一種基于l型脫氧核酶生物體系中金屬離子的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于L型脫氧核酶生物體系中金屬離子 的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)生物體內(nèi)重金屬離子靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)是人們一直努力的目標(biāo)。除了傳統(tǒng)的原子 吸收、質(zhì)譜等方法，近年來(lái)，基于體外篩選技術(shù)，科學(xué)家門發(fā)展了一系列具有催化活性的DNA 結(jié)構(gòu)（DNAzyme，中譯文為脫氧核酶），由于這些DNAzyme的活性對(duì)特定的重金屬離子具有強(qiáng) 烈的依賴性，人們因此發(fā)展了DNAzyme傳感器用于重金屬離子如鉛、銅、汞、鈾酰等的檢測(cè)， 這些傳感器靈敏度高，選擇性好，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速，因此受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。然 而，復(fù)雜的生理環(huán)境，限制了DNAzyme在體內(nèi)的廣泛應(yīng)用。例如，生物基質(zhì)中存在著大量的 核酸酶，這些核酸酶能夠?qū)ν庠碊NAzyme產(chǎn)生非特異性攻擊，使得DNAzyme無(wú)法穩(wěn)定存在于 生理環(huán)境而報(bào)告出假陽(yáng)性信號(hào)；其次，大量的蛋白質(zhì)能夠與DNAzyme非特異性結(jié)合，引起探 針結(jié)構(gòu)變化，報(bào)告假陽(yáng)性信號(hào)；第三，外源DNAzyme探針與體內(nèi)核酸屬于同一類型，為了避 免DNAzyme與體內(nèi)其它非特異性的核酸序列產(chǎn)生雜交，需要對(duì)核酸探針進(jìn)行序列的篩選和 優(yōu)化，這對(duì)核酸探針的設(shè)計(jì)造成了一定的復(fù)雜性。
[0003] L-DNA是天然DNA，D型DNA的對(duì)映異構(gòu)體。與D-DNA相比，L-DNA能夠抵抗核酸 酶的降解、不與細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合，同時(shí)，L-DNA不會(huì)與D型核酸雜交，從 而減少了L-DNA核酸探針設(shè)計(jì)的復(fù)雜性等問題?；贚-DNA的諸多優(yōu)良性質(zhì)，我們考慮能 否設(shè)計(jì)L-DNAzyme用于生物體系中金屬離子檢測(cè)。根據(jù)手性底物特異性相關(guān)（reciprocal chiralsubstratespecificity)原理，如果物質(zhì)A與B有特異性識(shí)別能力，那么A的鏡像 A'則能夠與B的鏡像B'具有同樣的識(shí)別能力?；诖?，我們推斷，如果物質(zhì)A與B有特異 性識(shí)別能力，而B物質(zhì)是非手性物質(zhì)，則物質(zhì)A的鏡像A'應(yīng)該對(duì)非手性的物質(zhì)B具有同樣 的識(shí)別能力。如果這個(gè)推斷成立，那么當(dāng)D-DNAzyme對(duì)金屬離子具有特異性依賴而產(chǎn)生催 化活性時(shí)，其鏡像結(jié)構(gòu)：L-DNAZyme同樣能夠依賴該金屬離子而產(chǎn)生催化活性，這樣，我們 就能夠?qū)-DNAzyme序列直接轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-DNAzyme序列，用于金屬離子的檢測(cè)與成像，而根據(jù) 前面的報(bào)道，L-DNA不會(huì)受到各種生物基質(zhì)的干擾，從而發(fā)展一種生物體系中穩(wěn)定存在的金 屬離子傳感器用于金屬離子的準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有D-DNAzyme易被生物基質(zhì)干擾，對(duì)金屬離子的檢測(cè)容易產(chǎn)生假陽(yáng) 性信號(hào)等問題，提出一種穩(wěn)定、靈敏、特異性分析生物體系中金屬離子的定量定性分析試劑 盒、方法和應(yīng)用。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述基于L型脫氧核酶生物體系中金屬離子的檢測(cè)試劑盒中含有L-DNAzyme。所 述DNAzyme的序列包括酶鏈序列和底物鏈序列；所述酶鏈序列如SEQ ID NO. 1所示，所述底 物鏈序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 所述檢測(cè)生物體系中金屬離子的方法是將特異性識(shí)別金屬離子的D-DNAzyme序 列直接轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-DNAzyme，然后用L-DNAzyme進(jìn)行金屬離子的檢測(cè)。所述DNAzyme的序列 包括酶鏈序列和底物鏈序列；所述酶鏈序列如SEQIDNO. 1所示，所述底物鏈序列如SEQ IDN0. 2所示。所述用L-DNAzyme進(jìn)行金屬離子的檢測(cè)是將L-DNAzyme加入緩沖液中，配 成L-DNAzyme濃度為50nM的檢測(cè)溶液，在熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)檢測(cè)溶液的反應(yīng) 體積為 200yL。所述緩沖液包括以下成分：50mMNaCl，50mMKCl，5mMMgCl2,50mMHEPES， pH7. 2或pH6. 65,具體來(lái)說(shuō)，用于Pb(II)離子傳感時(shí)包括以下成分：50mMNaCl，50mM KC1，5mMMgCl2, 50mMHEPES，pH7· 2 ;在血清中檢測(cè)時(shí)，緩沖液鹽離子組分相同，pH6· 65,血 清濃度為10%。在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中對(duì)Pb(II)的檢測(cè)靈敏度為0. 7ηΜ，血清中為50ηΜ。
[0008] 下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0009] 本發(fā)明將特異性識(shí)別金屬離子的D-DNAzyme序列直接轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-DNAzyme，根 據(jù)手性底物特異性相關(guān)原理，該L-DNAzyme同樣能夠識(shí)別對(duì)應(yīng)的金屬離子，同時(shí)，結(jié)合 L-DNAzyme不會(huì)被生物基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)生物體系中金屬離子的定量分析。該L-DNAzyme能夠 抵抗生物基質(zhì)中各組分的干擾，避免假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生，是用于生物體系中金屬離子檢測(cè) 與成像的傳感器。信號(hào)分子可以為FAM和Dabcyl，不存在金屬離子時(shí)，標(biāo)記在DNAzyme上的 FAM基團(tuán)發(fā)出的熒光被Dabcyl淬滅，存在特定金屬離子時(shí)底物鏈斷裂，發(fā)出熒光信號(hào)。
[0010] 本發(fā)明包括如下內(nèi)容：（1)根據(jù)已經(jīng)報(bào)告的對(duì)金屬離子特異性響應(yīng)的D-DNAzyme 序列，設(shè)計(jì)合成出有熒光-淬滅基團(tuán)標(biāo)記的L-DNAzyme熒光探針（使用DNA/RNA自動(dòng)合成 儀合成L-DNAzyme序列）；（2)證明L-DNAzyme具有對(duì)金屬離子依賴的催化能力，并構(gòu)建 緩沖液中L-DNAzyme對(duì)金屬離子的檢測(cè)體系（使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行考察，反應(yīng)體積為 200μL，DNAzyme濃度為50nM) ; (3)使用核酸酶、單鏈結(jié)合蛋白等具有代表性的生物基質(zhì)干 擾物，證明L-DNAzyme不會(huì)受到生物基質(zhì)的干擾；（4)提取血清，構(gòu)建中金屬離子的檢測(cè)體 系（使用的血清濃度為10%，使用前進(jìn)行無(wú)機(jī)酸消解）。（2) - (5)中金屬離子參與的實(shí)驗(yàn)， 反應(yīng)時(shí)間均為30min。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0012] 首先，本發(fā)明是在手性底物特異性相關(guān)原理上的一個(gè)創(chuàng)新，證明了非手性物質(zhì)在 對(duì)A物質(zhì)響應(yīng)的同時(shí)，也會(huì)對(duì)A的鏡像A'起到同樣的響應(yīng)效果；
[0013] 其次，本發(fā)明不需要篩選、設(shè)計(jì)新的金屬離子傳感器，只需把已經(jīng)篩選出的 D-DNAzyme序列合成出L-DNAzyme序列即可，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、快捷；
[0014] 第三，借助于L-DNA能夠抵抗生物基質(zhì)干擾的優(yōu)良性能，該方法能夠用于生物體 系中金屬離子的檢測(cè)，解決了D-DNAzyme在生物體系中易被降解、干擾的困難；
[0015] 第四，本發(fā)明具有通用性，不僅對(duì)DNAzyme有特定響應(yīng)能力的金屬離子適應(yīng)，其他 能夠?qū)NA有特定識(shí)別能力的非手性物質(zhì)，同樣適用于該方法。鑒于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、方法通用、 穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，我們提出的基于L-DNAzyme用于金屬離子的定量檢測(cè)方法有 可能發(fā)展成為普及的金屬離子定量檢測(cè)工具。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1A為本發(fā)明原理圖。當(dāng)特異性的金屬離子能夠催化D-DNAzyme的活性，切斷底 物鏈時(shí)，該金屬離子同樣能夠催化相對(duì)應(yīng)的L-DNAzyme發(fā)生同樣的活性。而D-DNAzyme易 被生物體系中各種生物學(xué)基質(zhì)干擾時(shí)，L-DNAzyme能夠抵抗這些干擾，從而能夠發(fā)展生物體 系中穩(wěn)定的L-DNAzyme傳感器用于金屬離子的檢測(cè)。圖1B為L(zhǎng)-DNA以及D-DNA的結(jié)構(gòu)，兩 者呈鏡像關(guān)系。
[0017] 圖2A為鉛離子依賴的DNAzyme的序列及結(jié)構(gòu)。圖2B為其對(duì)鉛離子的響應(yīng)示意 圖。底物鏈上分別標(biāo)記了熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)，酶鏈上標(biāo)記了淬滅基團(tuán)。雙鏈雜交，熒光被 淬滅。鉛離子出現(xiàn)后，酶鏈切割底物鏈，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離，發(fā)出熒光信號(hào)，從而有效報(bào)告鉛離子 的存在。
[0018] 圖3B的插圖為聚丙稀酰胺凝膠電泳分析L-DNAzyme對(duì)底物鏈的切割活性。插 圖通道1不加鉛離子，通道2加入鉛離子，可以看到鉛離子的存在使得底物鏈被切斷。圖 3A為GR-5L-DNAzyme用于鉛離子的定量檢測(cè)。能夠?qū)崿F(xiàn)0. 72nM鉛離子的檢測(cè)。圖3