一種nk細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是設(shè)及一種NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】 陽002]自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercell,NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫 瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā) 生。
[0003] 細(xì)胞治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的有一種腫瘤治療方法，它一般作為手術(shù)、放 化療的輔助手段，延長(zhǎng)患者的壽命，清除體內(nèi)手術(shù)后殘余的癌細(xì)胞。細(xì)胞治療主要包括NK 細(xì)胞治療、CTL細(xì)胞治療、CIK細(xì)胞治療W及LAK細(xì)胞治療等。
[0004] NK細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不只消滅細(xì)菌和病毒感染，還能消滅癌細(xì)胞或腫 瘤。因此NK細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于腫瘤癌癥的臨床治療。目前，NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)多為 二維培養(yǎng)，即把NK細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，添加諸如X-VIVO15免疫細(xì)胞培養(yǎng)基W及加入一 些因子組合誘導(dǎo)NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。然而，臨床上采用NK細(xì)胞治療腫瘤時(shí)，需要NK細(xì)胞的 量較高，而普通的NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法擴(kuò)增的數(shù)量有限，很難達(dá)到臨床回輸?shù)囊?；同時(shí) 所誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞中表面抗原表達(dá)水平（CD3-、CD56+)比較低，細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的毒性效 果不高。因此，必需尋找用另一種能增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖活性，最好同時(shí)能增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺 傷能力的免疫細(xì)胞培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法能 夠顯著提高NK細(xì)胞的數(shù)量。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法能夠 顯著提高NK細(xì)胞表面抗原CD3-/CD56+的表達(dá)水平，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[000引一種NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括：
[0009] 步驟1、制備細(xì)胞=維培養(yǎng)載體；
[0010] 步驟2、從外周血分離出單個(gè)核細(xì)胞并接種到步驟1中的載體中，同時(shí)補(bǔ)加IL-2、 比-15、比-21W及0KT-3因子誘導(dǎo)培養(yǎng)，定期補(bǔ)液。
[0011] 本發(fā)明主要引入了細(xì)胞S維培養(yǎng)的技術(shù)思維來解決現(xiàn)有免疫細(xì)胞NK細(xì)胞的技術(shù) 問題，=維培養(yǎng)是指將具有=維結(jié)構(gòu)的載體與各種不同的種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，使 細(xì)胞能夠在載體的=維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng)，構(gòu)成=維的細(xì)胞載體復(fù)合物。
[0012] 二維細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往 和體內(nèi)情況不相符；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雖在體內(nèi)進(jìn)行，但體內(nèi)多種因素制約W及體內(nèi)和外界環(huán)境相 互影響而不能觀察到研究者最為關(guān)屯、的中間過程。因此，現(xiàn)有技術(shù)提出了=維細(xì)胞培養(yǎng)技 術(shù)模擬體內(nèi)的微環(huán)境，填補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的鴻溝，主要用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理論 研究，但是將其用于提高免疫細(xì)胞的增殖活性W及殺傷活性還未見報(bào)道。而本發(fā)明針對(duì)現(xiàn) 有NK細(xì)胞培養(yǎng)方式的缺點(diǎn)，將細(xì)胞S維培養(yǎng)載體引入NK細(xì)胞的培養(yǎng)中，利用載體進(jìn)行NK 細(xì)胞的S維培養(yǎng)，同時(shí)配合適宜的細(xì)胞因子，由此促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，W及提高其表面抗 原CD3-/CD56+的表達(dá)水平，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力。
[0013] 在本發(fā)明中，所述步驟1具體為：
[0014] 用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞=維培養(yǎng)載體材料，于細(xì)胞培養(yǎng)容器中解育包被，獲 得細(xì)胞=維培養(yǎng)載體。所述細(xì)胞=維培養(yǎng)載體材料是該領(lǐng)域經(jīng)常用到的具有=維結(jié)構(gòu)的載 體材料。
[0015] 其中，作為優(yōu)選，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基為X-VIVO 15培養(yǎng)液；所述具有S維結(jié)構(gòu)的 載體材料為Matrigel基質(zhì)；所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞S維培養(yǎng)載體材料的體積比為 5:1 ;所述各因子的濃度為：100~lOOOU/mL比-2、10~lOOng/mL比-15、10~lOOng/mL a-21、50~100ng/mL0KT-3。
[0016] 本發(fā)明優(yōu)選地的載體材料Matrigel基質(zhì)是從富含胞外基質(zhì)蛋白的邸5小鼠腫瘤 中提取出基底膜基質(zhì)，其主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，還包 含生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等，市售可得。在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物 學(xué)活性的=維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，有利于體外細(xì)胞 的培養(yǎng)和分化，可用于對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生化功能、遷移、侵染和基因表達(dá)等的理論研究。
[0017] 作為一個(gè)整體的優(yōu)選方案，所述步驟1為： 陽0化]混勻Matrigel基質(zhì)成勻漿狀，用X-VIVO 15培養(yǎng)液按X-VIVO 15培養(yǎng)液：Matrigel基質(zhì)=5:1的體積比稀釋Matrigel基質(zhì)，將稀釋的Matrigel基質(zhì)包被于T75培 養(yǎng)瓶中，室溫下解育1小時(shí)，用X-VIVO 15培養(yǎng)液沖洗，去除未結(jié)合的Matrigel基質(zhì)，獲得 細(xì)胞=維培養(yǎng)載體。
[0019] 同時(shí)，本發(fā)明所述外周血分離出單個(gè)核細(xì)胞可參照本領(lǐng)域已有的分離方法，本發(fā) 明優(yōu)選為：
[0020] 外周血加生理鹽水稀釋，加入到淋己分離液上層，離屯、，然后用己氏吸管吸取單個(gè) 核細(xì)胞，清洗、離屯、、重懸，分離得到單個(gè)核細(xì)胞懸液。
[0021] 更進(jìn)一步優(yōu)選為：
[0022] 把抽取的人外周血用生理鹽水對(duì)血液進(jìn)行1:1稀釋并混合均勻，獲得血液稀釋 液；
[0023] 另取離屯、管，加入淋己細(xì)胞分離液，把混勻的血液稀釋液緩慢沿管壁加入淋己細(xì) 胞分離液上層，注意不要沖破分離液層（淋己細(xì)胞分離液：血液稀釋液為1 :2體積比）；
[0024] 放入冷凍離屯、機(jī)中，3000巧m/min離屯、30min。 陽0巧]離屯、結(jié)束后，用己氏吸管吸取單個(gè)核細(xì)胞并用生理鹽水清洗，再次離屯、，用免疫細(xì) 胞培養(yǎng)基（優(yōu)選X-VIVO 15培養(yǎng)液）重懸細(xì)胞，獲得單個(gè)核細(xì)胞懸液。
[00%] 作為優(yōu)選，步驟2所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為在37°C、5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)14天。
[0027] 作為優(yōu)選，所述單個(gè)核細(xì)胞的接種密度為1 XIO6Cel1/mL。
[0028] W本發(fā)明所述方法進(jìn)行NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，相對(duì)于現(xiàn)有的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，本發(fā)明 能夠?qū)K細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到1〇9數(shù)量級(jí)，而現(xiàn)有技術(shù)中的NK細(xì)胞量為10S數(shù)量級(jí)，活力也高 于現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的NK細(xì)胞，而且本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞中CD3-/CD56+的表達(dá)水平為 85. 6%，現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的NK細(xì)胞表達(dá)水平為74. 4%，同時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性上也顯著 高于現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的NK細(xì)胞。
[0029] 由W上技術(shù)方案可知，本發(fā)明在NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)引入了細(xì)胞S維培養(yǎng)載體進(jìn) 行誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時(shí)配合細(xì)胞因子的加入，由此解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法擴(kuò)增的數(shù)量有限、表面抗 原CD3-/CD56+的表達(dá)水平較低、細(xì)胞殺傷活性不高的問題，滿足臨床上對(duì)于NK細(xì)胞的需 求。
【附圖說明】
[0030] 圖1所示為NK細(xì)胞的鏡檢圖，其中A為現(xiàn)有對(duì)照方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞的鏡檢 圖，B為本發(fā)明方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞鏡檢圖；
[0031] 圖2所述為NK細(xì)胞表面抗原CD3-/CD56+表達(dá)水平的流式檢測(cè)圖，其中A為現(xiàn)有 對(duì)照方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞表面抗原表達(dá)水平圖，B為本發(fā)明方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞表 面抗原表達(dá)水平圖；
[0032] 圖3所示為現(xiàn)有對(duì)照方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞對(duì)K562殺傷活性折線圖；
[0033] 圖4所示為本發(fā)明方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞對(duì)K562殺傷活性折線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例公開了一種NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。本