Tpmt基因多態(tài)性檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種ΤΡΜΤ基因多態(tài)性檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 疏噪呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine S-methyltransferase, ΤΡΜΤ)是一種催化疏噪呤 類藥物如6-疏噪呤（6-mercatopurine，6_MP)硫代甲基化的胞衆(zhòng)酶。6-疏噪呤用于急性 淋巴細(xì)胞性白血病、絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎等疾病的治療。在體內(nèi)6-MP代謝為硫鳥嘌 呤核苷酸（6-TGN)摻入DNA而發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)，但通過ΤΡΜΤ甲基化可生成無活性的代謝產(chǎn) 物。ΤΡΜΤ活性與6-ΜΡ的療效和毒性反應(yīng)相關(guān)，ΤΡΜΤ活性低則易引起6-TGN蓄積而產(chǎn)生毒 性反應(yīng)。
[0003] 研究顯示，患者體內(nèi)ΤΡΜΤ的遺傳多態(tài)性與嘌呤類藥物的療效和毒性有關(guān)，ΤΡΜΤ活 性呈三態(tài)分布，人群中約90%的個體為ΤΡΜΤ野生型的高酶活性者；10%的個體為ΤΡΜΤ雜 合子變異者，表現(xiàn)出中等酶活性；〇. 3 %的個體為ΤΡΜΤ純合子變異者，導(dǎo)致ΤΡΜΤ活性低或 無活性。ΤΡΜΤ雜合子變異者可耐受65%的6-ΜΡ標(biāo)準(zhǔn)劑量，純合子變異者僅能耐受5%~ 10%的標(biāo)準(zhǔn)劑量。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20余種ΤΡΜΤ基因突變，其中ΤΡΜΤ*2、ΤΡΜΤ*3Α和TPMT*3C最為 常見，占中等酶活性和低酶活性個體的90%以上。活性高的患者長期服用這類藥易產(chǎn)生耐 受性，可能增加復(fù)發(fā)率；活性低的患者即使使用常規(guī)劑量的硫嘌呤類藥物，也會增加發(fā)生嚴(yán) 重的血液學(xué)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，甚至?xí)?dǎo)致患者死亡。因此，在接受6-MP治療前，患者應(yīng)該先 接受ΤΡΜΤ基因分型檢測，非野生型患者應(yīng)盡量避免6-MP藥物的使用，從而預(yù)防嚴(yán)重毒副作 用的發(fā)生。
[0004] ΤΡΜΤ基因多態(tài)性檢測信息如下表所示：
[0005] 表1 :ΤΡΜΤ基因多態(tài)性檢測信息
[0007] 隨著人類醫(yī)學(xué)和藥物研究水平的提高，藥理遺傳學(xué)（Pharmacogenetics)日漸興 起。研究表明，藥物在體內(nèi)的代謝、藥物治療的有效性以及副反應(yīng)、甚至患者的預(yù)后都存在 個體差異，受患者基因背景的影響。因此，應(yīng)用藥理遺傳學(xué)，在基因水平上研究藥物作用的 個體差異，使得個性化治療這一新一代醫(yī)學(xué)概念成為可能。對藥物作用相關(guān)基因的檢測，可 指導(dǎo)醫(yī)生對患者準(zhǔn)確施藥，規(guī)避藥物副作用，同時提高病人乃至社會的醫(yī)療費(fèi)用效率。
[0008] 熒光定量PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā) 展起來的一種更靈敏、更特異、更精確的核酸檢測技術(shù)。檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動態(tài)反 應(yīng)患者治療前、后病原體動態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個過程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處 理的問題，減少了污染。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴(kuò)增儀， 熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號， 通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實(shí)時反映 PCR的每個循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過軟 件自動分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)（即Ct值）以及擴(kuò)增曲線的 形狀，可以判斷陰陽性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通 過軟件自動分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對未知樣本的定值（即定量檢測）。與傳統(tǒng)的PCR 相對比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針 結(jié)構(gòu)完整時，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過程 中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán) 與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號被 熒光檢測裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試 驗(yàn)結(jié)束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽性結(jié)果和樣本濃 度的定值結(jié)果。隨著熒光PCR技術(shù)的發(fā)展，其在TPMT基因突變診斷領(lǐng)域的應(yīng)用已越來越廣 泛，也越來越為人所重視，TPMT基因突變的實(shí)驗(yàn)診斷中，實(shí)時熒光PCR技術(shù)憑借著快速、敏 感、特異等優(yōu)點(diǎn)顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性。
[0009] 等位基因特異PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3 - 5外切酶活 性，在一定條件下PCR引物3末端的錯配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，設(shè)計(jì) 適當(dāng)?shù)囊锟梢酝ㄟ^PCR方法直接達(dá)到區(qū)分突變型和野生型基因的目的。
[0010] 目前，國內(nèi)尚無基于實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)與ARMS-PCR技術(shù)檢測TPMT基因多態(tài) 性檢測的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測中，因此，TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒的研究具有重要意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供了一種操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬的TPMT基因 多態(tài)性檢測試劑盒，應(yīng)用該試劑盒，可以對臨床血液樣本中的TPMT基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢 測。
[0012] 本發(fā)明提供一種TPMT基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述TPMT基因多態(tài)性 檢測試劑盒包括PCR反應(yīng)液，其中，所述PCR反應(yīng)液包括G238C檢測反應(yīng)液、G238G檢測反應(yīng) 液、G460A檢測反應(yīng)液、G460G檢測反應(yīng)液、A719G檢測反應(yīng)液和A719A檢測反應(yīng)液，且上述 6種檢測反應(yīng)液均包括用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。
[0013] 優(yōu)選的，所述G238C檢測反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列 為：
[0014] 上游引物：5' -GTAAATGTATGATTTTATGCAGGTGTC-3' ；
[0015] 下游引物：5 ' -TCTGAGTAAGAAAGATTCTGCTCTGTAA-3 '。
[0016] 優(yōu)選的，所述G238G檢測反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列 為：
[0017] 上游引物：5' -GTAAATGTATGATTTTATGCAGGTCTG-3' ；
[0018] 下游引物：5 ' -TCTGAGTAAGAAAGATTCTGCTCTGTAA-3 '。
[0019] 優(yōu)選的，所述G238C檢測反應(yīng)液和G238G檢測反應(yīng)液中所述用于靶多核苷酸檢測 的探針的堿基序列均為：5' FAM-ACCGGGGACACAGTGTAGTTGGTGTG-BHQ13'。
[0020] 優(yōu)選的，所述G460A檢測反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列 為：
[0021] 上游引物：5' -TGACATGATTTGGGATAGAGCAA-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' -CCTATTTCAAACTCATAGAAGTCTAAGC-3 '。
[0023] 優(yōu)選的，所述G460G檢測反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列 為：
[0024] 上游引物：5 ' -TGACATGATTTGGGATAGAGCAG-3 ' ；
[0025] 下游引物：5 ' -CCTATTTCAAACTCATAGAAGTCTAAGC-3 '。
[0026] 優(yōu)選的，所述G460A檢測反應(yīng)液和G460G檢測反應(yīng)液中所述用于靶多核苷酸檢測 的探針的堿基序列均為：5' FAM-TAGTTGCCATCAATCCAGGTGATCGC-BHQ13'。
[0027] 優(yōu)選的，所述A719G檢測反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列 為：
[0028] 上游引物：5 ' -TGTCTCATTTACTTTTCTGTAAGGACAC-3 ' ；
[0029] 下游引物：5 ' -GTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTT-3 '。
[0030] 優(yōu)選的，所述A719A檢測反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物的堿基序列 為：
[0031] 上游引物：5' -TGTCTCATTTACTTTTCTGTAAGGACAT-3' ；
[0032] 下游引物：5 ' -GTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTT-3 '。
[0033] 優(yōu)選的，所述A719G檢測反應(yīng)液和A719A檢測反應(yīng)液中所述用于靶多核苷酸檢測 的探針的堿基序列均為：5' FAM-AAGACAGTCAATTCCCCAACTI