(tǒng)的至少一個反應(yīng)是生成對于反應(yīng)溶劑不溶解的物質(zhì)的反應(yīng)(以下稱為“本發(fā)明的第4方法”)。
在本發(fā)明的第4方法中，通過在包括形成可檢測物質(zhì)之反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)中優(yōu)選層狀無機化合物以分散狀態(tài)存在，即使該可檢測物質(zhì)或該反應(yīng)的副產(chǎn)物等不溶解于反應(yīng)溶劑，也能象均一系統(tǒng)一樣迅速進行反應(yīng)。據(jù)信，這是由于生成的不溶性可檢測物質(zhì)或不溶性副產(chǎn)物吸附在層狀無機化合物上，與該層狀無機化合物一起均勻分散于反應(yīng)系統(tǒng)中的緣故。另外，在本發(fā)明中，通過使溶劑不溶解的可檢測物質(zhì)或不溶性的副產(chǎn)物吸附在層狀無機化合物上，可以防止該可檢測物質(zhì)或副產(chǎn)物析出到反應(yīng)系統(tǒng)中，導(dǎo)致檢測時操作困難。
防止檢測時操作困難的條件，可以具體舉出如下(1)在間歇式自動生化檢驗裝置等使用液體試劑進行光學(xué)檢測的測定中，反應(yīng)生成的色素對于溶劑是不溶解的情況下，通過將色素吸附在層狀無機化合物上，可以防止由于色素析出而附著在測定池壁上遮蔽入射光和透射光等，或者引起分注咀的污染，或者凝聚而引起吸光系數(shù)異常、散射或遮光等造成測定困難。
(2)同樣，在使用液體試劑進行光學(xué)檢測的測定中，若生成不溶性副產(chǎn)物，通過使副產(chǎn)物吸附在層狀無機化合物上，可以防止副產(chǎn)物吸附在測定池壁上、遮住入射光和透射光等，或者引起分注咀的污染，或者凝聚而引起散射或遮光，避免了測定困難。
(3)在將待測定的試樣滴加或浸滲到試片中、并形成用光學(xué)方法測定的色素的測定過程中，在生成的色素不溶解于試樣溶劑的場合，通過使色素附著在層狀無機化合物上，可以避免色素不均勻沉淀到試片的反應(yīng)部或檢測部上，或者產(chǎn)生色素凝聚，導(dǎo)致測定精度惡化。
(4)在間歇式自動生化檢驗裝置等使用液體試劑的電極測定中，生成不溶性副產(chǎn)物的場合，通過使該副產(chǎn)物附著在層狀無機化合物上，可以防止由于電極表面被不溶性沉淀附著物覆蓋而引起電極污染，或者電化學(xué)應(yīng)答低下，導(dǎo)致測定精度惡化。
本發(fā)明測定方法，只要是包括基于試樣中的分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)，通過測定上述可檢測物質(zhì)來測定上述分析對象物質(zhì)的方法均可使用，沒有特別的限制。當(dāng)然，可檢測物質(zhì)也可以是分析對象物質(zhì)本身。另外，即可以是通過測定可檢測物質(zhì)定性測定分析對象物質(zhì)的方法，也可以是根據(jù)上述可檢測物質(zhì)與分析對象物質(zhì)存在量的相關(guān)關(guān)系，利用包括形成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)定量測定分析對象物質(zhì)的方法。此外，不只限于通過上述分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)直接生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)的情況，也包括上述分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)與可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)通過其它的化學(xué)反應(yīng)間接相關(guān)的情況。其中，本發(fā)明的方法特別適合于可檢測物質(zhì)是通過氧化還原反應(yīng)生成色素或電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)的測定方法，以及生成的可檢測物質(zhì)是偶氮染料等色素或離子載體與分析對象物質(zhì)的配合物等的反應(yīng)系統(tǒng)的測定方法。
尤其是以光學(xué)方式測定由生物體成分經(jīng)氧化酶反應(yīng)生成的過氧化氫與被氧化性顯色劑之間氧化還原反應(yīng)定量生成色素的方法，可以用于臨床檢查體液中各種成分的定量和環(huán)境分析等，將本發(fā)明的測定方法用于這類分析、檢測，可以實現(xiàn)高靈敏度的測定。
特別是本發(fā)明的第2方法，例如在氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)中，反應(yīng)系統(tǒng)中作為反應(yīng)中間體或試樣中的夾雜物同時存在許多氧化性物質(zhì)、還原性物質(zhì)或過氧化物酶類物質(zhì)，由于反應(yīng)系統(tǒng)中的這些共存物質(zhì)的作用，可檢測物質(zhì)有時會被分解，在這種情況下使用本發(fā)明的第2方法十分有效。
采用本發(fā)明的第2方法，在使用上述過氧化氫與被氧化性顯色劑的氧化還原反應(yīng)的測定方法中，可以克服由于反應(yīng)系統(tǒng)中存在的過剩的過氧化氫等氧化性物質(zhì)，和抗壞血酸、尿酸、膽紅素等還原性物質(zhì)的作用使色素分解、褪色，造成測定誤差等問題。
另外，本發(fā)明的第3方法，在可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)中反應(yīng)起始物質(zhì)或反應(yīng)中間體是陽離子性化合物的場合，通過在反應(yīng)系統(tǒng)中添加具有陽離子交換性能的層狀無機化合物，可以使上述反應(yīng)起始物質(zhì)或反應(yīng)中間體吸附在層狀無機化合物的表面上并濃縮，提高上述生成反應(yīng)的速度，迅速進行測定，因而本發(fā)明的第三方法特別適用于采用這樣的反應(yīng)系統(tǒng)的測定方法。
另外，本發(fā)明的第4方法，只要是采用含有生成反應(yīng)溶劑不溶解的可檢測物質(zhì)或不溶性副產(chǎn)物的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)的方法均可適用，沒有特別的限制。
本發(fā)明的測定方法可用于作為分析對象物質(zhì)檢測，優(yōu)選定量尿或血液等體液中的生物成分、食品、醫(yī)藥、自然環(huán)境中存在的微量物質(zhì)、工業(yè)化學(xué)物質(zhì)、廢棄物中的微量物質(zhì)等。
另外，本發(fā)明提供了一種分析試片，該試片包括基于試樣中的分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)測定上述可檢測物質(zhì)，從而測定上述分析對象物質(zhì)，其特征是，配備至少1個用于檢測上述可檢測物質(zhì)的檢測部的試驗部分，至少在上述試驗部分中含有層狀無機化合物(以下該試片稱為“本發(fā)明的試片”)。
本發(fā)明的試片可以由二層或多層包括用于檢測可檢測物質(zhì)的檢測層(作為檢測部)在內(nèi)的層所組成的試驗部分、至少在檢測層中含有層狀無機化合物。另外，本發(fā)明的試片也可以是上述試驗部分含有用于擴散試樣的擴散層的試片、這樣，試樣通過擴散層擴散到達檢測層。此外，本發(fā)明的試片還可以是具有檢測可檢測物質(zhì)的檢測區(qū)作為檢測部的至少一個試驗部分，且至少在上述檢測區(qū)中含有層狀無機化合物的試片。再有，本發(fā)明的試片還可以是具有用于擴散試樣的擴散區(qū)的試片、試樣通過該擴散區(qū)擴散到達檢測區(qū)。此外，本發(fā)明的試片還可以是檢測區(qū)由用于檢測可檢測物質(zhì)的檢測層的兩層以上構(gòu)成。另外，本發(fā)明的試片還可以是試驗部分具有試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)的反應(yīng)部，在上述反應(yīng)部中生成可檢測物質(zhì)的試片。另外，本發(fā)明的試片還可以將上述檢測部設(shè)置在試樣擴散后通過反應(yīng)部后到達之處的位置。再有，本發(fā)明的試片還可以是在上述檢測部中，試樣所含分析對象物質(zhì)與試劑進行反應(yīng)而生成上述可檢測物質(zhì)。
在本發(fā)明的試片中，由于試樣部中含有層狀無機化合物，分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)生成的色素等和層狀無機化合物吸附在一起，結(jié)果，抑制了色素等被試液和反應(yīng)液等擴散和洗脫，可以實現(xiàn)高靈敏度和高精度和分析。
本發(fā)明的試片適用于使用固相分析液體中所含成分的方法，特別適用于分析尿中的葡萄糖、膽紅素等成分。在分析這類液體中所含成分時，分析物與試劑反應(yīng)生成的色素等容易溶解在試樣中，擴散和洗脫，因而使用本發(fā)明的試片效果很好。
試劑只要與分析對象物質(zhì)能發(fā)生可檢測反應(yīng)即可，沒有特別的限制，優(yōu)先選用可以與分析對象物質(zhì)反應(yīng)，生成色素化合物，電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體，或離子載體與離子的配位化合物等可檢測物質(zhì)的試劑。另外，所述的生成色素化合物的反應(yīng)，只要是生成可以光學(xué)檢知的化合物的反應(yīng)即可?？梢允秋@色的反應(yīng)，也可以是引起變色、熒光、發(fā)光等的反應(yīng)。另外，在生成的色素等化合物是水溶性的場合，往往在試液或反應(yīng)液等中擴散、洗脫，因此，本發(fā)明的試片特別適用于采用能生成這類水溶性色素化合物的試劑的場合。
附圖的簡要說明
圖1是實施例1中測定的吸收光譜圖。
圖2表示實施例2和實施例3獲得的過氧化氫校準(zhǔn)曲線圖。
圖3表示將圖2的校準(zhǔn)曲線的縱軸和橫軸分別取對數(shù)的校準(zhǔn)曲線圖。
圖4表示實施例4中添加過氧化氫后的吸光率隨時間變化圖。
圖5是實施例5中測定的吸收光譜圖。
圖6表示實施例6中求出的抗壞血酸濃度的校準(zhǔn)曲線圖。
圖7是實施例7中測定的吸收光譜圖(添加綠土系統(tǒng))。
圖8是實施例7中測定的吸收光譜圖(不添加綠土系統(tǒng))。
圖9是實施例7中測定的亞硝酸鈉濃度33μmol/l的吸收光譜圖(添加綠土系統(tǒng)或未添加系統(tǒng))。
圖10表示實施例8中求出的亞硝酸鈉濃度的校準(zhǔn)曲線圖。
圖11表示實施例9中進行的POD顯色系的綠土添加效果試驗中吸光率隨時間變化圖。
圖12表示實施例10中進行的含有抗壞血酸的POD顯色系的綠土添加效果試驗中吸光率隨時間變化圖。
圖13是圖12中0-60秒?yún)^(qū)間的放大圖。
圖14表示實施例11中測定的吸光率隨時間變化圖。
圖15表示實施例12中測定的未添加綠土系統(tǒng)的吸光率隨時間變化圖。
圖16表示實施例12中測定的添加綠土系統(tǒng)的吸光率隨時間變化圖。
圖17表示實施例12中測定的亞硝酸鈉濃度25.0μmol/l添加綠土系統(tǒng)或未添加系統(tǒng)的吸光率隨時間變化圖。
圖18表示實施例13中浸滲綠土的濾紙上色素擴散狀態(tài)示意圖。
圖19表示實施例13中未經(jīng)處理的濾紙上色素擴散狀態(tài)示意圖。
圖20是實施例15中的反應(yīng)池示意圖。
圖21是實施例16中的試片示意圖。
圖22是實施例17中的試片示意圖。
這些圖中，參考號1表示添加綠土的場合，2表示沒有添加綠土的場合，3表示添加綠土而沒有添加過氧化氫的場合；4表示亞硝酸濃度33μmol/l的場合，5表示亞硝酸濃度16μmol/l的場合，6表示亞硝酸濃度8μmol/l的場合，7表示亞硝酸濃度0μmol/l的場合；8表示實施例1試樣，9表示實施例2試樣，10表示實施例3試樣，11表示實施例4試樣，12表示實施例5試樣；13表示亞硝酸鈉濃度50.0μmol/l的場合，14表示亞硝酸鈉濃度25.0μmol/l的場合，15表示亞硝酸鈉濃度12.5μmol/l的場合，16表示亞硝酸鈉濃度6.3μmol/l的場合，17表示亞硝酸鈉濃度1.6μmol/l的場合；18表示色素斑，19表示除去色素的顯色液，20表示玻璃，21表示涂膜，22表示PET；23表示浸滲試劑的濾紙(檢測層)，24表示雙面膠帶(粘接層)，25表示浸滲層狀無機化合物分散液的濾紙，26表示浸滲試劑的濾紙，27表示濾紙；28表示試樣吸入?yún)^(qū)，29表示擴散區(qū)，30表示反應(yīng)區(qū)，31表示控制反應(yīng)時間的區(qū)域，32表示保持區(qū)域，33表示吸收過剩試樣的區(qū)域。
發(fā)明優(yōu)選實施方案I.本發(fā)明的測定方法本發(fā)明的測定方法是，利用包括基于試樣中的分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)來測定可檢測物質(zhì)，從而測定上述分析對象物質(zhì)的方法。
1.可檢測物質(zhì)本發(fā)明中使用的反應(yīng)系統(tǒng)包括生成下述可檢測物質(zhì)的反應(yīng)。
可檢測物質(zhì)只要是能吸附在本發(fā)明的層狀無機化合物上即可，沒有特別的限制?？梢晕皆趯訝顭o機化合物上的物質(zhì)具體地可以是下列化合物胺、多胺等胺類；亞胺、聚亞胺等亞胺類；多烯類；苯胺衍生物、苯醌衍生物、芳香族稠環(huán)化合物等芳香族化合物；占噸、丫嗪、噻嗪等雜環(huán)化合物；離子與冠醚或纈氨霉素等環(huán)狀配位體的配合物等；這些化合物分子內(nèi)也可含有季氮原子、酚羥基、磺酸基、羧基。
可以吸附在層狀無機化合物上的物質(zhì)，例如在H.Van Olphen著的《An Introduction to Clay Colloid Chemistry，Second Edition》(KriegerPublishmient，Malabar)的第11章“Interaction of Clays and OrganicCompounds”中有詳盡的描述。另外，在特公昭50-8462(加藤忠義)等中介紹了許多種可以吸附的化合物，其中列舉了可以用光學(xué)方法、電化學(xué)方法檢測的物質(zhì)。
(1)可以用光學(xué)方法檢測的物質(zhì)可用光學(xué)方法檢測的物質(zhì)可以舉出色素。色素包括熒光色素和發(fā)光物質(zhì)等，另外，所述生成色素的反應(yīng)只要是生成可用光學(xué)方法檢知的物質(zhì)的反應(yīng)即可，不僅可以是顯色反應(yīng)，也可以是引起變色、熒光、發(fā)光等的反應(yīng)。
所述的色素可以舉出由色素前體經(jīng)氧化還原反應(yīng)、酸堿反應(yīng)、及縮合反應(yīng)等各種顯色反應(yīng)生成的色素化合物、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、以及由配位鍵、離子鍵等生成的色素配合物或熒光配合物等。
由氧化還原反應(yīng)生成的色素優(yōu)先選用具有芳香環(huán)等共軛系的化合物，具體地可以舉出如下以4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮(4-氨基安替比林，以下簡稱為4-AA)為代表的成色劑與氫供體(N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺等トリンダ-試劑類)氧化縮合生成的色素；鄰甲苯胺、聯(lián)苯胺類(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺等)的氧化顯色體色素；2，6-二氯-4-[(4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)已二烯-1-酮等無色體氧化生成的色素；4-羥苯基乙酸酯等氧化后生成的熒光物質(zhì)；化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)及其激發(fā)體；四唑鎓鹽的還原色素等甲類；1，1′-二甲基-4，4′-二吡啶鎓鹽等被還原后生成的色素等。
所述的氫供體，是在過氧化氫共存的條件下、通過過氧化物酶的作用與4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮(4-AA)或3-甲基-2-苯并噻唑啉腙縮合生成苯醌染料的苯酚之類化合物，具體地可以舉出二氯苯酚、鄰甲氧基苯酚、1，2，3-三羥基苯、二甲基苯胺、N-乙基-N-磺丙基間茴香胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-磺丙基間甲苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)間茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基茴香胺、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)間甲苯胺、N-(3-磺丙基)苯胺等。
在上述利用4-AA與氫供體在過氧化氫存在下反應(yīng)，生成苯醌系色素的反應(yīng)系統(tǒng)的方法中，用吸收光度計測定生成的苯醌系色素，間接地測定過氧化氫，從而可以測定分析對象物質(zhì)。
另外，上述的鄰甲苯胺、聯(lián)苯胺類可以舉出鄰甲苯胺、聯(lián)茴香胺、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺、N-(3-磺丙基)-3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺等。
無色體是氧化后形成色素而顯色的無色的色素前體。無色體氧化形成的色素可以舉出2，6-二氯-4-[(4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)已二烯-1-酮、2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)已二烯-1-酮、7-(二乙氨基)-3-亞氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪鹽、3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪鎓鹽、3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓鹽、1-羥基-5-甲基吩嗪鎓鹽、7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物。無色體可以舉出4，4′-亞芐基雙(N，N-二甲基苯胺)、4，4′-雙[N-乙基-N-(3-磺丙基氨基)-2，6-二甲基苯基]甲烷、1-(乙氨基硫羰基)-2-(3，5-二甲氧基-4-羥苯基)-4，5-雙(4-二乙氨基苯基)咪唑、4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺、N-(羧基甲氨基羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鹽、10-(羧基甲氨基羰基)-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪鹽等。
除此之外，氧化后顯色的色素前體還可以舉出4-甲氧基苯酚、4-乙氧基苯酚、2-乙氧基苯酚、1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)乙酮、2-羥基-5-甲氧基苯甲酸、2-羥基-5-甲氧基苯甲醛、2-羥基-5-甲氧基苯甲酸甲酯、4-甲氧基-2-硝基苯酚、2-氯-4-甲氧基苯酚、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸等。
另外，還可以舉出3-(4-羥苯基)-2-丙烯酸、2-羥苯基乙酸、3-羥苯基乙酸、4-羥苯基乙酸、3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、3，4-二氨基苯甲酸、3，5-二氨基苯甲酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、4-氨基-3-甲基苯甲酸、4-氨基-3-甲氧基苯甲酸、4-氨基鄰苯二甲酸等。
另外，還可以舉出2，4-二氨基-6-羥基嘧啶、4，5-二氨基-6-羥基嘧啶、4-氨基-2，6-二羥基嘧啶、6-羥基-2，4，5-三氨基嘧啶、4，5-二氨基-2，6-二羥基嘧啶、4-氨基-6-羥基-2-甲基嘧啶、4-氨基-6-羥基嘧啶、4-氨基-6-羥基-2-甲氧基嘧啶等。
此外，4-羥基苯基乙酸等被氧化后生成熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)可以舉出由下列化合物氧化后生成4-羥基苯基乙酸、(4-羥基-3-甲氧基苯基)乙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸、4-羥基-(2-氨乙基)苯酚、4-羥基-N，N，N-三甲基苯麥它明鎓、α-氨基對羥基氫化肉桂酸、4-羥基苯乙胺、N-(4-羥苯基)乙酰苯胺、2，7-二氯熒光素二乙酸酯等。
化學(xué)發(fā)光物質(zhì)之類的發(fā)光物質(zhì)可以舉出螢蟲熒光素、海螢蟲熒光素、多管水母系、光澤精衍生物、魯米諾衍生物(氨基苯二酰肼)、吖啶鎓酯、過草酸酯等。
例如，在上述利用聯(lián)苯胺類和無色體在過氧化氫存在下進行氧化反應(yīng)而顯色的反應(yīng)系統(tǒng)的方法中，用吸收光度計等測定生成的色素，間接地測定過氧化氫，從而可以測定分析對象物質(zhì)。
在上述利用生成熒光物質(zhì)和發(fā)光物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)的方法中，用熒光光度計或發(fā)光光度計進行測定，間接地測定過氧化氫，從而可以測定分析對象物質(zhì)。
在生成這類色素的氧化反應(yīng)中，參與氧化反應(yīng)的氧化劑不限于過氧化氫，也可以使用其它各種公知的氧化劑。還可以添加過氧化物酶等氧化酶。另外，還可以在生成色素的氧化反應(yīng)之前進行生成上述氧化劑的反應(yīng)。
另外，作為四唑鎓鹽可以舉出2，3，5-三苯基四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(1-萘基)-2H-四唑鎓鹽、3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯(lián)苯基-雙[2-(對硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓]鹽、3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-聯(lián)苯基)-4，4′-二基]-雙(2，5-二苯基-2H-四唑鎓)鹽、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、3，3′-(1，1′-聯(lián)苯基-4，4′-二基)-雙(2，5-二苯基-2H-四唑鎓)鹽、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓鹽等?！溥€原后生成的色素可以舉出1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶鎓鹽、1，1′-二芐基-4，4′-聯(lián)吡啶鎓鹽等的還原體。另外，7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等還原后生成熒光物質(zhì)，此類例子可以舉出7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物、5-氰基-2，3-雙(4-甲基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2，3-雙(4-氰基苯基)-5-氰基-2H-四唑鎓鹽等還原后生成的熒光物質(zhì)。
例如，在上述利用四唑鎓鹽和無色體在還原劑存在下還原反應(yīng)而顯色的反應(yīng)系統(tǒng)的方法中，用吸收光度計或熒光光度計等測定生成的色素，間接地測定還原劑，從而可以測定分析對象物質(zhì)。另外，也可以在生成色素的還原反應(yīng)之前進行生成還原劑的反應(yīng)。
在這類生成色素的還原反應(yīng)中，參與還原反應(yīng)的還原劑優(yōu)先選用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，但不限于上述化合物，也可以使用各種公知的還原劑。
在酸堿反應(yīng)中生成的色素可以舉出溴甲酚綠等隨著pH的變化而顯色或變色的化合物。這類化合物除了溴甲酚綠之外還可以舉出溴酚藍、酚紅、溴焦倍酚紅、鄰苯三酚紅等砜酞類色素，孔雀綠、玫紅酸等三苯甲烷類色素，喹哪啶紅、N-(對羥基苯基)-2，6-二氯對苯醌亞胺肟等喹啉類色素，7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物等噁嗪酮類色素，6，7-二羥基-4-甲基香豆素等香豆素類色素，苯胺低聚物等導(dǎo)電性高分子化合物等等。
例如通過加入酸或堿利用隨pH變化而顯色或變色的化合物反應(yīng)系統(tǒng)的方法中，用吸收光度計等測定生成的色素，間接地測定酸或堿，從而可以測定分析對象物質(zhì)。另外，通過加入氫離子利用隨著pH變化而顯色或變色的化合物反應(yīng)系統(tǒng)的方法中，用吸收光度計等測定生成的色素，可測定氫離子濃度，從而可以測定分析對象物質(zhì)。
除此之外，其它公知的各種顯色反應(yīng)中生成的色素可以舉出2-甲氧基-4-嗎啉代苯重氮鹽等重氮鹽經(jīng)過偶合生成的偶氮系色素，通過醛與2，3-二甲基-2，3-雙(羥基氨基)丁烷的反應(yīng)等各種公知的顯色反應(yīng)生成的色素，通過組胺與鄰酞醛的反應(yīng)等各種公知的反應(yīng)生成的熒光物質(zhì)，利用酶使4-甲基繖形磷酸鹽等酶底物反應(yīng)而生成的色素和熒光物質(zhì)。
重氮鹽經(jīng)過偶合生成的偶氮系色素可以舉出3-吲哚氧基與2-甲氧基-4-嗎啉代苯重氮鹽經(jīng)偶合生成的偶氮系色素；尿膽素原與3，3′-二甲氧基聯(lián)苯基-4，4′-重氮鹽經(jīng)偶合生成的偶氮系色素；在亞硝酸鹽存在下、4-氨基苯胂酸與N-1-萘乙二胺反應(yīng)生成的偶氮系色素；同樣在亞硝酸鹽存在下、2，4-二氯苯胺與N，N-二乙基-N′-1-萘基萘乙二胺草酸鹽反應(yīng)生成的偶氮系色素等。
在上述利用生成偶氮系色素反應(yīng)系統(tǒng)的方法中，用吸收光度計測定生成的色素，可以測定作為反應(yīng)起始物質(zhì)的分析對象物質(zhì)(在上例中是3-吲哚氧基、尿膽素原、亞硝酸鹽)。生成偶氮系色素的反應(yīng)不限于上述例子，還可以使用其它各種公知的生成偶氮系色素的反應(yīng)。
另外，通過各種公知的顯色反應(yīng)生成的色素可以舉出下面所述的公知顯色反應(yīng)生成的色素，但本發(fā)明不限于這些色素。所述的顯色反應(yīng)可以舉出檢測醛的過氧化氫與1，4-二氨基苯的反應(yīng)；檢測醛的2，3-二甲基-2，3-雙(羥基氨基)丁烷的反應(yīng)；檢測醛的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙與氧化劑的反應(yīng)；檢測仲胺的10H-吩噻嗪與溴的反應(yīng)；檢測硫醇的2，2′-二硫代二吡啶的反應(yīng)等。
上述利用公知的顯色反應(yīng)的方法中，用吸收光度計等測定生成的色素，從而可以測定作為反應(yīng)起始物質(zhì)的分析對象物質(zhì)(在上例中是醛、仲胺、硫醇)。但可以利用的公知顯色反應(yīng)并不限于上述例子。
利用各種公知的反應(yīng)生成的熒光物質(zhì)，可以舉出用下面所述的試劑進行的公知的檢測反應(yīng)中生成的熒光物質(zhì)，但并不限于這些。所述試劑可以舉出檢測胍基化合物的2-羥基-1，2-二苯基乙酮、檢測組胺的鄰苯二醛、檢測精脒的鄰苯二醛、檢測α-酮酸的1，2-二氨基-4，5-二甲氧基苯等。
上述利用公知的檢測反應(yīng)的方法中，用熒光光度計等測定生成的熒光物質(zhì)，可以測定作為反應(yīng)起始物質(zhì)的分析對象物質(zhì)(在上例中是胍基化合物、組胺、精脒、α-酮酸)?？梢岳玫墓獧z測反應(yīng)并不限于上述例子。
另外，通過酶進行反應(yīng)時、生成色素或熒光物質(zhì)的酶底物可以舉出胰凝乳蛋白酶的底物N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸-2-酰氨基吖啶酮、氨基肽酶的底物L(fēng)-丙氨酸-α-酰氨基吖啶酮、測定酯酶的7-乙酰氧基-N-甲基喹啉鎓鹽、酯酶的底物7-乙酰氧基-3H-吩噁嗪-3-酮、磷酸酶的底物4-甲基繖形磷酸鹽、磷酸酶的底物5，10，15，20-四(4-膦酰氧基苯基)卟吩等，但不限于這些。
利用上述通過酶使酶底物分解的反應(yīng)方法中，用吸收光度計或熒光光度計測定生成的色素或熒光物質(zhì)，間接地測定酶，從而可以測定分析對象物質(zhì)，酶或酶底物例如也可以化學(xué)地結(jié)合在抗體或其片段上。
由配位鍵、離子鍵生成的色素配合物或熒光配合物，包括金屬離子或陰離子與配位體等化合物通過配位鍵和離子鍵形成配合物而生成色素、熒光物質(zhì)等顯色、變色的化合物。形成金屬離子配合物而顯色、變色的化合物，除了作為金屬指示劑和鉻離子載體已知的化合物外，還包括與有色過渡金屬離子形成配合物而著色的化合物，具體地可以舉出如下乙二胺四乙酸、2，2-聯(lián)吡啶、1-羥基-2-(2-羥基苯基偶氮)苯、二苯并-18-冠-6、二環(huán)已基-18-冠-6、環(huán)狀多胺類、calix[4]芳烴、3-[N，N-雙(羧甲基)氨基甲基]-1，2-二羥基蒽醌、5′，5″-二溴焦倍酚砜酞、2-羥基-1-(1-羥基-2-萘基偶氮)-6-硝基-4-萘磺酸鹽、2，6-二氯-4′-羥基-3′，3″-二甲基品紅酮-5′，5″-二羧酸鹽、3，3′-雙[N，N-雙(羧基甲基)氨基甲基]熒光素、8-[N，N-雙(羧基甲基)氨基甲基]-4-甲基繖形酮、2，7-雙(2-胂羧基苯基偶氮)-1，8-二羥基-3，6-萘二磺酸、5-氯-2-羥基-3-(2，4-二羥基苯基偶氮)苯磺酸、5-[(六氫-2，4，6-三氧代-5-嘧啶基)亞氨基]-2，4，6(1H，3H，5H)-嘧啶三酮鹽、2-(5-溴-2-吡啶基偶氮)-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯胺鹽、1，8-二羥基-2-(2-吡啶基偶氮)-3，6-萘二磺酸鹽、2-亞硝基-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚等。
另外，與-價陽離子形成有色配合物的化合物可以舉出四[3，5-雙(三氟甲基)苯基]硼酸鹽、四苯基磷鎓鹽等。
另外，與鈣離子形成熒光配合物的化合物可以舉出1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧代-9-占噸)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸、1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧-9-占噸)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸-五乙酰氧基甲基酯、1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸鹽、1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸五乙酰氧基甲基酯、1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸鹽、1-[2-氨基-5-(6-羧基-2-吲哚基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸鹽五乙酰氧基甲基酯、8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N′，N′-四乙酸鹽、8-氨基-2-[(2-氨基-5-甲基苯氧基)甲基]-6-甲氧基喹啉-N，N，N′，N′-四乙酸五乙酰氧基甲基酯、3，3′-雙[N，N-雙(羧甲基)氨基甲基]熒光素、8-[N，N-雙(羧甲基)氨基甲基]-4-甲基繖形酮等。
另外，與陰離子形成有色配合物的四苯鐘鹽、與氯離子形成配合物時熒光強度減少的溴化N-乙氧基羰基甲基-6-甲氧基喹啉鎓、與硼形成配合物的8-羥基-1-(亞水楊基氨基)-3，6-萘二磺酸鹽等均包括在內(nèi)。
上述利用形成配合物的反應(yīng)方法中，用吸收光度計或熒光光度計等測定由離子和配位體形成的色素和熒光物質(zhì)，通過測定色素和熒光物質(zhì)的量，來測定分析對象物質(zhì)(多數(shù)情況下是離子)。
(2)可用電化學(xué)方法檢測的物質(zhì)下面說明可用電化學(xué)方法檢測的物質(zhì)。
可用電化學(xué)方法檢測的物質(zhì)可以舉出電子傳遞物質(zhì)(介體)以及離子載體與離子的配合物等。
所謂離子載體，是通過酶等使分析對象物質(zhì)氧化/還原，同時從分析對象物質(zhì)直接接受電子或向分析對象物質(zhì)直接供給電子的化學(xué)物質(zhì)，用電極使電子傳遞物質(zhì)的還原體/氧化體進行氧化/還原，根據(jù)氧化/還原時的電化學(xué)應(yīng)答可以測定分析對象物質(zhì)。另外，電子傳遞物質(zhì)從分析對象物質(zhì)也可以不直接授/受電子，而是借助一種通過酶等能使分析對象物質(zhì)氧化/還原的化學(xué)物質(zhì)，反應(yīng)的同時電子傳遞物質(zhì)可間接從分析對象物質(zhì)接受電子或向分析對象物質(zhì)供給電子。用電極使與分析對象物質(zhì)還原/氧化的同時若電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體與之有定量關(guān)系時，根據(jù)此時的電化學(xué)應(yīng)答可測定分析對象物質(zhì)。
電子傳遞物質(zhì)，優(yōu)先選用在所使用的電極的可測定范圍內(nèi)的電位(碳電極一般是-1.2V至+1.0V)下可以氧化還原的物質(zhì)，具體地說可以舉出1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)二吡啶鎓鹽、1，1′-二芐基-4，4′-聯(lián)二吡啶鎓鹽、1，4-二氨基苯、2-甲基-1，4-萘醌、N-甲基吩嗪鎓鹽、1-羥基-5-甲基吩嗪鎓鹽、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓鹽、9-二甲氨基苯并α-吩噁嗪-7-鎓鹽、二茂鐵衍生物、六氰合鐵(II)鹽、7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物、3，7-二氨基-5-苯基-吩嗪鎓鹽、3-(二乙氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪鎓鹽、1，4-苯二醇、1，4-二羥基-2，3，5-三甲基苯、N，N，N′，N′-四甲基-1，4-苯二胺、Δ2，2′-雙-1，3-二硫酚、2，6-二甲基苯醌、2，5-二甲基苯醌、2，3，5，6-四甲基-2，5-環(huán)已二烯-1，4-二酮、2，6-二氯-4-[(4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)已二烯-1-酮、2，6-二氯-4-[(3-氯-4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)已二烯-1-酮、7-(二乙氨基)-3-亞氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪鹽、3，7-雙(二甲氨基)吩噁嗪-5-鎓鹽等。
在該例中，可檢測物質(zhì)是上述電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體，所述的生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)是電子傳遞物質(zhì)的氧化/還原反應(yīng)。如上所述，例如，在電極上使與分析對象物質(zhì)存在定量關(guān)系的電子傳遞物質(zhì)的氧化體/還原體發(fā)生還原/氧化，測定此時的氧化還原電流等電化學(xué)應(yīng)答，就可以測定分析對象物質(zhì)。例如電子傳遞物質(zhì)在電極上被氧化/還原時，抗壞血酸和過氧化氫，作為電子供給/接受物質(zhì)，測定此時的電化學(xué)應(yīng)答，根據(jù)該結(jié)果可以間接地測定分析對象物質(zhì)。
離子載體，是與作為分析對象物質(zhì)的特定的離子能選擇性地產(chǎn)生配位鍵或離子鍵、形成配合物的配位體等的化合物，離子載體在液膜電極中使用已經(jīng)廣為人知。
具體地說，與陽離子生成配合物的離子載體可以舉出四[3，5-雙(三氟甲基)苯基]硼酸鹽、四苯基磷鎓鹽、纈氨霉素、環(huán)(N′，N′-二辛基-D-天冬酰基-L-脯氨?；?L-丙氨酰)2、雙(苯并-15-冠-5)、雙[(苯并-15-冠-5)-4-甲基]庚二酸酯、雙(12-冠-4)、雙[(12-冠-4)甲基]-2-十二烷基-2-甲基丙二酸酯、14-冠-4、十二烷基-甲基-14-冠-4、6，6-二芐基-1，4，8，11-四氧雜環(huán)四癸烷、二苯并-18-冠-6、二環(huán)已基-18-冠-6、4，16-二-N-十八烷基氨基甲?；?3-氧雜丁酰-1，7，10，13，19-五氧雜-4，16-二氮雜環(huán)二十一烷等。
另外，與陰離子形成配合物的離子載體可以舉出四笨基鐘鹽、6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉鎓鹽等。
所述的液膜電極被用于測定分析物特定離子的方法，在電極表面上設(shè)有多孔質(zhì)的高分子層，高分子層中滲透離子載體，該離子載體只與試樣中特定的離子結(jié)合，在高分子層內(nèi)移動，選擇性分離該特定的離子，測定此時產(chǎn)生的膜電位，從而可以測定作為分析對象物質(zhì)的特定離子。當(dāng)然，在電化學(xué)檢測方法中使用離子載體并不限于上述液膜電極的例子。
在大量的液體中，離子載體與某種特定離子結(jié)合，未結(jié)合的離子不能移動，只有結(jié)合生成的配合物可以移動，在設(shè)置這樣的高分子層的電極中進行該離子的選擇性分離，測定此時產(chǎn)生的膜電位，可以測定作為分析對象物質(zhì)的該離子。
在該例中，所述的可檢測物質(zhì)是離子載體與特定離子的配合物，生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)是離子載體與特定離子以配位鍵或離子鍵形成配合物的反應(yīng)。如上所述，根據(jù)上述作為分析對象物質(zhì)的特定離子的濃度，通過電化學(xué)測定產(chǎn)生的膜電位，可以測定該分析對象物質(zhì)。
2.本發(fā)明適用的測定方法本發(fā)明的測定方法適用于借助生成這類可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)的方法，特別適用的方法可舉出如下(a)利用包含生成過氧化氫反應(yīng)，或以過氧化氫為氧化劑的氧化反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)的方法，具體地說，例如由分析對象物質(zhì)借助于氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)生成過氧化氫，及在過氧化物酶共存條件下使過氧化氫與被氧化性顯色體(色素前體)進行氧化還原反應(yīng)，測定該反應(yīng)生成的色素化合物。
(b)利用包含生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的反應(yīng)或使用NADH或NADPH作為還原劑的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)的方法，具體地說，例如由分析對象物質(zhì)借助于脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)生成NADH或NADPH，在電子傳遞物質(zhì)存在下使其對色素前體發(fā)生作用而還原，測定所生成的色素化合物。
(c)在酸性條件下使芳香族伯胺與亞硝酸反應(yīng)，生成重氮鹽，使生成的重氮鹽與待偶合試劑反應(yīng)，生成偶氮色素，然后測定生成的偶氮色素，從而測定亞硝酸鹽、重氮鹽、偶合化合物的方法。
(d)由具有磷酸酯的4-甲基繖形酮等熒光酶底物，利用堿性磷酸酯酶的作用使磷酸酯分離出，生成熒光物質(zhì)，對生成的熒光物質(zhì)以激發(fā)光照射，測定產(chǎn)生的熒光，從而測定用熒光酶底物標(biāo)記的物質(zhì)和堿性磷酸酯酶的方法。
(e)用氧化酶/還原酶等使1，4-二氨基苯等介體氧化/還原，測定生成的介體的氧化體/還原體在電極反應(yīng)中被還原/氧化時的電流應(yīng)答，從而測定氧化酶/還原酶及用氧化酶/還原酶標(biāo)記的物質(zhì)的方法。
當(dāng)然，可檢測物質(zhì)也可以是分析對象物質(zhì)本身，例如，測定溶解于水的葡萄糖在電極表面上被氧化時的電化學(xué)應(yīng)答，從而測定該分析對象物質(zhì)的情況就是如此。
本發(fā)明的第4種測定方法是利用在溶劑中生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)的方法，該方法包括生成對于溶劑不溶解的物質(zhì)的反應(yīng)。該方法非常適合用于生成不溶性可檢測物質(zhì)的測定方法。且該方法特別適合用于可檢測物質(zhì)是可以用光學(xué)方法測定的物質(zhì)的測定方法。
所述的溶劑沒有特別的限制，可以任意使用以往公知的溶劑，例如可以從蒸餾水等水、乙醇等醇類、丙酮等酮類、乙醚等醚類、乙酸乙酯等酯類、氯仿等鹵代烴類、苯或甲苯等芳香族烴類中選擇適合于分析對象物質(zhì)及其檢測反應(yīng)系統(tǒng)的溶劑。優(yōu)先選用水。另外，如眾所周知，在干式化學(xué)中可以使用含有分析對象物質(zhì)的血液、唾液、尿等試液作為反應(yīng)溶劑。
利用在進行反應(yīng)的反應(yīng)溶劑中生成不溶性物質(zhì)的反應(yīng)的測定方法，沒有特別的限制，例如可以舉出利用在反應(yīng)中生成可以光學(xué)檢測的不溶性物質(zhì)的反應(yīng)的測定方法；利用在進行反應(yīng)的溶劑中生成不溶性的副產(chǎn)物，并生成可以光學(xué)檢測的物質(zhì)的反應(yīng)的測定方法；利用在反應(yīng)溶劑中生成不溶性的副產(chǎn)物，并生成可以電化學(xué)檢測的物質(zhì)的反應(yīng)的測定方法。
利用在反應(yīng)溶劑中生成可以光學(xué)檢測的不溶性物質(zhì)的反應(yīng)的測定方法沒有特別的限制，具體地可以舉出下列檢測反應(yīng)。
有關(guān)氧化反應(yīng)可以舉出利用苯酚與4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮在水溶液中氧化縮合以檢測過氧化氫；使N-甲基-吖啶-9-羧酸鹽在水溶液中氧化、生成不溶于水的熒光物質(zhì)N-甲基吖啶酮以檢測過氧化氫；在鏈烷磺酸鹽存在下，使10-(羧基甲氨基羰基)-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪鹽水溶液氧化，使之顯色以檢測過氧化氫等反應(yīng)。
有關(guān)還原反應(yīng)可以舉出使7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物還原，生成不溶解于酸性水溶液的熒光物質(zhì)7-羥基-3H-吩噁嗪-3-酮，以檢測還原物質(zhì)；使3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯(lián)苯基)-雙[2-(對硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓]鹽、5-氰基-2，3-雙(4-甲基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2，3-(4-氰基苯基)-5-氰基-2H-四唑鎓鹽等還原、生成不溶解于水的甲色素以檢測還原物質(zhì)等反應(yīng)。
其它的反應(yīng)可以舉出在弱酸性水溶液中4-甲基繖形硫酸鹽與烯丙基硫酸酯酶反應(yīng)檢測烯丙基硫酸酯酶；2-氯-4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷與β-葡糖苷酶在水溶液中反應(yīng)檢測β-葡糖苷酶；利用偶氮苯對苯基肼磺酸與醛的縮合反應(yīng)檢測醛；重氮鹽與2-萘酚之間進行重氮偶合反應(yīng)檢測亞硝酸；利用1，3-二氨基-4-(5-溴-2-吡啶基偶氮)苯與鈷離子在中性水溶液中形成有色不溶性配合物檢測鈷離子等反應(yīng)。
利用生成可用光學(xué)方法檢測的物質(zhì)的反應(yīng)，其中包括生成不溶于反應(yīng)溶劑的副產(chǎn)物的反應(yīng)，或者利用生成可用電化學(xué)方法檢測的物質(zhì)的反應(yīng)，其中包括生成不溶于反應(yīng)溶劑的副產(chǎn)物的反應(yīng)，這些方法由于存在上述現(xiàn)有技術(shù)一節(jié)中所述有關(guān)問題，基本上都不能采用。因此，本文未舉出這類測定方法的具體例子，但本發(fā)明不受這些限制。
不溶性物質(zhì)一旦在其不溶解的溶劑中生成，就會立即從液相中析出，吸附在附近的固相上，這是經(jīng)?？梢杂^察到的現(xiàn)象。如果附近沒有固相，不溶性物質(zhì)在液相中就會形成分子集合體，分子集合體進一步長大，聚集或沉淀。本發(fā)明的層狀無機化合物是小到足以均勻分散的微小粒子，因為本發(fā)明中的不溶性可檢測物質(zhì)或副產(chǎn)物這類不溶性可檢測物質(zhì)，在剛剛生成后是單分子或非常小的分子集合體，因此該不溶性物質(zhì)可以有效地被吸附到層狀無機化合物上，與之一起均勻地分散。
本發(fā)明的第4種測定方法是，在生成不溶性物質(zhì)的檢測反應(yīng)系統(tǒng)中存在具有能吸附各種各樣物質(zhì)且能充分均勻分散的層狀無機化合物，從而吸附上述不溶性物質(zhì)，且解決現(xiàn)有技術(shù)一節(jié)中所述的因不溶性物質(zhì)產(chǎn)生的問題。另外，層狀無機化合物的存在不會妨礙檢測及檢測反應(yīng)的進行。在本發(fā)明的第4種測定方法中，包括生成不溶性物質(zhì)的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)可以優(yōu)選舉出四唑鎓鹽的還原反應(yīng)。
可以用本發(fā)明的第1-第4測定方法測定的分析對象物質(zhì)，可以舉出尿或血液等體液中的生物成分，食品、醫(yī)藥、自然環(huán)境中存在的微量物質(zhì)，工業(yè)化學(xué)物質(zhì)，以及廢棄物中的微量物質(zhì)等。
3.層狀無機化合物本發(fā)明的測定方法的特征是，在上述包括可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)中存在有層狀無機化合物。下面對層狀無機化合物加以說明。
本發(fā)明的層狀無機化合物是具有下述晶體結(jié)構(gòu)的無機化合物，即其晶體結(jié)構(gòu)例如為Si四面體、Al四面體等多面體的一組在同一平面排列而構(gòu)成層、片狀結(jié)構(gòu)的各層重疊在一起，例如層狀粘土礦物和水滑石。
所述的粘土礦物是指鋁硅酸鹽礦物，它占粘土的大半(細的土壤狀無機粒狀物，用水潤濕時具有可塑性)，通常其最小構(gòu)成單位是Si被4個O(氧原子)包圍的Si四面體，和Al或Mg被6個OH基或O包圍的Al(或Mg)八面體。
層狀粘土礦物的結(jié)構(gòu)是，Si四面體共享1個平面，保持在頂點的O向著同一方向，形成六角網(wǎng)狀的片(四面體片)，或者，Al(或Mg)八面體共享脊?fàn)罱?，形成?八面體片)，這些片重疊成層狀。一個四面體片與一個八面體片組成一層，即1∶1層，多個1∶1重疊形成的礦物稱為1∶1型礦物，由2片四面體片夾持一片八面體片組成一層，即2∶1層，多個2∶1層重疊形成的礦物稱為2∶1型礦物，在2∶1型的層間還插入一片八面體片形成的礦物稱為2∶1∶1型礦物。另外，八面體片是Mg(OH)2，在所有的八面體位上存在金屬離子的礦物稱為三八面體型(Trioctahedral)，八面體片是Al(OH)3，而1/3八面體位是空孔的礦物稱為二八面體型(Dioctahedral)。本發(fā)明中使用的層狀無機化合物優(yōu)先選用2∶1型礦物。
構(gòu)成本發(fā)明的層狀無機化合物的元素最好是選自鋰、鈉、鉀、鎂、鋁、硅、氧、氫、氟和碳中的至少一種，具體地說可以舉出用下面所示的1-9式表示的化合物。這些化學(xué)式所代表的化合物中也可以含有結(jié)晶水。當(dāng)然，這些化學(xué)式表示礦物學(xué)或化學(xué)意義上的純化合物，而實際的層狀無機化合物中有時會含有硅酸鈉等雜質(zhì)，因此通過元素分析等確定層狀無機化合物化學(xué)式時，有時未必與這些化學(xué)式一致，這一點例如文獻(D.W.Thompson，J.T.Butterworth，J.Colloid Interf.Sci.，151，236-243(1992))已有記載。
MxSi4(Al2-xMgx)O10X2...(1)(1式中，M是H、Li、Na、K中的任一種，X是OH、F中的任一種，x是＜2的正數(shù)。)Mx(Si4-xAlx)Al2O10X2...(2)(2式中，M是H、Li、Na、K中的任一種，X是OH、F中的任一種，x是＜4的正數(shù)。)MxSi4(Mg3-xLix)O10X2...(3)(3式中，M是H、Li、Na、K中的任一種，X是OH、F中的任一種，x是＜3的正數(shù)。)Mx(Si4-xAlx)Mg3O10X2...(4)(4式中，M是H、Li、Na、K中的任一種，X是OH、F中的任一種，x是＜4的正數(shù)。)MSi4Mg2.5O10X2...(5)(5式中，M是Li、Na中的任一種，最好是Na，X是OH、F中的任一種，最好是F。)M2Si4Mg2O10X2...(6)(6式中，M是Li、Na中的任一種，最好是Li，X是OH、F中的任一種，最好是F。)Mg6Al2(OH)16X2...(7)(7式中，X是鹵素、NO3、SO4、CO3、OH中的任一種或有機酸的陰離子，最好是CO3，在X是鹵素、OH、NO3或一價有機酸時，x是2，X是SO4、CO3、或二價有機酸時，x是1。)Na0.33Si4(Mg2.67Li0.33)O10X2...(8)(8式中，X是OH、F中的任一種，最好是OH。)Naa-b(Si4-aAla)(Mg3-bAlb)O10X2...(9)(9式中，X是OH、F中的任一種，最好是OH，a是＜4的正數(shù)，b是＜3的正數(shù)，并且a-b＞0。)本發(fā)明的層狀無機化合物的具體例子可以舉出高嶺石、多水高嶺土、蛇紋石等1∶1型粘土礦物；滑石、葉蠟石、綠土(smectite)、蛭石(上面的2式所表示的粘土礦物，以下相同)、包括氟四硅云母(5式)和鎳紋石(6式)在內(nèi)的云母等2∶1型粘土礦物；綠泥石等2∶1∶1型粘土礦物；2∶1-2∶1∶1型中間礦物；imogolite等準(zhǔn)晶質(zhì)粘土礦物；水鋁英石等非晶質(zhì)粘土礦物；水滑石(7式)等。
另外，在綠土中，根據(jù)同型置換的四面體和八面體晶格中的離子種類，可以分為蒙脫石(1式)、含有40-80％蒙脫石的天然物膨潤土、貝得石(2式)等二八面體型、鋰蒙脫石(3式，最好是8式)、皂石(4式)，最好是9式)、囊脫石等三八面體型。
水滑石是由上述7式、具體地說是由Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O表示的層狀礦物，是Mg(OH)2(水鎂石中心具有Mg2+的氧八面體層重疊的結(jié)構(gòu))中的Mg2+的一部分同型置換成Al3+的層狀礦物，它具有正電荷，由于層間的CO32-而保持電中性，且具有陰離子可交換性。雖然不是硅酸鹽礦物但常常被用來作為粘土礦物。
下面的表1中示出上述本發(fā)明的層狀無機化合物中的幾種的組成。
<表1>礦物名組成*高嶺石(Kaolinite) Si2Al2O5(OH)4多水高嶺土 Si2Al2O5(OH)4*2H2O蛇紋石 Si2(Mg2+，F(xiàn)e2+)3O5(OH)4滑石(Talc) Si4Mg3(OH)2O10葉蠟石(Pyrothyllite)Si4Al2(OH)2O10蒙脫石(montmorillonite) MIxSi4(Al2-xMgx)O10(OH)2·nH2O貝得石(Beidellite) MIx(Si4-xAlx)l2O10(OH)2·nH2O鋰蒙脫石(Hectorite) MIxSi4(Mg3-xLix)O10(OH·F)2·nH2O皂石(Saponite) MIx(Si4-xAlx)Mg3O10(OH)2·nH2O囊脫石(Nontronite) MIx(Si4-xAlx)Fe2O10(OH)2·nH2O蛭石(Vermiculite) MIx(Si4-xAlx)Al2O10(OH)2·nH2O水滑石(Hydrotalcite)Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O*MI是由單價陽離子表示的可交換陽離子本發(fā)明的層狀無機化合物的平均粒徑只要是足以進行均勻分散的較小粒徑即可，沒有特別的限制。由于層狀無機化合物一般是板狀的粒子，并且處于多個粒子時而凝聚、時而分開的動平衡狀態(tài)，要想定義平均粒徑比較困難，不容易明確地說明適宜的粒徑范圍，如果非要說出粒徑大小的話，那么，用光散射法或電子顯微鏡觀察等方法測定的值，在分散于水中的狀態(tài)下，以1nm以上、20μm以下為宜，優(yōu)選10nm或10nm以上、2μm或2μm以下。這些粒子具有離子可交換性，根據(jù)色素等的電荷或極性可以進行吸附，離子可交換性來源于構(gòu)成層的金屬離子置換所產(chǎn)生的層電荷。對于表1分子式所示的組成的原子團來說，層電荷的絕對值為0.2-1左右。
另外，在結(jié)構(gòu)中含有鐵等過渡金屬離子作為置換離子或含雜質(zhì)的層狀無機化合物，由于這些離子而產(chǎn)生顏色并顯示氧化還原特性，且產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)，致使透明性變差，因此最好是不被過渡金屬離子置換，但本發(fā)明不受這個限制。
在這些粘土礦物等層狀無機化合物中，還可以通過構(gòu)建季銨鹽等柱狀物，預(yù)先調(diào)整層間距離和層間的電荷或極性。
本發(fā)明的上述層狀無機化合物中，優(yōu)選2∶1型粘土礦物，特別是具有離子可交換性的膨潤性粘土礦物。
膨潤性粘土礦物中，優(yōu)選膨潤土、綠土、蛭石和合成氟云母，特別是合成鋰蒙脫石或合成皂石等合成綠土，或者以合成氟云母為代表的膨潤性合成云母(或Na型云母)等合成云母(天然的云母通常是非膨潤性的粘土礦物)。膨潤作用是由于具有離子交換性的陽離子或陰離子而產(chǎn)生的，因為可檢測物質(zhì)能很快由層間表面或被稱為“卡片罩”的粘土締合表面吸附，因此優(yōu)先選用膨潤性的層狀無機化合物。粘土礦物吸附陰離子性物質(zhì)、陽離子性物質(zhì)、非離子性的極性有機化合物，水滑石吸附陰離子性化合物。在H.Van Olphen著的《An Introduction to Clay ColloidChemistry，Second Edition》(Krieger Publishment，Malabar)的第11章“粘土和有機化合物的相互作用”中詳細敘述了可以吸附在層狀無機化合物上的化合物。在本發(fā)明中，這些化合物可以單獨使用，也可以2種以上并用。
本發(fā)明的上述層狀無機化合物，不限于使用合成物或天然物，但優(yōu)先擇用合成物。合成物與天然物不同，它是化學(xué)上均勻的，可以定量地處理吸附的可檢測物質(zhì)，因其層間不存在鐵等有色的金屬，因此透明度高，可以進行定量的、光學(xué)的操作和處理。這里所說的“合成”，至少對于綠土來說，主要是指用水熱合成法或熔融法制造的。天然物經(jīng)過精制后得到的膨潤性粘土礦物也可以使用。
這類層狀無機化合物有一些市場上有售，例如コ-プケミカル(株)制造的商品名ル-センタィトSWN或ル-センタィトSWF(合成鋰蒙脫石)或MF(氟云母)、クニミネ工業(yè)(株)制造的商品名スメクトンSA(合成皂石)、協(xié)和化學(xué)工業(yè)(株)制造的商品名チキソピ-W或商品名キョ-ワ-ド500(合成水滑石)、ラポ-公司制造的商品名ラポナィト(合成鋰蒙脫石)、(株)ナカヲィテスク社銷售的天然膨潤土、(株)豐順礦業(yè)公司制造的商品名マルチグル(膨潤土)等。
業(yè)已知悉，上述的層狀無機化合物可以吸附胺、多烯、各種色素等有機化合物。以往，被用來作為吸附油、色素等的水處理劑、制造葡萄酒或甜米酒等的蛋白去除劑、吸附、除去雜質(zhì)的脫色精制劑等。另外，這些層狀無機化合物能產(chǎn)生被稱為“因光異色”的現(xiàn)象，用來作為提供特定的反應(yīng)位點的材料，此外，最近人們還發(fā)現(xiàn)它可以提高天然色素的光穩(wěn)定性。
但是，在本發(fā)明的第1方法中發(fā)現(xiàn)，通過在該層狀無機化合物上吸附可檢測物質(zhì)，可以提高測定的靈敏度。因此，通過添加該層狀無機化合物，例如，在使用上述4-AA和氫供體的反應(yīng)系統(tǒng)中進行過氧化氫測定定量程度更高。將這樣的粘土礦物等層狀元機化合物用于物質(zhì)的測定以提高靈敏度的例子目前尚未見有報導(dǎo)。
另外，在本發(fā)明的第2方法中，可檢測物質(zhì)被吸附在該層狀無機化合物上，形成復(fù)合體，可檢測物質(zhì)在反應(yīng)系統(tǒng)中受到保護，與分解反應(yīng)有關(guān)的電子能級由于吸附而發(fā)生變化，因此在反應(yīng)系統(tǒng)中添加這些層狀無機化合物來試圖達到此種效果。結(jié)果，可檢測物質(zhì)被吸附到層狀無機化合物上，而且被吸附的可檢測物質(zhì)在過剩的過氧化氫和抗壞血酸等存在下可以保持十分穩(wěn)定。通過添加該層狀無機化合物，例如使用上述4-AA和氫供體的反應(yīng)系統(tǒng)中進行過氧化氫測定可以達更高的精度。這種在用于測定分析對象物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)中添加粘土礦物等層狀無機化合物，使生成的可檢測物質(zhì)保持穩(wěn)定，提高測定該分析對象物質(zhì)時的靈敏度和精度的例子，迄今為止還沒有見報導(dǎo)過。
另外，在本發(fā)明的第3方法中，為了分析目的可在該層狀無機化合物存在下進行生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)，雖其機理尚不十分清楚，但據(jù)認(rèn)為，使可檢測物質(zhì)的反應(yīng)前體吸附在該層狀無機化合物上，可以使之在層狀無機化合物表面上濃縮，從而可以提高可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)速度，提高測定速度。
另外，在本發(fā)明的第4方法中，通過使層狀無機化合物分散在包括可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)的溶劑中，即使生成不溶性物質(zhì)，也可以實現(xiàn)高靈敏度和高速度的檢測。象這樣使粘土礦物等層狀無機化合物分散在溶劑中、用于物質(zhì)的測定的例子尚未見到有報導(dǎo)。
更為出人意料的，即使在反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物，也不會妨礙檢測反應(yīng)，因此，添加該層狀無機化合物不會損害測定精度。
在本發(fā)明中，使層狀無機化合物存在于反應(yīng)系統(tǒng)中的方法取決于所使用的反應(yīng)系統(tǒng)，可以優(yōu)選選自分散液、溶膠、凝膠、淤漿、凝聚體、凝結(jié)體和燒結(jié)的多孔體中等任一種形態(tài)，將其分散存在于上述反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)介質(zhì)中。上述反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)介質(zhì)可以舉出生成可檢測物質(zhì)的反應(yīng)的反應(yīng)溶劑。另外，在本發(fā)明的第4方法中，可以舉出不溶解生成的反應(yīng)物質(zhì)的反應(yīng)溶劑。
使層狀無機化合物存在于反應(yīng)系統(tǒng)中的方法，優(yōu)選地可以舉出使層狀無機化合物分散于溶劑中，使之以分散液的形式添加到反應(yīng)系統(tǒng)中的方法。所述的溶劑沒有特別的限制，可以任意使用以往公知的溶劑，例如可以從蒸餾水等水、乙醇等醇類、丙酮等酮類、乙醚等醚類、乙酸乙酯等酯類、氯仿等鹵代烴類、苯或甲苯等芳香族烴類中選擇適合于分析對象物質(zhì)及其檢測反應(yīng)系統(tǒng)的溶劑。最好是使用下面所述的緩沖劑，將該層狀無機化合物分散于緩沖劑中，以緩沖溶液的形式添加進去。另外，也可以使用含有分析對象物質(zhì)的血液、唾液、尿等試液作為反應(yīng)溶劑，這在干式化學(xué)中已為人們所周知。
層狀無機化合物的添加量根據(jù)所使用的反應(yīng)系統(tǒng)來確定，此外還取決于所使用的層狀無機化合物本身，因此所加之量要達到能消除這樣的情況，即相對于可檢測物質(zhì)，吸附位點過少，不能充分吸附可檢測物質(zhì)，使可檢測物質(zhì)殘留在溶液中，反之吸附位點過多，吸附可檢測物質(zhì)時出現(xiàn)濃度偏差，就是說添加量要適中。
添加到反應(yīng)系統(tǒng)中的層狀無機化合物的適宜量按下面所述來確定。即，層狀無機化合物吸附色素之量主要與上述層電荷的程度相關(guān)，因此對于各種層狀無機化合物可以求出其相應(yīng)色素的吸附位點的總量。在檢測反應(yīng)中，如果試劑的濃度已經(jīng)確定，就可以大致算出生成的色素等的最大量值，從而在添加各種類型層狀無機化合物時，其量要使得可能形成色素的最大量也超不過該層狀無機化合物的總吸附位點。
至于層狀無機化合物的添加時間，沒有特別的限制，可以在可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)之前添加，也可以在生成反應(yīng)之后添加，優(yōu)先選擇在可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)之前預(yù)先添加到反應(yīng)系統(tǒng)中，使之分散于反應(yīng)系統(tǒng)中。
層狀無機化合物分散于反應(yīng)系統(tǒng)中的原因是，層狀無機化合物與參與可檢測物質(zhì)生成反應(yīng)的反應(yīng)起始物質(zhì)、反應(yīng)中間體或反應(yīng)生成物容易產(chǎn)生吸附等相互作用，另外還因為均勻分散、沒有濃度差的狀態(tài)適合于檢測。因此，這里所說的“分散”，可以是層狀無機化合物分散于溶液中的狀態(tài)，也可以是分散于溶膠、凝膠等狀態(tài)，只要是容易產(chǎn)生上述相互作用并適合于檢測的狀態(tài)就可以。
另外，在本發(fā)明的第4方法中，將層狀無機化合物均勻分散于反應(yīng)溶劑中，使之存在于反應(yīng)系統(tǒng)中，可以使不溶性的物質(zhì)吸附到層狀無機化合物上。
用于分散層狀無機化合物的分散介質(zhì)不一定要與進行反應(yīng)的反應(yīng)溶劑相同。層狀無機化合物可以是分散于以反應(yīng)溶劑作為分散介質(zhì)的分散液狀態(tài)，也可以是能滲透反應(yīng)溶劑的溶膠、凝膠、凝聚體、凝結(jié)體或燒結(jié)多孔體的狀態(tài)，只要能使層狀無機化合物均勻分散，對分散介質(zhì)沒有特別的限制。
能滲透反應(yīng)溶劑的溶膠、凝膠、凝聚體、凝結(jié)體或燒結(jié)多孔體狀態(tài)的層狀無機化合物，可以用來作為干式化學(xué)等試片中的兼作反應(yīng)部的檢測部，只要層狀無機化合物是可以均勻分散的形態(tài)，就可以將本發(fā)明的測定方法用于試片。
具有可交換性陽離子或可交換性陰離子的層狀無機化合物通過攪拌或超聲波處理等分散于水中時，只要濃度適當(dāng)，基本上都可以形成均一分散液。但是，由于添加電解質(zhì)、添加有機化合物、長時間靜置或溫度變化等，層狀無機化合物的粒子彼此凝聚或凝結(jié)，或形成凝膠或沉淀。這些凝聚一般由粒子彼此間較弱相互作用引起，經(jīng)過攪拌很容易重新分散。
關(guān)于層狀無機化合物的分散、凝聚和再分散，例如在下列文獻中有詳細描述H.Van Olphen著的《An Introduction to Clay ColloidChemistry，Second Edition》(Krieger Publishment，Malabar)的第三章“The Theory of Stability of Hydrophobic Sols.”、第四章“Successesof the Theory of Stability-Further Theories and Refinement”、第七章“E1ectryc Double-Layer Structure and Stability of ClaySuspensions”和第八章“Peptization of Clay Suspensions”等。
吸附的程度受緩沖劑的組成(pH、離子強度、形成配合物的成分等)的影響。例如，分散于純水中的綠土難以吸附食用色素青色一號(グリンァントブル-FCF)，而分散于pH6.5的雙-三緩沖液[由雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷和鹽酸制成]中的綠土則可以迅速吸附該色素。
本發(fā)明的方法中使用的緩沖劑和緩沖溶液的種類，除了上述的雙-三緩沖液外，例如還可以舉出磷酸緩沖溶液、檸檬酸緩沖溶液、N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸緩沖液等，但不限于這些，可以根據(jù)所使用的反應(yīng)系統(tǒng)適當(dāng)選擇。至于緩沖劑的pH和濃度等，也可以選擇與所用反應(yīng)系統(tǒng)相適應(yīng)的條件。
緩沖劑的添加時間沒有特別的限制，可以在添加層狀無機化合物之前，也可以在添加之后，最好作為含有分散于其中的層狀無機化合物的緩沖溶液的形式與層狀無機化合物一起添加到反應(yīng)系統(tǒng)中。
4.表面活性劑用本發(fā)明的方法測定時，還可以向反應(yīng)系統(tǒng)中添加各種表面活性劑。添加表面活性劑可以使含有難溶性物質(zhì)的試樣均勻分散，提高試樣的潤濕性，從而可使之均勻迅速地滲透到試片的試驗部分中。因為表面活性劑具有使吸附到界面上的物質(zhì)分散、溶解等作用，因此對生成的可檢測物質(zhì)由層狀無機化合物的吸附造成干擾，或者引起生成的可檢測物質(zhì)溶解，從而削弱本發(fā)明的效果。因此，在本發(fā)明中，與層狀無機化合物組合使用的表面活性劑應(yīng)選用不妨礙生成的可檢測物質(zhì)與層狀無機化合物吸附的表面活性劑。表面活性劑的用量與不妨礙上述吸附為限，少用為宜。當(dāng)然，為了調(diào)整色素等可檢測物質(zhì)與層狀無機化合物的吸附強度，可以使用各種公知的與反應(yīng)系統(tǒng)相適應(yīng)的表面活性劑，其量可加以控制。
不妨礙吸附的表面活性劑的種類是分子量比生成的色素不大很多的表面活性劑，并且所述表面活性劑的有機性值和無機性值應(yīng)滿足下面的公式(無機性值)＝(2.37±0.23)×(有機性值)-186.2±117.1上述公式是通過研究已知結(jié)構(gòu)的各種表面活性劑的阻礙吸附作用與有機性值和無機性值的關(guān)系后得出的。即，給各種官能基或原子指定點數(shù)，例如1個碳原子指定的有機性值為20，而羥基的無機性值為100，聚環(huán)氧乙烷的有機性值為30，其無機性值為60，硝基的有機性值為70，其無機性值為70等，對構(gòu)成化合物的官能基和原子來說，將這些點數(shù)相加，求無機性值的總和和有機性值的總和，將無機性值和有機性值標(biāo)繪在直角坐標(biāo)系中，具有類似性質(zhì)的化合物位于直角坐標(biāo)系的同一區(qū)域，表現(xiàn)出與化合物的結(jié)構(gòu)無關(guān)的共同的性質(zhì)，這種有機概念圖已為人們所公知(甲田善生《有機概念圖一基礎(chǔ)與應(yīng)用》第11頁、三共出版(1984))。本發(fā)明人研究了具有已知結(jié)構(gòu)的許多表面活性劑阻礙吸附作用與無機性值和有機性值的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不妨礙吸附的表面活性劑在有機概念圖中滿足上述關(guān)系式。雖然有關(guān)上述書中的有機概念圖的計算數(shù)據(jù)可用于無機性值和有機性值的計算，但上述數(shù)學(xué)式是使用本間善夫制作的程序“個人計算機有機概念圖”(日本化學(xué)軟件學(xué)會等)提供的換算數(shù)據(jù)得到的。
不妨礙吸附的表面活性劑的種類和添加量的選擇，例如可以按下面①-④中所述進行。
①向含有一定量的綠土、4-AA和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺的反應(yīng)液中添加過氧化氫，使之顯色。
②向與①相同組成的反應(yīng)液中按一定的濃度添加表面活性劑，同樣添加過氧化氫，使之顯色。
③用自然沉降、離心分離、過濾等方法分離出綠土，用分光光度計測定上清液或濾液的色調(diào)，比較①、②各自的綠土上生成色素的吸附量?；蛘撸?dāng)觀察到吸附引起的絮凝的情況下，以絮凝或沉降的程度來進行評價。
④選擇不添加表面活性劑時和添加表面活性劑時幾乎看不到差別的情況下所用表面活性劑種類和添加量。
在該方法中可以選用的適宜的表面活性劑的種類可以舉出正辛基-β-D-吡喃葡糖苷等糖烷基醚類，正辛基-β-D-硫吡喃葡糖苷、正庚基-β-D-硫吡喃葡糖苷等糖烷基硫醚類，正辛?；?N-甲基葡糖酰胺、正壬?；?N-甲基葡糖酰胺等糖酰胺類，β-D-吡喃果糖基-α-D-吡喃葡糖苷一癸酸酯等糖酯，N，N-雙-(3-D-葡糖酰氨丙基)脫氧膽酰胺等。
另外，表面活性劑添加量沒有特別的限制，相對于層狀無機化合物總量的添加比例也沒有特別的限制，只要選擇與表面活性劑的種類和層狀無機化合物的種類及反應(yīng)系統(tǒng)相適應(yīng)的量即可，最好是選擇能充分發(fā)揮表面活性劑效果的量，例如不太多超過水系溶劑中使用的表面活性劑的臨界膠束濃度的程度。例如，可以選用正辛基-β-D-硫吡喃葡糖苷的0.3％水溶液、β-D-吡喃果糖基-α-D-吡喃葡糖苷一癸酸酯的0.3％水溶液、N，N-雙(3-D-葡糖酰氨丙基)脫氧膽酰胺的0.3％水溶液。
特別是在用本發(fā)明的第1-第3方法測定時，最好要使用表面活性劑。
5.具體的測定方法本發(fā)明測定方法的優(yōu)選實施方案是，預(yù)先向反應(yīng)系統(tǒng)中添加層狀無機化合物，使之分散。在分散液中有時會產(chǎn)生半透明的膠體狀凝聚物，但本發(fā)明中也不一定產(chǎn)生凝聚。這種凝聚可以認(rèn)為是層狀無機化合物與吸附于其上的可檢測物質(zhì)復(fù)合體。通過攪拌可使該凝聚重新均勻地分散。另外，在凝聚帶來不利時，只要使用磷酸鹽系緩沖溶液，就可以提高層狀無機化合物的分散性，抑制凝聚的發(fā)生。
另外，也可以使最終用于檢測的可檢測物質(zhì)吸附在層狀無機化合物上，而使之沉降，將可檢測物質(zhì)從反應(yīng)系統(tǒng)中分離、濃縮，進一步提高測定靈敏度。吸附可檢測物質(zhì)的層狀無機化合物的分離方法沒有特別的限制，例如可以舉出沉降、離心分離、過濾、色譜、電泳、溶劑蒸發(fā)等。舉例來說，本發(fā)明中例舉的層狀無機化合物的分散液的過濾，可以使用排除界限分子量約1萬或孔度約5nm的聚砜制的超濾膜進行。
在本發(fā)明中，測定被層狀無機化合物吸附的可檢測物質(zhì)。其測定方法可以舉出吸光測定方法、熒光測定、發(fā)光測定、電化學(xué)測定方法、光散射測定方法、反射率測定方法等。優(yōu)選的方法可以舉出以使用吸收光度計進行光吸收分析為代表的比色定量等光學(xué)的測定方法。由于本發(fā)明中使用的層狀無機化合物在可見光～紅外光區(qū)域基本上都不能吸收，因此，即使是膠體狀的分散液或凝膠狀，也可以進行測定。另外，直接在分散液的狀態(tài)下測定時，系統(tǒng)可以選用乳白玻璃等手段。如下文中所述，可以使用層狀無機化合物制成能浸滲反應(yīng)溶劑的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，以該部分作為兼作反應(yīng)部的檢測部制成試片，用該試片進行反射率測定、吸光測定、熒光測定等。另外，還可以使用利用電極測定氧化還原電流或膜電位的電化學(xué)測定方法。使吸附可檢測物質(zhì)的層狀無機化合物與電極接觸，可以高靈敏度地測定電化學(xué)應(yīng)答。
II.本發(fā)明的試片本發(fā)明的試片是，用于通過測定試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)后生成的可檢測物質(zhì)，來測定上述分析對象物質(zhì)的分析用試片，配備有至少1個試驗部分，該試驗部分具有用于檢測上述可檢測物質(zhì)的檢測部。
試驗部分是試片內(nèi)承擔(dān)試樣的吸收、擴散、反應(yīng)、檢測等一系列分析過程的部分，其結(jié)構(gòu)沒有特別的限制。除上述可以通過反射率或透射/吸收、熒光等檢測可檢測物質(zhì)的檢測部外，配備有下列部分用于吸入試樣并導(dǎo)入試驗部分、設(shè)置在試驗部分的末端或末端附近的試樣吸入部；用于使試樣均勻滲透、擴散到試驗部分內(nèi)的擴散、滲透部；含有能與試樣中所含的分析對象物質(zhì)反應(yīng)的試劑的試劑部；進行檢測反應(yīng)的反應(yīng)部；通過與色譜類似的作用分離試樣中的成分或檢測反應(yīng)生成的色素等的展開部；利用試樣移動的時間控制反應(yīng)進行的時間控制部；利用吸附作用收集或者除去試樣中的成分或生成的色素等的保持部；用于吸收過剩的試液、添加的洗凈液和展開液等，防止逆流的，與檢測部相對，設(shè)置在與試樣吸入部相反一側(cè)，試驗部分的末端或末端附近的吸收部等。
擔(dān)負(fù)這些試驗部分功能的各部可以彼此在功能上疊合，例如，檢測部可以兼作試劑部和反應(yīng)部，檢測部可以兼作保持部等，即一個部可以兼有幾種作用。
本發(fā)明試片的優(yōu)選實施方案例如可以舉出，配備有至少1個多層試驗部分，該試驗部分由含有能檢測可檢測物質(zhì)的檢測層(作為檢測部)的二層或多個層構(gòu)成的試片。作為檢測層以外的層，可以設(shè)置用于吸入試樣并導(dǎo)入試驗部分中的試樣吸入層；使試樣均勻滲透、擴散到試驗部分中的擴散層；含有與試樣中所含有分析對象物質(zhì)反應(yīng)的試劑的試劑層；進行檢測反應(yīng)的反應(yīng)層；設(shè)置在反應(yīng)層與檢測層之間、具有除去干擾成分功能的展開層或保持層；用于吸收過剩的試樣、添加的洗凈液和展開液、防止逆流的吸收層；用于將試驗部分固定在支承體上的粘結(jié)層等。特別優(yōu)選的方案是，除了上述檢測層外，還含有用于擴散試樣的擴散層，以使試樣通過該擴散層擴散到達上述檢測層。本發(fā)明的試片可以是具有1個這樣的試驗部分的試片，也可以是具有2個或多個試驗部分的多項目試片。多項目試片一次可以分析多個試樣，另外，對于各項目使用不同的試劑，即使是含有2種以上分析對象物質(zhì)的試樣，也可以同時分析其中的各種分析對象物質(zhì)。
另一種優(yōu)選實施方案，例如可以舉出具有至少1個試驗部分的試片，所述試驗部分具有用于檢測上述可檢測物質(zhì)的檢測區(qū)域作為檢測部。該試片上，上述檢測區(qū)域以外的區(qū)域可以是下列區(qū)域用于吸入試樣并導(dǎo)入試驗部分的試樣吸入?yún)^(qū)域；用于使試樣均勻滲透、擴散到試驗部分內(nèi)的擴散區(qū)域；含有與試樣中所含的分析對象物質(zhì)反應(yīng)的試劑的試劑區(qū)域；進行檢測反應(yīng)的反應(yīng)區(qū)域；通過吸附或分配等與色譜類似的作用分離試樣中的成分或由檢測反應(yīng)生成的色素等的展開區(qū)域；利用試樣移動的時間控制反應(yīng)進行的時間控制區(qū)域；利用吸附作用收集或者除去試樣中的成分或生成的色素等的保持區(qū)域；用于吸收過剩的試液、添加的洗凈液和展開液，防止逆流的吸收區(qū)域等。特別優(yōu)選的實施方案是，除上述檢測區(qū)域外，還含有用于擴散試樣的擴散區(qū)域，使滴在試片末端的試樣通過該擴散區(qū)域，借助于毛細管滲透作用在試片上平面移動到達上述檢測區(qū)域。在這種場合，上述檢測區(qū)域也可以具有含有用于檢測可檢測物質(zhì)的檢測層的、由二層或多層構(gòu)成的上述多層結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明的試片可以是具有1個由這樣的檢測區(qū)域和試劑區(qū)域組成的一個試驗部分的試片，也可以是具有2個或多個上述試驗部分的多項目試片，該多項目試片一次可以分析多個試樣，另外，對于各項目使用不同的試劑，即使是含有2種或多種分析對象物質(zhì)的試樣，也可以同時分析其中的各種分析對象物質(zhì)。
在本發(fā)明中，用于試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)的反應(yīng)部也可以與上述檢測部分開設(shè)置，可檢測物質(zhì)在上述反應(yīng)部中生成后，被導(dǎo)入上述檢測部進行檢測。在這種場合，上述檢測部最好是設(shè)置在試樣擴散后通過上述反應(yīng)部到達的位置。具體地說，最好是從多層型試驗部分的表面滲透過來的試樣通過擴散層擴散，移動到作為中間層的反應(yīng)層中，再通過反應(yīng)層后到達的位置設(shè)置檢測層。另外，最好是在試片上設(shè)置檢測區(qū)域、反應(yīng)區(qū)域和擴散區(qū)域，試樣平面移動，通過擴散區(qū)滲透，移動到反應(yīng)區(qū)域，并在通過上述反應(yīng)區(qū)域后到達的區(qū)域處設(shè)置檢測區(qū)域。
此外，在本發(fā)明中，上述檢測部也可以同時兼作用于試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)的反應(yīng)部，在上述檢測部中通過試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑的反應(yīng)生成上述可檢測物質(zhì)。
本發(fā)明的檢測部，是實際檢測通過分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)生成的色素等可檢測物質(zhì)的部分，如上所述，有時也兼作進行上述反應(yīng)的反應(yīng)部和含有試劑的試劑部等，在這種場合，通常檢測部中預(yù)先含有試劑。另一方面，在本發(fā)明中，試片也可以具有與上述反應(yīng)部和試劑部獨立的檢測部，在這種場合，試驗部分中不一定一開始就含有試劑，可以采取在添加試樣之前和/或添加之后再加入試劑。另外，也可以采取添加分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)生成的色素等可檢測物質(zhì)的溶液的形式。
本發(fā)明的試片通常由這樣的試驗部分和支承試驗部分的片狀、管狀、棒狀的支承部分構(gòu)成，根據(jù)需要還可以附帶電極等傳感器以及試液吸入裝置等。
本發(fā)明特別適合于利用下面所述的能生成色素等可檢測物質(zhì)的試劑和反應(yīng)系統(tǒng)的試片。
作為試劑，與本發(fā)明的測定方法一節(jié)中所述的一樣，只要是其反應(yīng)生成的色素等可檢測物質(zhì)與本發(fā)明的層狀無機化合物能產(chǎn)生吸附作用、形成復(fù)合體即可，沒有特別的限制。
生成吸附在層狀無機化合物上的可檢測物質(zhì)的試劑，可以在下列化合物中選取，即通過氧化還原反應(yīng)、酸堿反應(yīng)、縮合反應(yīng)、配合物形成反應(yīng)等生成色素、熒光色素等可以光學(xué)檢測的物質(zhì)的色素前體等化合物，以及生成可以電化學(xué)檢測的介體(電子傳遞物質(zhì))的氧化體/還原體或配合物的化合物等。
試樣、試劑或反應(yīng)物大多是以水作為溶劑的溶液，上述可檢測物質(zhì)只要是水溶性的，就可以很容易擴散、洗脫，因此，若可檢測物質(zhì)是水溶性的，可以充分發(fā)揮本發(fā)明的效果。所以，所使用的試劑最好是能生成水溶性可檢測化合物的試劑，實際上這樣的試劑被大量地使用。但本發(fā)明不限于此。試樣、試劑或反應(yīng)物也可以是水以外的溶劑形成的溶液，在這種場合，所用的試劑也可以是能生成被該溶劑擴散、洗脫的可檢測物質(zhì)的試劑。當(dāng)然，生成在試樣溶劑中不溶性的可檢測物質(zhì)的試劑，或反應(yīng)產(chǎn)物也可用。
作為試劑，只要是生成本發(fā)明測定方法一節(jié)中例示的可檢測物質(zhì)的試劑均可使用，例如色素前體可以使用具有芳香環(huán)等共軛系的化合物，具體地可以舉出如下以4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮為代表的成色劑和氫供體(N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺等)色素前體試劑類(氧化縮合后產(chǎn)生醌系色素)；鄰聯(lián)甲苯胺、聯(lián)苯胺類(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺)等氧化生成顯色色素的色素前體；2，6-二氯-4-[(4-羥苯基)亞氨基]-2，5-環(huán)已二烯-1-酮等色素的無色體(氧化后顯色)；4-羥苯基乙酸等氧化后生成熒光物質(zhì)的化合物；化學(xué)發(fā)光物質(zhì)之類的發(fā)光物質(zhì)；四唑鎓鹽(還原后生成甲)和1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶鎓鹽等還原后生成色素的試劑類；溴甲酚綠等隨著pH改變而顯色或變色的化合物；2-甲氧基-4-嗎啉代苯重氮鹽等重氮鹽(偶聯(lián)后生成偶氮系色素)、2，3-二甲基-2，3-雙(羥基氨基)丁烷(與醛反應(yīng)后顯色)等各種公知的顯色反應(yīng)用試劑；鄰苯二甲醛(與組胺反應(yīng)后生成熒光物質(zhì))等各種公知反應(yīng)用試劑；4-甲基繖形磷酸鹽等酶底物；2-(5-溴-2-吡啶基偶氮基)-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯胺鹽等形成配合物而顯色或變色的化合物；以及可生成上述可檢測物質(zhì)的化合物。
生成這類可檢測物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)可以舉出本發(fā)明的測定方法一節(jié)中闡述的反應(yīng)系統(tǒng)，具體地可以舉例如下(a)包含過氧化氫生成反應(yīng)或以過氧化氫為氧化劑的氧化反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)。
(b)包含生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的反應(yīng)，或者以NADH或NADPH作為還原劑的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)。
(c)利用在酸性條件下使亞硝酸與芳香族伯胺反應(yīng)生成重氮鹽的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)。
(d)包含具有磷酸酯的4-甲基繖形酮等熒光酶底物通過堿性磷酸酯酶的作用使磷酸酯游離、生成熒光物質(zhì)的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)。
(e)包括利用氧化還原酶等使1，4-二氨基苯等介體氧化/還原、生成介體的氧化體/還原體的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)。
利用這些反應(yīng)系統(tǒng)的分析方法可以舉出ELISA等免疫測定法、免疫色譜法、尿檢查、血液生化檢查、比色法等。使用這些分析方法的試片的具體例子在下列文獻中有詳細描述H.G.Curme，et al.，ClinicalChemistry，24(8)，1335-1342(1978)、B.Walter，Analytical Chemistry，55(4)，498A(1983)、近藤朝士“分析化學(xué)”1984(7)，534、近藤朝士“分析化學(xué)”1986(6)，387、分析化學(xué)手冊第8頁(日本分析化學(xué)會改訂4版、丸善(1991))、特開平6-213886(北島昌夫等)、M.P.Allen，等人.，Clinical Chemistry，36(9)，1591-1597(1990)、D.Noble，AnalyticalChemistry，65(23)，1037A(1993)、R.F.Zuk，等人，Clinical Chemistry，31(7)，1144-1150(1985)等。可以用這些方法分析的分析對象物質(zhì)，可以舉出尿或血液等體液中的生物成分，食品、醫(yī)藥、自然環(huán)境中存在的微量物質(zhì)，工業(yè)化學(xué)物質(zhì)，廢棄物中的微量物質(zhì)等，本發(fā)明的試片可以用于這些分析。
可以使用本發(fā)明試片的試樣，可以是含有1種分析對象物質(zhì)的試樣，也可以是含有二種或多種分析對象物質(zhì)的試樣。
在本發(fā)明試片的試驗部分中，可以根據(jù)需要含有分析試片中通常使用的公知化合物，例如親水性聚合物等。
在本發(fā)明中，在試片的試驗部分中、特別是其中生成色素的部分即檢測部中必須含有層狀無機化合物。
即，在構(gòu)成上述試驗部分的至少1個檢測層或檢測區(qū)域中必須含有層狀無機化合物。具體地說，在由包括檢測層在內(nèi)的二層或多層層狀構(gòu)成的多層型試驗部分中，至少在上述檢測層中必須含有層狀無機化合物。在這種場合，上述檢測層以外的層中也可以含有層狀無機化合物，例如試樣吸入層、擴散層、試劑層、反應(yīng)層、粘結(jié)層、保持層、展開層、吸收層等也可以含有層狀無機化合物。
另外，在上述試驗部分具有檢測區(qū)域的場合，至少在上述檢測區(qū)域中含有層狀無機化合物。上述檢測區(qū)域以外的區(qū)域中也可以含有層狀無機化合物，例如試樣吸入?yún)^(qū)域、擴散區(qū)域、試劑區(qū)域、反應(yīng)區(qū)域、展開區(qū)域、時間控制區(qū)域、保持區(qū)域、吸收區(qū)域等也可以含有層狀無機化合物。在這種場合，檢測區(qū)域可以是多層結(jié)構(gòu)，構(gòu)成檢測區(qū)域的層中至少在檢測層中含有層狀無機化合物。另外，在其它層中也可以含有層狀無機化合物。
在試驗部分中除了上述檢測部外還具有用于試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)的反應(yīng)部的情況下，優(yōu)選在試樣擴散通過上述反應(yīng)部后到達的位置處設(shè)置檢測部，這樣在反應(yīng)部中生成的可檢測物質(zhì)移動到含有層狀無機化合物的檢測部中而被檢測出來。
本發(fā)明的試片中使用的層狀無機化合物，可以使用上述本發(fā)明的測定方法一節(jié)中例示的層狀無機化合物。與本發(fā)明的測定方法所述相同，這些層狀無機化合物中優(yōu)選2∶1型粘土礦物，特別是具有離子可交換性的膨潤性粘土礦物。在膨潤性粘土礦物中，優(yōu)先選用膨潤土、綠土、蛭石或以合成氟云母為代表的膨潤性合成云母(或Na型云母)等合成云母(天然云母通常是非膨潤性粘土礦物)，特別優(yōu)選的是合成鋰蒙脫石或合成皂石等合成綠土或合成氟云母。它們可以單獨使用，也可以二種或多種并用。象本發(fā)明這樣利用層狀無機化合物抑制色素等擴散、洗脫，使其含在試片中的作法以往還沒有人嘗試過。
另外，出人意料的是，即使在檢測部等試驗部分中添加上述無機化合物，也不會妨礙檢測反應(yīng)。因此，通過添加該層狀無機化合物，不必?fù)?dān)心洗脫出，所以可以更準(zhǔn)確、簡便地使用4-AA和氫供體的反應(yīng)系統(tǒng)進行檢測。
試驗部分中含有層狀無機化合物的部分最好是多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，對于材質(zhì)沒有特別的限制，但最好主要由層狀無機化合物構(gòu)成，或者由層狀無機化合物和選自親水性聚合物、濾膜、濾紙或布、玻璃濾片等纖維集合體、纖維素或硅藻土等有機化合物或無機化合物的微粉末中的至少一種多孔質(zhì)材料構(gòu)成。
由層狀無機化合物形成的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，可以舉出層狀無機化合物的溶膠、凝膠、凝聚體、凝結(jié)體或它們經(jīng)干燥或燒結(jié)形成的多孔體。在多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體中可以添加下面將要介紹的緩沖劑。例如，在支承體上滴一滴層狀無機化合物的1％分散液，澆注后冷凍干燥，可以得到吸水性好的多孔質(zhì)層。
支承體可以是片狀，也可以是管狀或棒狀，其材質(zhì)沒有特別的限制，可以是濾紙、無紡布、布、玻璃濾片等纖維集合體；玻璃珠、聚合物珠、二氧化鈦等粒狀物質(zhì)；纖維素、硅藻土、可溶性鹽類或疏水化多糖類等的粉末、粒狀物質(zhì)或微粉末；濾膜；聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚乙烯等塑料板等有機高分子。特別優(yōu)選由親水性聚合物構(gòu)成的凝膠、表面經(jīng)過親水化處理的濾膜或塑料板。
親水性聚合物可以舉出聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷等聚環(huán)氧烷；羧甲基纖維素、羥乙基纖維素等纖維素衍生物；明膠及其衍生物(例如鄰苯二甲酰化明膠等)；其它多糖類及其衍生物(瓊脂糖、角叉膠、芰苷、殼聚糖等)；聚乙烯醇；聚乙烯吡咯烷酮；聚甲基丙烯酸鹽類(聚甲基丙烯酸鈉等以及它們與馬來酸的共聚物等)；聚丙烯酰胺；聚甲基丙烯酸類(聚甲基丙烯酸羥乙基酯等)；甲基丙烯酰胺；聚砜；聚酰亞胺；聚苯乙烯；聚碳酸酯；聚醚醚酮；聚甲醛；褐藻酸鈉；經(jīng)過親水處理(例如照射紫外線或進行硅烷醇處理使之親水化)的聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯等聚烯烴系樹脂等含這些化學(xué)結(jié)構(gòu)的聚合物、共聚物、締合物等。
另外，上述親水性聚合物最好是利用交聯(lián)劑進行接枝聚合的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、或通過疏水親和性締合作用而不溶于水的聚合物。
這樣的親水性聚合物的具體例子可以舉出由戊二醛交聯(lián)的聚賴氨酸、聚環(huán)氧乙烷交聯(lián)生成物、聚丙烯酰胺接枝聚合物、聚丙烯酸酯接枝聚合物、淀粉-丙烯酸酯接枝聚合物等。
另外，試驗部分中可以同時含有選自親水性聚合物、濾膜、纖維集合體及有機化合物或無機化合物的微粉末中的至少一種多孔質(zhì)形成材料和層狀無機化合物，形成上述多孔制結(jié)構(gòu)體。形成這類多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體的方法可以舉出預(yù)先制備多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體形成材料與層狀無機化合物的混合液，將其澆注或浸滲到上述支承體中，或者預(yù)先用多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體形成材料制成多孔質(zhì)膜等多孔質(zhì)支承體，將層狀無機化合物的分散液或上述混合液澆注或浸滲到該多孔質(zhì)支承體中等。
為制造多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體時混合層狀無機化合物，例如可以采用與親水性聚合物或微粉末等一起混煉，同時制膜。另外，也可以將層狀無機化合物溶解或分散于下面所述的緩沖劑中，將所得緩沖溶液干燥，把該干燥物混合到原料中。
另外，在將層狀無機化合物的分散液或混合液浸滲到多孔質(zhì)支承體中的方法中，使用的溶劑種類沒有特別的限制，可以任意使用以往公知的溶劑，例如可以從蒸餾水等水、乙醇等醇類、丙酮等酮類、乙醚等醚類、乙酸乙酯等酯類、氯仿等鹵代烴類、苯或甲苯等芳香族烴類等中選擇與所用的檢測反應(yīng)系統(tǒng)相適應(yīng)的溶劑。最好是使用下面所述層狀無機化合物溶解或分散于緩沖劑中形成的緩沖液浸滲支持體。溶液或分散液的濃度可以根據(jù)反應(yīng)系統(tǒng)適當(dāng)選擇，沒有特別的限制。
下面舉例說明含有層狀無機化合物的層或區(qū)域的制造方法。
制造含有層狀無機化合物的層或區(qū)域時，可以使用將上述層狀無機化合物的溶膠、凝膠、凝聚體、凝結(jié)體干燥或燒結(jié)形成的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體。例如，在塑料板上澆注一滴層狀無機化合物的1％分散液，然后冷凍干燥，可以得到吸收性好的多孔質(zhì)層。
另外，還可以使用選自上述親水性聚合物、濾膜、纖維集合體及有機或無機微粉末中的至少一種多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體形成材料進行制造。
親水性聚合物優(yōu)先選用明膠、聚丙烯酸或其衍生物、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、多糖類或其衍生物、多肽、多胺或其衍生物等。親水性聚合物可以以凝膠或凝膠的干燥體的形式使用。
另外，親水性聚合物也可以是通過添加戊二醛等已知的交聯(lián)劑調(diào)節(jié)交聯(lián)度的凝膠。它們可以單獨使用，也可以組合使用。
為了獲得上述材料與層狀無機化合物復(fù)合而成的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，可以使用在使試驗部分中含有層狀無機化合物的方法一節(jié)中已經(jīng)描述的各種方法。例如，在濾紙中浸滲分散于緩沖溶液中的層狀無機化合物的1％的分散液，經(jīng)熱風(fēng)干燥后可以得到多孔質(zhì)的區(qū)域。另外，將該濾紙的小片粘貼在塑料板上，也可以得到多孔質(zhì)層。
舉例來說，可以采用下述操作程序。在層狀無機化合物的3％的分散液中，混合進同等量預(yù)定濃度的聚丙烯酰胺水溶液，其中聚丙烯酰胺與層狀無機化合物之重量比為1∶1至4∶1，持續(xù)攪拌幾小時。必要時添加碳酸鈉或醋酸等的稀水溶液，將混合液的pH調(diào)整至5-9。另外，根據(jù)需要使混合液成為堿性，添加N，N-亞甲基雙丙烯酰胺達到2％，照射電子束，引起交聯(lián)反應(yīng)。將所得混合液涂布在塑料板上，干燥后即可得到多孔質(zhì)膜。
這樣制成的含有層狀無機化合物的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，具有良好的吸水性，可用于作為試片的試驗部分。當(dāng)然，試驗部分的制作不限于上述例子。例如可以采用各種公知試片的試驗部分的制造例。這樣的試片，在下列文獻中有明確記載H.G.Curme等人，Clinical Chemistry，24(8)，1335-1342(1978)、B.Walter，Analytical Chemistry，55(4)，498A(1983)、近藤朝士“化學(xué)分析”1984(7)，534、R.F.Zuk等人，Clinical Chemistry，31(7)，1144-1150(1985)、近藤朝士“化學(xué)分析”1986(6)，387、特開平2-654 1(K.Hildenbrand)、M.P.Allen等人，Clinical Chemistry，36(9)，1591-1597(1990)、特開平3-163361(E.J.Kiser等人)、分析化學(xué)便覽第8頁(日本分析化學(xué)會編改定4版、丸善(1991))、D.Noble，AnalyticalChemistry，65(23)，1037A(1993)、特開平5-157745(真鍋秀彥等人)、特開平6-213886(北島昌夫等人)、特開平6-222061(H.Brandt等人)等。
層狀無機化合物的分散液的濃度、與親水性聚合物的混合比以及要調(diào)整的pH值，可以根據(jù)層狀無機化合物的種類、要吸附的色素種類、所用親水性聚合物的種類和數(shù)量、緩沖劑的種類和數(shù)量、混合液的粘度等作為參數(shù)選擇適宜的條件，以得到所需要的多孔性程度、多孔質(zhì)層的膜厚、試驗部分的機構(gòu)強度等。
在按上述制成的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體中，添加與試液中的分析對象物質(zhì)反應(yīng)、生成可檢測物質(zhì)的試劑，可以將該多孔制結(jié)構(gòu)體用來作為試片的試驗部分。
層狀無機化合物的添加量根據(jù)所采用的反應(yīng)系統(tǒng)確定，根據(jù)所使用的層狀無機化合物，所加量要能夠消除下述弊病相對于生成物質(zhì)來說吸附位點過少，生成物質(zhì)不能完全吸附，殘留在溶液中，或者吸附位點過多，使生成物質(zhì)吸附時濃度產(chǎn)生差異，因此添加量應(yīng)當(dāng)適中。為添加到反應(yīng)系統(tǒng)中層狀無機化合物的量適宜，可以對各種層狀無機化合物求出相對于色素的總吸附位點數(shù)，添加層狀無機化合物時應(yīng)考慮生成的色素最大量不超過層狀無機化合物的總吸附位點。
如上所述，因為吸附的程度受緩沖劑的組成(pH、離子強度、形成配合物成分等)影響，因此，通過改變緩沖劑的組成、濃度或pH或者改變吸附到層狀無機化合物上的過程中可以與色素等競爭的化合物的添加量，可以調(diào)整至所要求的吸附程度。上述所謂可競爭的化合物例如可以舉出金屬離子、有機胺類、羧酸類、磷酸鹽等，另外還可以使用表面活性劑、可溶性聚合物等。
至于所使用的緩沖劑或緩沖液的種類、緩沖劑的pH、濃度等，與在本發(fā)明的測定方法一節(jié)中記載的一樣。
緩沖劑的添加方法沒有特別的限制，可以將層狀無機化合物溶解或分散在緩沖劑中，制成含有層狀無機化合物的緩沖溶液或其干燥物。
另外，制造試片時，在層狀無機化合物的分散液中有時會生成半透明的膠體狀凝聚體，不過，通過攪拌分散液可以使該凝聚體重新均勻分散。在凝聚會產(chǎn)生不利后果時，可以用磷酸鹽緩沖溶液提高層狀無機化合物的分散性，從而抑制凝聚的產(chǎn)生。
此外，試驗部分中還可以含有各種表面活性劑。添加表面活性劑能提高試驗部分等在支承體上的涂布性能。但是，表面活性劑具有使吸附在界面上物質(zhì)分散、溶解的作用，對生成的可檢測物質(zhì)在層狀無機化合物上的吸附形成干擾，或者引起生成的可檢測物質(zhì)的溶解，有可能削弱本發(fā)明的效果。因此。在本發(fā)明中與層狀無機化合物組合使用的表面活性劑，應(yīng)當(dāng)選用不妨礙生成的可檢測物質(zhì)與層狀無機化合物吸附的哪些表面活性劑。表面活性劑的用量應(yīng)以不妨礙上述吸附為限度少量使用。表面活性劑的種類和用量的具體例子與上述本發(fā)明測定方法一節(jié)中所述相同。
實施例下面通過實施例具體地說明本發(fā)明。
實施例1按表2所示的最終濃度取POD(過氧化物酶)、色素前體4-AA和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(以下簡稱EHSDA)、緩沖劑Bis-tris(pH6.5)和層狀無機化合物綠土，向其中添加過氧化氫使其最終濃度達到120μmol/l，反應(yīng)后得到反應(yīng)溶液。在450-750nm之間測定所得反應(yīng)溶液的凝聚部分的吸收光譜。
另外，按表3所示的最終濃度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris緩沖液，向其中添加過氧化氫使其最終濃度達到120μmol/l，反應(yīng)后得到反應(yīng)溶液。同樣在450-750nm之間測定所得反應(yīng)溶液的吸收光譜。
吸光率的測定，使用JascoV-550(日本分光計社制造)、以0.5nm的間隔進行，掃描速度是200nm/分，帶寬是1.0nm。使用池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制成)，添加綠土?xí)r產(chǎn)生凝聚，為了只測定凝聚部，使用0.1ml窄縫。測定結(jié)果示于圖1中。
<表2>
試劑最終濃度POD(過氧化物酶) 1U/ml4-AA*12mmol/lEHSDA*22mmol/lBis-tris緩沖液*3100mmol/l綠土*40.1％(總3ml)*1)4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮*2)N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺*3)雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷*4)ル-センタィトSWN(合成綠土コ-プケミカル公司制造)<表3>
試劑最終濃度POD(過氧化物酶) 1U/ml4-AA2mmol/lEHSDA 2mmol/lBis-tris緩沖液 100mmol/l(總量3ml)所使用的試劑如下面的表4中所示。
<表4>試劑 試劑濃度 制造廠家 試劑純度POD(過氧化物酶) 30U/ml 東洋紡(株)4-AA 60mmol/l 和光純藥(株) 特級試劑EHSDA60mmol/l SIGMAbis-tris緩沖液 0.25mmol/l ナカララィテスク(株) 專門制備綠土 0.3％コ-プケミカル(株)過氧化氫 三德化學(xué)工業(yè)(株) 特級試劑由圖1中的結(jié)果可以看出，在色素吸附在綠土上的條件下反應(yīng)可以與未添加綠土的條件下同樣進行。未添加綠土的情況下，最大吸收是593nm，添加綠土?xí)r最大吸收是約578nm。
實施例2按表3所示的最終濃度取POD、4-AA、EHSDA和bis-tris緩沖液(pH6.5)，裝入池長1cm的石英測定池中，在37℃下保溫3分鐘。調(diào)整溫度后添加表5中所示濃度的過氧化氫，開始反應(yīng)，反應(yīng)開始3分鐘后測定吸光率。測定3分鐘后反應(yīng)到達終點。
測定儀器使用JascoV-550(日本分光計社制造)，測定波長為593nm(最大吸收附近的波長)。根據(jù)該結(jié)果可以求出未添加綠土?xí)r的過氧化氫的校準(zhǔn)曲線。
<表5>
實施例3[試驗方法]按表2所示的最終濃度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris緩沖液(pH6.5)和合成綠土，裝入池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制造)中，在37℃下保溫180秒，調(diào)整溫度。調(diào)整溫度后按表6所示的最終濃度添加過氧化氫，添加過氧化氫后10秒起測定吸光率，每2秒鐘測定一次，持續(xù)測定1800秒。測定裝置使用JascoV-550(日本分光計社制造)，測定波長為577nm(最大吸收附近的波長)。為了只測定凝聚部，使用0.1ml窄縫。以過氧化氫濃度0μmol/l的測定結(jié)果作為空白試驗，求出測定開始1800秒后與空白的吸光率的差(ΔAbs)，求出添加綠土后過氧化氫的校準(zhǔn)曲線。結(jié)果與實施例2的未添加綠土的結(jié)果一起示于圖2中。對于圖2的結(jié)果，進一步將縱軸和橫軸取對數(shù)，所得到的校準(zhǔn)曲線示于圖3中。由表3、表6、圖2和3可以選看出，吸附色素的吸光率與過氧化氫之間存在著相關(guān)關(guān)系。添加綠土?xí)r，在過氧化氫濃度0-200μmol/l之間得到r＝0.999的校準(zhǔn)曲線。[r相關(guān)系數(shù)]由圖2和圖3可以看出，未添加綠土的場合最小檢測極限大約是6μmol/l，相比之下，添加綠土的場合大約是3μmol/l，靈敏度提高了。另外，校準(zhǔn)曲線的斜率約增至2倍。
<表6>
實例4[試驗方法]按上面表2所示的最終濃度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris緩沖液(pH6.5)和合成綠土，裝入池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制造)中，調(diào)整溫度37℃下保溫180秒。調(diào)整溫度后按最終濃度達到100μmol/l添加過氧化氫，添加過氧化氫后20秒起測定吸光率，每2秒鐘測定一次，持續(xù)測定600秒。測定裝置使用JascoV-550(日本分光計社制造)，測定波長為577nm(最大吸收附近的波長)。為了只測定凝聚部，使用0.1ml用的窄縫。另外，以過氧化氫濃度0μmol/l的測定結(jié)果作為空白試驗。
另外，按上面表3所示的最終濃度取POD、4-AA、EHSDA和Bis-tris緩沖液(pH6.5)，裝入池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制造)中，調(diào)整溫度37℃下保溫180秒。調(diào)整溫度后按最終濃度達到100μmol/l添加過氧化氫，添加過氧化氫后20秒起測定吸光率，每2秒鐘測定一次，持續(xù)測定600秒。測定裝置使用JascoV-550(日本分光計社制造)，測定波長為593nm(最大吸收附近的波長)。使用0.1ml窄縫。結(jié)果示于圖4中。由圖4可以看出，添加綠土具有敏化作用。還發(fā)現(xiàn)，添加過氧化氫后約30秒時顯色反應(yīng)達到終點。另外，即使顯色后添加綠土，未加綠土?xí)r也觀察到色素的吸附和凝聚。
實施例5按表7所示的最終濃度，取四唑鎓鹽3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯(lián)苯基)-雙[2-(對硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(以下簡稱“四唑鎓鹽”)]、緩沖劑磷酸緩沖液(將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉混合、調(diào)整到pH 8.5)、L-抗壞血酸以及綠土(商品名ル-センタィトSWNコ-プケミカル公司制造、合成綠土)，裝入試管中使之反應(yīng)、顯色。該反應(yīng)是已知生成不溶于水的甲的反應(yīng)。將所得顯色液稀釋10倍，在400-800nm之間測定吸收光譜。另外，為了比較，除了不添加綠土外與上述同樣操作，按表7所示的最終濃度取四唑鎓鹽、磷酸緩沖液和L-抗壞血酸裝入試管中使之顯色。在400-800nm之間對所得顯色液測定吸收光譜。
吸收率的測定使用日本分光計社制造的分光光度計(JascoV-550)。使用池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。測定結(jié)果示于圖5中。
<表7>
試劑最終濃度四唑鎓鹽1mmol/l磷酸鹽緩沖液(pH8.5) 100mmol/lL(+)-抗壞血酸 333μmol/l綠土0.1％或0％(總量3ml)在未添加綠土的系統(tǒng)中顯色呈蘭色，最大吸收波長約為633nm。在添加綠土的系統(tǒng)中顯色呈紫紅色，最大吸收波長約為535nm。由此可以確定，在添加綠土的條件下，反應(yīng)可以與未添加綠土?xí)r同樣條件下進行。另外，在未添加綠土的系統(tǒng)中，測定池的內(nèi)表面上析出被認(rèn)為是甲的沉淀附著物，反之，在添加綠土的系統(tǒng)中，測定池內(nèi)表面上沒有觀察到沉淀或凝聚。另外，由于最大吸收向波長短的一側(cè)移動，因此在使用本實施例同樣的顯色反應(yīng)系統(tǒng)的情況下，吸光率的測定最好是添加綠土的系統(tǒng)和未添加綠土的系統(tǒng)各自在其最大吸收波長附近的波長即633nm(未添加綠土系統(tǒng))、535nm(添加綠土系統(tǒng))下進行。
實施例6按表8所示的最終濃度，取與實施例5中使用的相同的四唑鎓鹽、磷酸鹽緩沖液(pH8.5)和綠土裝入試管中，在30℃下保溫3分鐘。保溫后按表9中所示的各濃度(0-333μmol/l的范圍內(nèi))添加L-抗壞血酸，在30℃下進行30分鐘反應(yīng)后測定吸光率(測定波長535nm)。以未添加抗壞血酸(0μmol/l)的試樣作為空白試驗，根據(jù)測定結(jié)果制作校準(zhǔn)曲線。
另外，為了進行比較，除了不添加綠土外與上述同樣操作，按表8所示的最終濃度取四唑鎓鹽和磷酸鹽緩沖液裝入試管中，在30℃下保溫3分鐘。保溫后按表10所示的各濃度添加抗壞血酸(0-333μmol/l)，在30℃下反應(yīng)30分鐘后測定吸光率(測定波長633nm)。以未添加抗壞血酸的試樣作為空白試驗，根據(jù)測定結(jié)果制作校準(zhǔn)曲線。
圖6中示出所得到的校準(zhǔn)曲線。在未添加綠土的系統(tǒng)中，在抗壞血酸最終濃度41.7-333.3μmol/l的范圍內(nèi)得到r(相關(guān)系數(shù))＝0.9972的校準(zhǔn)曲線。在添加綠土的系統(tǒng)中，在抗壞血酸最終濃度5.2-133.3μmol/l的范圍內(nèi)得到r＝0.9985的校準(zhǔn)曲線。所得到的校準(zhǔn)曲線的斜率，添加綠土的系統(tǒng)是未添加綠土系統(tǒng)的約2.5倍，由此可知，添加綠土具有敏化作用。另外，在未添加綠土的系統(tǒng)中，試管內(nèi)表面上析出被認(rèn)為是甲的沉淀附著物，反之，添加綠土的系統(tǒng)中試管內(nèi)沒有觀察到沉淀或凝聚。
另外，吸收率的測定使用日本分光計社制造的分光光度計(JascoV-550)。使用池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。
<表8>
試劑 最終濃度四唑鎓鹽 800μmol/l磷酸鹽緩沖液(pH8.5)100mmol/lL(+)-抗壞血酸 0-333.3μmol/l綠土 0.1％或0％(總量3ml)
<表9綠土添加系統(tǒng)>
><表10不添加綠土系統(tǒng)><
實施例7按表11所示的最終濃度依次取鹽酸、綠土(コ-プケミカル公司制造、商品名ル-センタィトSWN)、2，4-二氯苯胺和亞硝酸鈉，混合后添加津田試劑(N，N-二乙基-N′-1-萘基萘乙二胺草酸鹽)使之反應(yīng)生成偶氮系色素而顯色。在400-800nm之間測定吸光光譜。另外，亞硝酸鈉是以4種濃度(0、8、16和33μmol/l)添加的。結(jié)果示于圖7中。
另外，為了進行比較，除了不添加綠土外與上述同樣操作，按表11所示的最終濃度添加鹽酸、2，4-二氯苯胺和亞硝酸鈉，然后添加津田試劑使之顯色。在400-800nm之間測定吸光光譜。另外，亞硝酸鈉是以4種濃度(0、8、16和33μmol/l)添加的。結(jié)果示于圖8中。另外，圖9中示出對于添加綠土的系統(tǒng)和未添加綠土的系統(tǒng)亞硝酸鈉濃度33μmol/l條件下的吸光光譜。吸收度的測定使用日本分光計社制造的分光光度計(JascoV-550)。使用池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。
<表11>
試劑 最終濃度鹽酸 1mol/l2，4-二氯苯胺200μmol/l亞硝酸鈉 0-33μmol/l津田試劑 200μmol/l綠土 0.1％或0％(總量3ml)在未添加綠土的系統(tǒng)中顯色呈紫紅色，最大吸收波長約為540nm。在添加綠土的系統(tǒng)中顯色呈紫色，最大吸收波長約為555nm。由此可以確定，在添加綠土的條件下，反應(yīng)可以與未添加綠土?xí)r同樣進行。另外，由于最大吸收向波長長的一側(cè)移動，因此在使用與本實施例同樣的顯色反應(yīng)系統(tǒng)的場合，吸光率的測定最好是添加綠土的系統(tǒng)和未添加綠土的系統(tǒng)各自在其最大吸收波長附近的波長，即分別在540nm(未添加綠土系統(tǒng))、555nm(添加綠土系統(tǒng))下進行。
實施例8按表12所示的最終濃度，取與實施例7中使用的相同的鹽酸、2，4-二氯苯胺、亞硝酸鈉和津田試劑裝入測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)，在30℃下反應(yīng)10分鐘，充分顯色后添加綠土，產(chǎn)生凝聚而沉降，添加綠土后30秒開始測定凝聚的吸光率(測定波長555nm，每1秒測定1次，持續(xù)20分鐘。為了只測定凝聚的吸光率，使用0.1ml用窄縫。另外，亞硝酸鈉是按表13所示的各濃度(0-50μmol/l)添加的。以亞硝酸鈉最終濃度0μmol/l的試樣的結(jié)果作為空白試驗，求出與測定開始20分鐘后與空白樣品的吸光率之差(ΔAbs)，制成校準(zhǔn)曲線。
另外，作為不添加綠土的系統(tǒng)，與上述同樣按表12所示的最終濃度取鹽酸、2，4-二氯苯胺和亞硝酸鈉裝入測定池中，在30℃下保溫3分鐘后添加津田試劑，添加10秒后開始測定吸光率(測定波長540nm)，每1秒測定1次，持續(xù)10分鐘。另外，亞硝酸鈉是按表14所示的各濃度(0-50μmol/l的范圍內(nèi))添加的。求出測定開始10分鐘后的吸光率(Abs)，制成校準(zhǔn)曲線。以亞硝酸鈉的最終濃度0μmol/l的試樣的結(jié)果作為空白試驗進行測定。本試驗中使用的反應(yīng)系統(tǒng)在10分鐘時達到終點。
圖10中示出所得到的校準(zhǔn)曲線。在未添加綠土的系統(tǒng)中，在亞硝酸鈉最終濃度1.6-50.0μmol/l的范圍內(nèi)得到r(相關(guān)系數(shù))＝0.9991的校準(zhǔn)曲線。在添加綠土的系統(tǒng)中，在亞硝酸鈉最終濃度0.4-25.0μmol/l的范圍內(nèi)得到r＝0.9940的校準(zhǔn)曲線。所得到的校準(zhǔn)曲線的斜率，添加綠土的系統(tǒng)是未添加綠土系統(tǒng)的約2.5倍，由此可知，添加綠土具有敏化作用。
另外，吸收率的測定使用日本分光計社制造的分光光度計(JascoV-550)。使用池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。
<表12>
試劑 最終濃度鹽酸 1μmol/l2，4-二氯苯胺 200μmol/l亞硝酸鈉 0-50μmol/l津田試劑 200μmol/l綠土 0.1％或0％(總量3ml)
<表13綠土添加系統(tǒng)>
<表14無綠土系統(tǒng)>
實施例9按表15所示的最終濃度，取POD(過氧化物酶)、色素前體4-AA和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(以下簡稱EHSDMeA)緩沖劑Bis-tris緩沖液(pH 6.5)和層狀無機化合物綠土放入池長1cm的測定池(甲基丙烯酸酯制)中，將該試樣在37℃下保溫180秒。另外，除了不添加綠土外以相同的組成和濃度制成另一試樣，同樣進行保溫。
對這些試樣進行溫度調(diào)節(jié)后，按表15所示各試樣中添加過氧化氫，添加過氧化氫20秒后開始測定吸光率，每2秒1次，共測定1800秒。測定使用日本分光計社制造的分光光度計(JascoV-550)。測定波長為630nm。由于添加綠土?xí)r產(chǎn)生凝聚，為了只測定凝聚部，使用0.1ml窄縫。另外，制備添加綠土而不添加過氧化氫的相同濃度試樣，作為添加綠土系統(tǒng)的本底，對該反應(yīng)溶液同樣進行測定。
<表15>
試劑最終濃度POD(過氧化物酶) 1U/ml4-AA*10.05mmol/lEHSDMeA*25mmol/lBis-tris緩沖液*3100mmol/l綠土*40.1％過氧化氫10mmol/l(總量3ml)*1)4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮)*2)N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺*3)雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷*4)ル-センタィトSWN(合成綠土コ-プケミカル公司制造)所使用的試劑如下面表16中所示。
<表16>
試劑 試劑濃度 制造廠家 試劑純度POD(過氧化物酶) 30U/ml東洋紡(株)4-AA 1.5mmol/l 和光純藥(株) 特級試劑EHSDMeA 150mmol/l 同仁化學(xué)(株)Bis-tris緩沖液 0.25mmol/lナカララィテスク(株) 專門制備綠土 0.3％ コ-プケミカル(株)過氧化氫 300mmol/l 三德化學(xué)工業(yè)(株)特級試劑結(jié)果示于圖11。由圖11可以看出，未添加綠土的試樣從反應(yīng)開始約3分鐘后觀察到吸光率降低，而添加綠土的試樣沒有觀察到吸光率降低。由此證實，即使添加綠土，檢測反應(yīng)仍與不添加時同樣進行，另外還證實，4-AA與EHSDMeA氧化縮合生成的色素通過吸附在綠土上，不會被過氧化氫氧化分解，從而抑制了其退色。
實施例10按表17和表18所示的最終濃度，取POD、4-AA、EHSDMeA、xBis-tris緩沖液(pH 6.5)和綠土放入池長1 cm的測定池(甲基丙烯酸酯制)，制成5種不同試樣(試樣№1-5)，將它們分別在37℃下保溫180秒。
對這些試樣進行溫度調(diào)節(jié)后，添加表18所示之量的過氧化氫，開始反應(yīng)。添加過氧化氫60秒后，添加表18所示之量的抗壞血酸，添加20秒后測定吸光率，每秒1次，共測定300秒。測定使用JascoV-550(日本分光計社制造)。測定波長為630nm。為了只測定凝聚部分，使用0.1cm用的窄縫。
<表17>
試劑 試劑濃度POD(過氧化物酶) 1U/ml4-AA 2μmol/lEHSDMeA 2μmol/lBis-tris緩沖液100μmol/l綠土*1(參見表18)過氧化氫 (參見表18)L(+)抗壞血酸 (參見表18)(總量3ml)*1)ル-センタィトSWN(合成綠土コ-プケミカル公司制造)<表18>
試樣編號 綠土 抗壞血酸 過氧化氫(％) (mg/dl)(μmol/l)10 0 10020 5(284 μmol/l)10030.10 10040.15(284 μmol/l)10050.10 0使用的試劑如下面表19中所示。
<表19>試劑 試劑濃度 制造廠家 試劑純度POD30U/ml 東洋紡(株)4-AA 60mmol/l 和光純藥(株) 特級試劑EHSDMeA60mmol/l 同仁化學(xué)(株)Bis-tris緩沖液 0.25mmol/l ナカララィテスク(株) 專門制備綠土 0.3％ コ-プケミカル(株)過氧化氫 3mmol/l三德化學(xué)工業(yè)(株) 特級試劑抗壞血酸 150mg/dl ナカララィテスク(株) 特級試劑結(jié)果示于表18和圖12中。圖13中示出圖12中0-60秒?yún)^(qū)間的放大圖。表20中示出測定開始后0秒、60秒、30秒的吸光率(Abs)。另外，為了排除由于凝聚而產(chǎn)生的影響，對№3和№4試樣求出與№5試樣的差(ΔAbs)，結(jié)果示于表20中的括號內(nèi)。
由圖12和圖13可以看出，在未添加綠土的系統(tǒng)中，添加抗壞血酸后立即發(fā)生退色，測定開始時(添加抗壞血酸20秒后)，顯色程度只有未添加抗壞血酸時的20％左右，測定開始60秒后(添加抗壞血酸80秒后)變成無色。
相比之下，在添加綠土的系統(tǒng)中，測定開始時(添加抗壞血酸20秒后)保持約90％的顯色程度，測定開始60秒后(添加抗壞血酸80秒后)保持約80％的顯色程度，300秒后(添加抗壞血酸320秒后)仍可以看到約50％的顯色程度。
上述結(jié)果表明，通過添加綠土可以抑制因抗壞血酸而引起的生成色素的分解。
<表20>試樣編號0秒后 60秒后300秒后(ΔAbs) (ΔAbs) (ΔAbs)1 1.15 1.14 1.112 0.23 0.00 0.003 1.26(1.16)1.33(1.23)1.63(1.49)4 1.16(1.06)1.07(0.97)0.84(0.70)5 0.10 0.10 0.14實施例11按表21所示的最終濃度，取四唑鎓鹽3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯(lián)苯基)-雙[2-(對硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓]氯化物(以下簡稱“四唑鎓鹽”)、緩沖劑磷酸鹽緩沖液(將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉混合、調(diào)整到pH 8.5)、L-抗壞血酸以及綠土(商品名ル-センタィトSWNコ-プケミカル公司制造、合成綠土)，裝入測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)，在30℃下保溫180秒。然后添加L-抗壞血酸開始反應(yīng)。添加10秒鐘后開始測定吸光率。每秒1次，共測定300秒，觀察吸光率隨時間的變化。測定波長535nm，反應(yīng)溫度30℃。
另外，為了進行比較，除了不添加綠土外與上述同樣操作，按表21所示的最終濃度取四唑鎓鹽和磷酸鹽緩沖液裝入測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)中，在30℃下保溫180秒。然后添加L-抗壞血酸開始反應(yīng)。添加10秒鐘后開始測定吸光率。每秒1次，共測定300秒，觀察吸光率隨時間的變化。測定波長633nm，反應(yīng)溫度30℃。
另外，吸收率的測定使用日本分光計社制造的分光光度計(JascoV-550)。使用池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。測定波長都是最大吸收波長附近的波長。
測定結(jié)果以吸光率隨時間變化的曲線的形式示于圖14中。在添加綠土的系統(tǒng)中，測定開始后約50秒反應(yīng)達到穩(wěn)定，而未添加綠土的系統(tǒng)，測定開始后約300秒反應(yīng)才達到穩(wěn)定。由此可知，添加綠土提高了反應(yīng)速度。
該反應(yīng)是生成不溶解于水的甲的公知反應(yīng)，但添加綠土的系統(tǒng)在測定池內(nèi)沒有觀察到沉淀或凝聚。
<表21>
試劑 最終濃度四唑鎓鹽 800μmol/l磷酸緩沖液(pH8.5) 100mmol/lL(+)-抗壞血酸83.3μmol/l綠土 0.1％或0％(總量3ml)實施例12按表22所示的最終濃度，取鹽酸、綠土(コ-プケミカル公司制造、商品名ル-センタィトSWN)、2，4-二氯苯胺和亞硝酸鈉裝入測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)中，在30℃下保溫180秒鐘。亞硝酸鈉的濃度在0-50μmol/l的范圍，采用1.6、6.3、12.5、25.0和50.0μmol/l5種濃度。
保溫后添加津田試劑(N，N-乙基-N′-1-萘基萘乙二胺草酸鹽)，添加10秒后開始測定吸光率，每秒1次，共測定600秒，觀察吸光率隨時間的變化。測定波長555nm，反應(yīng)溫度30℃。
另外，為了進行比較，除了不添加綠土外與上述同樣操作，按表22所示的最終濃度取鹽酸、2，4-二氯苯胺和亞硝酸鈉裝入測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)，30℃保溫180秒，然后加入津田試劑，添加10秒后開始測定吸光率，每秒1次，共測定600秒，觀察吸光率隨時間的變化。測定波長540nm，反應(yīng)溫度30℃。
吸收度的測定使用日本分光計社制造的分光光度計(JascoV-550)。使用池長1cm的測定池(聚甲基丙烯酸甲酯制)。兩種情況下測定波長都是最大吸收波長附近的波長。
圖15-圖17中以吸光率隨時間的曲線示出測定結(jié)果。其中，圖15是未添加綠土系統(tǒng)的曲線，圖16是添加綠土系統(tǒng)的曲線，圖17是亞硝酸鈉濃度25.0μmol/l的場合的添加綠土系統(tǒng)和未添加綠土系統(tǒng)的曲線。根據(jù)這些曲線，未添加綠土系統(tǒng)在測定開始后300秒左右反應(yīng)達到終點，而添加綠土系統(tǒng)在測定開始后約30秒反應(yīng)達到終點。由此可知，添加綠土提高了反應(yīng)速度。
<表22>
試劑 最終濃度鹽酸 1mol/l2，4-二氯苯胺 200μmol/l亞硝酸鈉 0-50μmol/l津田試劑 200μmol/l綠土 0.1％或0％(總量3ml)實施例13按表23所示的最終濃度，取POD(過氧化物酶)、色素前體4-AA和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(以下簡稱EHSDA)以及緩沖劑Bis-tris緩沖液(pH 6.5)，向其中添加過氧化氫，得到顯色液。將30μL所得到的顯色液滴到在層狀無機化合物(合成綠土商品名ル-センタィトSWN、コ-プケミカル公司制造)的1％分散液(溶劑蒸餾水)中浸滲后干燥的濾紙(東洋濾紙社制造的№2濾紙)和未經(jīng)處理的濾紙上，觀察其擴散的情況。顯色液呈圓形滲透、擴散，測定其直徑的最大部分和最小部分，根據(jù)其平均值求出色素擴散的斑點的面積。
<表23>
試劑最終濃度POD 1U/ml4-AA*12mmol/lEHSDA*22mmol/lBis-tris緩沖液*3100mmol/l過氧化氫10μmol/l(總量3ml)*1)4-氨基安替比林(4-氨基-1，2-二氫-1，5-二甲基-2-苯基-3H-吡唑-3-酮*2)N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺*3)雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷所使用的試劑如下面表24所示。
<表24>試劑 試劑濃度 制造廠家 試劑純度POD 30U/ml 東洋紡(株)4-AA 60mmol/l 和光純藥(株) 特級試劑EHSDA 60mmol/l SIGMABis-tris緩沖液0.25mmol/l ナカララィテスク(株) 專門制備綠土 1％ コ-プケミカル(株)過氧化氫 三德化學(xué)工業(yè)(株) 特級試劑表25中示出所得到的直徑、面積和色斑的色調(diào)。另外，圖18和圖19中示出顯色液擴散后濾紙的樣子的示意圖。
<表25>
與未處理的濾紙相比較，浸滲了綠土分散液的濾紙中色素的擴散受到抑制，色斑較小(面積約為1/8)。但顯色液中除去色素外的無色部分的擴散與未處理的濾紙擴散程度相同。由此可知，色素選擇性地與濾紙中的綠土吸附在一起。
另外，與未處理的濾紙相比，浸滲了綠土的濾紙中色斑的色調(diào)更濃，并且色調(diào)向波長較短一側(cè)移動。此外，在綠土中浸滲的濾紙即使用水洗，色素也沒有洗脫。
由此可知，在濾紙中添加綠土可以使色素吸附在濾紙上，防止色素擴散和洗脫出。
因此，采用本發(fā)明的試片，生成的色素不會移動或洗脫，可以提高測定的精度和靈敏度。另外，因為色素不移動或由于試驗部分的干燥而引起濃縮，以及即使將試片浸泡在試樣中生成色素也不會洗脫，所以可以簡便地進行測定。
實施例14將尿試紙(用于測定尿中的亞硝酸鹽、葡萄糖、潛血、膽紅素和尿膽素原的多項目試紙，是市售的試紙，將各相應(yīng)的試劑浸滲到濾紙中形成試驗部分，與校正用的試驗部分一起粘貼在塑料膜上制成)放入按一般配方制成的對照尿中浸漬后立即取出，放置約30秒直至觀察到顯色，然后將與實施例13中使用的相同的浸滲綠土的濾紙片壓在其上面，使色素轉(zhuǎn)移到浸滲綠土的濾紙片上。目視觀察濾紙片上的色素的展開。用自來水充分洗凈，目視觀察褪色的情況。
作為對照，使用未經(jīng)綠土處理的東洋濾紙№2和№131二種濾紙，同樣進行操作。
各試驗的測定方法和配方如下，結(jié)果示于下面的表26中。
·亞硝酸鹽試驗Griess法在酸性條件下使4-氨基苯胂酸與亞硝酸鹽反應(yīng)，生成重氮鹽，再與N-1-萘乙二胺二鹽酸鹽偶合生成偶氮色素。按此方式，將一張濾紙浸滲0.26mg N-1-萘乙二胺二鹽酸鹽和0.57mg 4-氨基苯胂酸，將其分割成100份，用一片作為一個試驗部分。一片吸收約6μl的溶液。
·葡萄糖試驗在過氧化物酶催化劑的作用下，使由葡糖氧化酶產(chǎn)生的過氧化氫與顯色指示劑(四甲基對苯二胺和愈創(chuàng)樹脂，分別為色原體)反應(yīng)而氧化顯色。按此方式，將一片濾紙浸滲葡糖氧化酶470IU、過氧化物酶219PU、四甲基對苯二胺13.0mg和愈創(chuàng)樹脂4.3mg，分割成100份，用一片作為一個試驗部分。每一片吸收約6μl的溶液。
·潛血試驗該方法是利用由血紅蛋白引起的氫過氧化枯烯的分解，和由形成的活性基氧引起的鄰聯(lián)甲苯胺的氧化顯色作用。使用聯(lián)苯胺類(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺等)代替鄰聯(lián)甲苯胺也可以得到同樣的效果。按此方式，將一張濾紙浸滲氫過氧化枯烯52.6mg和鄰聯(lián)甲苯胺7.6mg，分割成100份，用其中一片作為一個試驗部分，一片吸收約6μl的溶液。
·膽紅素試驗該方法是在酸性條件下由重氮試劑2-甲基-5-硝基苯胺或磺胺酸和亞硝酸鈉生成重氮鹽，重氮鹽在甘油茶堿存在下與膽紅素偶合生成偶氮膽紅素。按此方式，將一張濾紙浸滲2-甲基-5-硝基苯胺3.8mg、亞硝酸鈉2.1mg和甘油茶堿少量，分割成100份，用其中一片作為一個試驗部分。一片吸收約6μl的溶液。
·尿膽素原試驗該方法是利用在酸性條件下尿膽素原與3，3′-二甲氧基聯(lián)苯基-4，4′-重氮四氟化硼鹽的偶氮偶合反應(yīng)。按此方式，將一片濾紙浸滲3，3′-二甲氧基聯(lián)苯基-4，4′-重氮四氟化硼酸鹽0.36mg，分割成100份，用其中一片作為一個試驗部分。一片吸收約6μl的溶液。
<表26>
色素的擴展 ··· ○無擴展×大量擴展由于洗滌引起的褪色 ··· ○未褪色×有一些褪色如表26的結(jié)果所示，浸滲層狀元機化合物的濾紙，吸附色素未擴展洗滌后也沒有褪色。由此可知，浸滲層狀無機化合物的濾紙能抑制色素的擴散并防止洗脫。因此，本發(fā)明的試片，生成的色素不會移動或洗脫，可提高測定的精度和靈敏性。另外，不會發(fā)生因試驗部分的干燥引起的色素濃縮和移動，即使將試片浸在試樣中，生成的色素也不會洗脫，可以簡便地進行測定。另外，在多項目試片一中，生成的色素不會污染相鄰的試驗部分，因此可以縮小試驗部分間的距離，因而使試片小型化。
另外，若色素滲透到未處理的濾紙中、不遮光、在室溫下使生成的色素暴露于空氣中，觀察變色和褪色，大約1個月后變成與剛反應(yīng)后完全不同的顯色狀態(tài)，另一方面，吸附在含有層狀無機化合物的濾紙中的生成色素，在不遮光及室溫條件下暴露于空氣中時，至少3個月內(nèi)沒有觀察到色調(diào)的變化和褪色。
以上事實表明本發(fā)明的實用性，使用本發(fā)明的試片，即使在患者家中采集試樣，在試片上反應(yīng)顯色后將已經(jīng)顯色的試片郵寄到遠距離外的檢查中心，也可以得到與剛剛反應(yīng)顯色后相同的測定結(jié)果。即，本發(fā)明的試片顯色穩(wěn)定，不會發(fā)生因干燥引起的色素濃縮和因滲水引起的洗脫，因此可以用來作為郵寄用的試片。
實施例15用刮刀在經(jīng)過紫外線處理的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜上涂布按下面表27所示制備的溶液，形成厚100μm的涂膜，然后干燥。將該涂膜連同PET薄膜一起切割成1cm見方的小片，按圖20所示將其夾于玻璃板之間，且玻璃板間留出500μm的空間，制成反應(yīng)池。圖20中示出該反應(yīng)池的示意圖。
向該反應(yīng)池中添加入2mmol/l過氧化氫，觀察此時的顯色情況。另外，除了不添加綠土外制備同樣的溶液，同樣制成反應(yīng)池，觀察顯色的情況。
<表27>
試劑最終濃度POD 1U/ml4-AA2mmol/lEHSDA 2mmol/lBis-tris緩沖液 100mmol/l綠土*10.3％HPC-M*21％*1)ル-センタィトSWN(合成綠土コ-プケミカル公司制造)*2)羥乙基丙基纖維素在未添加綠土的涂膜中觀察到生成色素從膜中洗脫，而添加綠土的涂膜未觀察到色素洗脫。
實施例16本實施例是具有多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體的檢測層的本發(fā)明試片的制造配方的例子。圖21中示出該試片的示意圖。
將濾紙(Whatman公司制造、2 Chr)在按下面表28所示配制的含有酶GOD(葡糖氧化酶)和POD(過氧化物酶)的試劑溶液中浸漬，在40℃下干燥30分鐘。將該濾紙切成5mm×5mm片，用雙面膠帶粘貼到5mm×100mm的白色塑料薄膜的一端上，制成以上述濾紙作為試驗部分的試片。
<表28>
試劑 最終濃度GOD 100U/mlPOD 100U/ml4-AA 5g/lEHSDA3g/l磷酸鹽緩沖液(pH7.0) 0.1mol/l綠土 1％在該試片上，用吸移管將6μl血漿滴到試驗部分上，或?qū)⒃撛嚻诓杉讲ＡП瓋?nèi)的尿中浸漬，進行反應(yīng)后用反射計測定檢測層的顯色強度，可以測出血漿或尿中的葡萄糖濃度。本發(fā)明中的含有層狀無機化合物的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)的層，在本實施例的試片中可以用來作為兼作試樣吸入層和試劑層及反應(yīng)層的檢測層。
實施例17本實施例是本發(fā)明的具有多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)域的試片的制造方法例。圖22中示出該試片的示意圖。
將濾紙(Whatman公司制造、2 Chr)在按下面表29所示配制的含有酶GOD(葡糖氧化酶)和POD(過氧化物酶)的試劑溶液中浸漬，在40℃下干燥30分鐘。將該濾紙切成5mm×5mm的片，將其壓貼到5mm×100mm的另一濾紙(Whatman公司制造、2 Chr)的規(guī)定位置(圖22的反應(yīng)區(qū)域)上。然后，將另一新的濾紙(Whatman公司制造、2Chr)在按下面表30所示制備的層狀無機化合物的分散液中浸漬，室溫下自然干燥。將該濾紙切成5mm×5mm片，將其壓貼到有反應(yīng)區(qū)域的上述5mm×100mm的濾紙(Whatman公司制造、2 Chr)的規(guī)定位置(圖22的保持區(qū)域)上。這樣制成的試片具有試樣吸入?yún)^(qū)域、擴散區(qū)域、反應(yīng)區(qū)域、吸附可檢測物質(zhì)的保持區(qū)域、吸收多余試樣的區(qū)域，保持區(qū)域兼作檢測區(qū)域。
<表29>
試劑最終濃度GOD 100U/mlPOD 200U/ml4-AA5g/lEHSDA 3g/l磷酸鹽緩沖液(pH7.0) 0.1mol/l<表30>
試劑最終濃度Bis-tris緩沖液 0.1mol/l(pH6.5)綠土1％將本試片的試樣吸入?yún)^(qū)域放入裝在小杯中的血漿或采集到玻璃杯中的尿中浸漬。試樣通過試樣吸入?yún)^(qū)域和擴散區(qū)域到達反應(yīng)區(qū)域，與試劑混合后發(fā)生反應(yīng)，形成反應(yīng)液，在該反應(yīng)溶液通過反應(yīng)時間調(diào)整區(qū)域和保持區(qū)域后，將試片取出。用反射計測定保持區(qū)域中的顯色強度，測得血漿或尿中的葡萄糖濃度。
本發(fā)明的含有層狀無機化合物的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)，在本實施例的試片中可以用來作為兼作吸附反應(yīng)液中所含可檢測物質(zhì)(色素)的保持區(qū)域的檢測區(qū)域。
工業(yè)上的應(yīng)用本發(fā)明的測定方法可以用于高靈敏度和高精度地測定物質(zhì)。采用本發(fā)明的第1方法，在反應(yīng)系統(tǒng)中添加粘土礦物等層狀無機化合物、吸附可檢測物質(zhì)后測定該物質(zhì)，可以進行高靈敏度的測定。采用本發(fā)明的第2方法，在反應(yīng)系統(tǒng)中添加粘土礦物等層狀無機化合物，色素等可檢測物質(zhì)與層狀無機化合物吸附在一起，對可檢測物質(zhì)形成保護作用，可以抑制由于過剩的過氧化氫或還原性的抗壞血酸引起的分解，使可檢測物質(zhì)保持穩(wěn)定，從而可以防止可檢測物質(zhì)是色素時色素生成后褪色，可以穩(wěn)定地進行高靈敏度、高精度以的測定。采用本發(fā)明的第3方法，在可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)系統(tǒng)中添加粘土礦物等層狀無機化合物，可以提高上述生成反應(yīng)的反應(yīng)速度，迅速進行測定。采用本發(fā)明的第4方法，在反應(yīng)溶劑中分散粘土礦物等層狀無機化合物，進行可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)，即使是生成不溶性物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)，也可以實現(xiàn)高靈敏度的測定。另外，采用本發(fā)明的試片，色素等不易擴散和洗脫，可以以高靈敏度、準(zhǔn)確性簡便地進行分析。
本發(fā)明的測定方法可以用于尿或血液等體液中的生物成分、食品、醫(yī)藥和自然環(huán)境中存在的微量物質(zhì)、工業(yè)化學(xué)物質(zhì)、廢棄物中的微量物質(zhì)的檢測和測定。
權(quán)利要求
1.分析物的測定方法，該方法是利用包括試樣中的分析對象物質(zhì)生成可檢測物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)測定上述可檢測物質(zhì)，從而測定分析對象物質(zhì)，其特征是，在包括可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物。
2.權(quán)利要求1所述的分析物測定方法，其特征是，該方法包括在上述反應(yīng)系統(tǒng)中添加層狀無機化合物，使可檢測物質(zhì)吸附在該層狀無機化合物上的工序。
3.權(quán)利要求1所述的分析物測定方法，其特征是，通過使上述反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物，抑制可檢測物質(zhì)的分解。
4.權(quán)利要求1所述的分析物測定方法，其特征是，通過在層狀無機化合物存在下進行上述可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)，提高上述生成反應(yīng)的反應(yīng)速度。
5.權(quán)利要求1所述的分析物測定方法，其特征是，構(gòu)成上述反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)中至少有一個是生成反應(yīng)溶劑不溶解的物質(zhì)的反應(yīng)。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的測定方法，其特征是，層狀無機化合物是2∶1型粘土礦物。
7.權(quán)利要求6所述的測定方法，其特征是，2∶1型粘土礦物是膨潤性層狀粘土礦物。
8.權(quán)利要求7所述的測定方法，其特征是，膨潤性層狀粘土礦物是選自膨潤土、綠土、蛭石和合成氟云母中的至少一種。
9.權(quán)利要求8所述的測定方法，其特征是，所述的綠土是合成綠土。
10.權(quán)利要求9所述的測定方法，其特征是，所述的合成綠土是選自鋰蒙脫石和皂石中的至少一種。
11.權(quán)利要求1-5中任一項所述的測定方法，其特征是，層狀無機化合物是水滑石。
12.權(quán)利要求1-5任一項所述的測定方法，其特征是，所述的可檢測物質(zhì)是可以用光學(xué)方法或電化學(xué)方法檢測的物質(zhì)。
13.權(quán)利要求12所述的測定方法，其特征是，所述的可檢測物質(zhì)是可以用光學(xué)方法檢測的色素。
14.權(quán)利要求1-5中任一項所述的測定方法，其特征是，生成所述可檢測物質(zhì)的反應(yīng)是氧化還原反應(yīng)。
15.權(quán)利要求12所述的測定方法，其特征是，所述的可檢測物質(zhì)是選自電子傳遞物質(zhì)、電子供給物質(zhì)和電子受容物質(zhì)中的，可以用電化學(xué)方法檢測的化合物。
16.權(quán)利要求14所述的測定方法，其特征是，生成所述可檢測物質(zhì)的反應(yīng)是氧化還原反應(yīng)，含有上述形成可檢測物質(zhì)反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)包括過氧化氫的生成反應(yīng)或以過氧化氫作為氧化劑的氧化反應(yīng)。
17.權(quán)利要求14所述的測定方法，其特征是，生成上述可檢測物質(zhì)的反應(yīng)是氧化還原反應(yīng)，包括生成上述可檢測物質(zhì)的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)包含生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的反應(yīng)，或者包含有以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為還原劑的反應(yīng)。
18.權(quán)利要求14所述的測定方法，該方法是由分析對象物質(zhì)經(jīng)化學(xué)反應(yīng)生成過氧化氫，過氧化氫與可氧化顯色的顯色劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)而生成與上述分析對象物質(zhì)存在定量相關(guān)關(guān)系的色素，通過對該色素進行比色定量分析來測定上述分析對象物質(zhì)，其特征是，使上述氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物，至少使因過氧化氫而引起的色素分解得到抑制。
19.權(quán)利要求3所述的測定方法，該方法是由分析對象物質(zhì)經(jīng)化學(xué)反應(yīng)生成重氮鹽，重氮鹽與偶合試劑發(fā)生偶合反應(yīng)而生成與上述分析對象物質(zhì)存在定量相關(guān)關(guān)系的偶氮化合物，通過對該偶氮化合物進行定量分析來測定上述分析對象物質(zhì)，其特征是，使上述偶合反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物，抑制上述偶氮化合物的分解。
20.權(quán)利要求3所述的測定方法，其特征是，可檢測物質(zhì)的分解包括由抗壞血酸引起的上述可檢測物質(zhì)的分解。
21.權(quán)利要求4所述的測定方法，其特征是，上述可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)的反應(yīng)起始物質(zhì)或反應(yīng)中間體是可以吸附在層狀無機化合物上的陽離子性化合物。
22.權(quán)利要求21所述的測定方法，其特征是，所述的反應(yīng)起始物質(zhì)或反應(yīng)中間體是重氮鹽。
23.權(quán)利要求21所述的測定方法，其特征是，所述的反應(yīng)起始物質(zhì)或反應(yīng)中間體是四唑鎓鹽。
24.權(quán)利要求5所述的測定方法，其特征是，生成上述可檢測物質(zhì)的反應(yīng)是四唑鎓鹽的還原反應(yīng)。
25.權(quán)利要求1-5中任一項所述的測定方法，其特征是，使上述層狀無機化合物以選自分散液、溶膠、凝膠、淤漿、凝聚體、凝結(jié)體和燒結(jié)多孔體中的任一種形態(tài)分散存在于上述反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)介質(zhì)中。
26.權(quán)利要求25所述的測定方法，其特征是，所述的層狀無機化合物是以該層狀無機化合物的分散液的形式添加到上述反應(yīng)系統(tǒng)中。
27.一種分析試片，該試片是采用包括試樣中的分析對象物質(zhì)生成可檢測物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)來測定上述可檢測物質(zhì)，從而測定上述分析對象物質(zhì)的分析用試片，其特征是該試片配備有至少1個試驗部分，所述的試驗部分具有用于檢測上述可檢測物質(zhì)的檢測部，且至少在上述試驗部分中含有層狀無機化合物。
28.權(quán)利要求27所述的試片，其特征是，由二個或多個用于檢測可檢測物質(zhì)作為檢測部的檢測層構(gòu)成的至少一個試驗部分，且至少在檢測層中含有層狀無機化合物。
29.權(quán)利要求28所述的試片，其特征是，所述試驗部分還含有用于擴散試樣的擴散層，試樣通過擴散層擴散到達檢測層。
30.權(quán)利要求27所述的試片，其特征是，配備有至少1個試驗部分，所述的試驗部分具有用于檢測可檢測物質(zhì)作為檢測部的檢測區(qū)，至少在上述檢測區(qū)中含有層狀無機化合物。
31.權(quán)利要求30所述的試片，其特征是，所述的試驗部分還具有用于擴散試樣的擴散區(qū)，試樣通過該擴散區(qū)擴散到達檢測區(qū)。
32.權(quán)利要求30所述的試片，其特征是，所述的檢測區(qū)域由包含用于檢測可檢測物質(zhì)的檢測層的兩層或多層構(gòu)成。
33.權(quán)利要求27所述的試片，其特征是，所述的試驗部分還具有用于試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)的反應(yīng)部，在上述反應(yīng)部中生成可檢測物質(zhì)。
34.權(quán)利要求33所述的試片，其特征是，所述的檢測部設(shè)置在試樣擴散通過反應(yīng)部后到達的位置。
35.權(quán)利要求27所述的試片，其特征是，在所述的檢測部中通過試樣中的分析對象物質(zhì)與試劑反應(yīng)而生成上述可檢測物質(zhì)。
36.權(quán)利要求27-35中任一項所述的試片，其特征是，所述試片中的含有層狀無機化合物的部分由多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體構(gòu)成。
37.權(quán)利要求36所述的試片，其特征是，所述的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體是由上述層狀無機化合物形成，或者是由上述層狀無機化合物和選自親水性聚合物、濾膜、纖維集合體以及有機化合物或無機化合物的微粉中的至少一種形成。
38.權(quán)利要求27-35中任一項所述的試片，其特征是，層狀無化合物是2∶1型粘土型礦物。
39.權(quán)利要求38所述的試片，其特征是，2∶1型粘土礦物是膨潤性層狀粘土礦物。
40.權(quán)利要求39所述的試片，其特征是，所述膨潤性層狀粘土礦物是選自膨潤土、綠土、蛭石和合成氟云母中的至少一種。
41.權(quán)利要求40所述的試片，其特征是，所述的綠土是合成綠土。
42.權(quán)利要求41所述的試片，其特征是，所述的合成綠土是選自鋰蒙脫石和皂石中的至少一種。
43.權(quán)利要求27-35中任一項所述的試片，其特征是，所述的試驗部分中含有試劑。
44.權(quán)利要求43所述的試片，其特征是，在向試驗部分中添加試樣之前和/或添加之后，添加溶解了試劑的試劑溶液，使上述試驗部分中含有試劑。
45.權(quán)利要求27-35中任一項所述的試片，其特征是，在含有層狀無機化合物的部分中還含有緩沖劑或其干燥物。
46.權(quán)利要求27-35中任一項所述的試片，其特征是，所述的試劑是可以與分析對象物質(zhì)反應(yīng)、生成可用光學(xué)方法檢測的物質(zhì)的試劑。
47.權(quán)利要求46所述的試片，其特征是，可用光學(xué)方法檢測的物質(zhì)是水溶性的。
全文摘要
本發(fā)明是根據(jù)測定分析對象物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)生成的可檢測物質(zhì)來測定分析對象物質(zhì)的方法。通過使包括可檢測物質(zhì)的生成反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)中存在層狀無機化合物,可以進行高靈敏度的測定。另外,通過使可檢測物質(zhì)穩(wěn)定化,可以提高測定精度。此外,還可以提高化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度,迅速進行測定。再有,即使在含有生成不溶性物質(zhì)的反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)中也可以保持高的靈敏度。本發(fā)明還涉及利用包括試樣中的分析對象物質(zhì)生成可檢測物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)、通過測定上述可檢測物質(zhì)來測定上述分析對象物質(zhì)的分析用試片。該試片配備有至少1個包括用于檢測上述可檢測物質(zhì)的檢測部的試驗部分,至少在上述試驗部分中含有層狀無機化合物,從而可以抑制色素擴散和洗脫,實現(xiàn)準(zhǔn)確的檢查和分析并且易于操作。
文檔編號G01N31/22GK1207173SQ9619946
公開日1999年2月3日 申請日期1996年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月30日
發(fā)明者福岡隆子, 片山敦子, 山原建次, 米原聰 申請人:株式會社京都第一科學(xué)