一種cik細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是設(shè)及一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CIK細(xì)胞（巧tokinein化cedkiller,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）是一種新型 的免疫活性細(xì)胞，它是自體外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)多種細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的一類 CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子共同表達(dá)的殺傷細(xì)胞。CIK細(xì)胞具有抗腫瘤活性和非MHC殺 瘤特性，是一種具有增殖速度快，殺瘤活性高，殺瘤譜廣等特點(diǎn)的效應(yīng)細(xì)胞。
[0003] 現(xiàn)有誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞的方法一般為從外周血分離得到的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)在 白介素-2(比-2)等細(xì)胞因子的作用下在37°C、5%二氧化碳的條件下直接誘導(dǎo)成CIK細(xì)胞。 但是運(yùn)種方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞中含有數(shù)量較多的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0004] 1995年Sakaguchi發(fā)現(xiàn)成年鼠中近10%的外周CD4巧細(xì)胞表達(dá)IL-2受體α鏈 CD25。去除運(yùn)群細(xì)胞會(huì)引起小鼠自發(fā)產(chǎn)生多種自身免疫性疾病而回輸該細(xì)胞則阻止疾病的 發(fā)生。因此將運(yùn)群細(xì)胞命名為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Τ細(xì)胞Treg。 陽(yáng)0化]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞燈reg)是抑制性T細(xì)胞的一種功能亞群，天然的化eg細(xì)胞于1995 年由Sakafguchi等首次報(bào)道，他們約占外周血CD4巧細(xì)胞數(shù)的5% -10%左右。
[0006] 調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞分為兩類：天然Treg細(xì)胞和獲得性Treg細(xì)胞，目前認(rèn)為天然 Treg細(xì)胞來自于胸腺，主要通過細(xì)胞接觸抑制發(fā)揮抑制功能；獲得性Treg細(xì)胞是外周血成 熟T細(xì)胞在持續(xù)抗原的刺激和細(xì)胞因子條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要通過TGF-β、比-10等可溶性 細(xì)胞因子發(fā)揮作用。
[0007] 近年來，許多學(xué)者對(duì)Treg細(xì)胞在腫瘤免疫方面大量的研究證實(shí)，肝癌、肺癌、卵巢 癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌、急慢性淋己細(xì)胞白血病、惡性淋己瘤、鼻咽癌等患者外周血或腫瘤 局部Treg細(xì)胞成分顯著增加。在對(duì)結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期癌較早期癌患者外周血 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著增加。在對(duì)肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肝癌組織較旁組織Treg細(xì)胞明顯增加， 運(yùn)些分布方式說明，在腫瘤組織中的Treg由于與效應(yīng)細(xì)胞T淋己細(xì)胞的緊密接觸，抑制效 應(yīng)細(xì)胞的功能，從而發(fā)揮腫瘤免疫作用。因此，為了使免疫細(xì)胞治療，如CIK細(xì)胞治療，發(fā)揮 最大的免疫作用，故尋求一種降低CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)方法非常 必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法 能夠顯著降低CIK細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法顯著 提高誘導(dǎo)培養(yǎng)出的CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法顯著 提高誘導(dǎo)培養(yǎng)出的CIK細(xì)胞的殺傷活性。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法提高 誘導(dǎo)培養(yǎng)出的CIK細(xì)胞分泌TGF-β和IL-10的能力。
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0013] 一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括：
[0014] 步驟1、用抗CD8抗體包被細(xì)胞培養(yǎng)容器；
[0015] 步驟2、將單個(gè)核細(xì)胞用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸并接種在步驟1包被好的容器中，添 加IFN-λ細(xì)胞因子于39°C下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；
[0016] 步驟3、培養(yǎng)后去掉培養(yǎng)基并再次加入新鮮的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，并轉(zhuǎn)移至新的 容器中，添加IFN-λ、比-1α、0KT-3W及比-2細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，定期補(bǔ)充新鮮 培養(yǎng)基和IL-2細(xì)胞因子。
[0017] 針對(duì)現(xiàn)有CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法誘導(dǎo)的細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Τ細(xì)胞數(shù)量較 高、效應(yīng)細(xì)胞較少、殺傷活性不高W及分泌TGF-β和IL-10能力不高的一系列問題，本發(fā)明 在前期將單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)在抗CD8抗體包被的容器中，并添加適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子和提高細(xì)胞 培養(yǎng)溫度，而后期培養(yǎng)添加多種適宜細(xì)胞因子進(jìn)行CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，才能夠多個(gè)措施 入手降低CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Τ細(xì)胞數(shù)量。
[0018] 其中，作為優(yōu)選，所述單個(gè)核細(xì)胞采用Ficoll分離液運(yùn)用S巧mate離屯、管從外周 血分離獲得。除此之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參照已公開的單個(gè)核細(xì)胞分離方法。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟2所述IFN-λ細(xì)胞因子的濃度為500-1500U/I止，具體可W選擇 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400 或 1500U/mL。
[0020] 作為優(yōu)選，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基為X-VIV0 15培養(yǎng)基。
[0021] 作為優(yōu)選，所述單個(gè)核細(xì)胞接種W5Xl〇5-10X1〇5個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種。
[0022] 作為優(yōu)選，步驟3所述各細(xì)胞因子濃度為500-1500U/mLIFN-λ、50-150U/mL的 比-Ια、10-50ng/ml的ΟΚΤ-3W及l(fā)OO-lOOOU/ml的比-2。其中，IFN-λ具體可W選擇 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或 1500U/mL;IL-1α具體可W選擇50、 75、100、125 或 150U/mL;0ΚΤ-3 具體可W選擇 10、20、30、40 或 50ng/ml;比-2 具體可W選擇 100、200、300、400、500、550、600、700、800、900 或lOOOU/ml。
[0023] 作為優(yōu)選，步驟3所述誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞為在37°C、5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)14天。
[0024] 作為優(yōu)選，步驟2所述培養(yǎng)為在39°C、5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)12-2地。 陽(yáng)0巧]作為優(yōu)選，所述細(xì)胞培養(yǎng)容器為細(xì)胞培養(yǎng)瓶，例如T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。 陽(yáng)0%] 按照本發(fā)明方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞其CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量為3.6%， 而現(xiàn)有的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量為6. 7%，明顯得到降低，從而降低 了CIK細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制作用。同時(shí)，本發(fā)明誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞中 效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量為34. 3%，而現(xiàn)有的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法中效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量為20.8%，顯著提高效 應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。
[0027] 此外，本發(fā)明還對(duì)所誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞進(jìn)行了殺傷活性檢測(cè)W及TGF-β和IL-10含 量檢測(cè)，雖然本發(fā)明改變了誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，但是CIK細(xì)胞的殺傷活性和分泌TGF-β和IL-10 含量并未受到影響，且高于現(xiàn)有的CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
[0028] 由W上技術(shù)方案可知，本發(fā)明增加單個(gè)核細(xì)胞在抗CD8抗體中培養(yǎng)的環(huán)節(jié)，并 調(diào)整誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)節(jié)中細(xì)胞因子的加入，從多個(gè)方面整體控制誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程，抑制了 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Τ細(xì)胞的產(chǎn)生，降低了其數(shù)量進(jìn)而降低了其免疫抑制作用，使CIK細(xì)胞治 療發(fā)揮最大的免疫作用。
【附圖說明】
[0029] 圖1所示本發(fā)明所述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后CIK細(xì)胞的鏡檢圖；
[0030] 圖2所示為CIK細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞W及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果；其 中A為本發(fā)明誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的流式檢測(cè)圖，B為現(xiàn)有方法誘導(dǎo) 的CIK細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的流式檢測(cè)圖，C為本發(fā)明誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞 的流式檢測(cè)圖，D為現(xiàn)有方法誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞的流式檢測(cè)圖；
[0031] 圖3所示為TGF-β標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值曲線；
[0032] 圖4所示為比-10標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 本發(fā)明實(shí)施例公開了一種CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本 文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例 進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本【發(fā)明內(nèi)