出EGF峰，該樣品峰W20mMTris-肥1pH7. 6緩沖液稀 釋 10 倍后上樣于Q-se地aroseHi曲Performance柱，Wa液（20mMTris-肥 1 抑7. 6)至 B液（20mMTris-肥1pH7. 6,0.SMNaCU梯度洗脫方法收集EGF峰，最后用分子篩Superdex 30柱純化重組hEGF蛋白，純度達(dá)98. 5 %。 陽0川實(shí)施例2:
[0052] 重組人表皮生長因子原液制備方法，包括W下步驟：
[005引 1)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：由W下重量比例成分制成：
[0054] 甘油： 7.谷後、 酵母堿基（YNB) 3. 0%. 微星金屬窩子； .2.激〇、. 物隸 1.0%、 促進(jìn)劑 0.島豁、 水 '余曇:； 陽化5] 所述微量金屬離子為氯化巧；
[0056] 用憐酸鹽緩沖液調(diào)抑為6. 5;
[0057] 所述促進(jìn)劑采用W下方法制備：
[0058] ①原料處理：將積雪草和金銀花按照等重混合、洗凈、干制、粉碎；
[0059] ②蒸汽爆破處理：將步驟①得到的物料放入蒸汽爆破罐，體積相當(dāng)于蒸汽爆破罐 體積的1/4,爆破壓力3. 5Mpa，保壓時間維持在180s;
[0060] ③蒸饋處理：將步驟②得到的物料放入蒸饋器，在蒸饋器底部，加熱燃燒或通入蒸 汽，當(dāng)炙熱的蒸氣充滿在蒸饋器里，水蒸氣通過冷凝管，被引入冷凝器內(nèi)，再通過油水分離 器，收集精油；
[0061] ④高剪切均質(zhì)機(jī)處理：將步驟③得到的精油通過高剪切均質(zhì)機(jī)處理，線速度35m/ S，時間4min，制成納米乳，并用微孔濾膜過濾除菌得到；
[0062] 2)發(fā)酵、表達(dá)：應(yīng)用化搖瓶及2化原位滅菌發(fā)酵罐培養(yǎng)遺傳工程菌株，W10%培 養(yǎng)基接種后，添加誘導(dǎo)劑1. 5%，30°C培養(yǎng)，控制抑7. 0,氧飽和度10 %，攬拌17化pm，罐壓 0. 03445MPa，流加甘油至每L濕菌達(dá)200g后流加甲醇保持其濃度為1 %W進(jìn)行EGF的誘導(dǎo) 表達(dá)；
[0063] 3)分離：表達(dá)結(jié)束，離屯、分離，既得重組克隆菌株離屯、液；
[0064] 4)純化：將步驟3)得到的重組克隆菌株離屯、液，加入硫酸錠使?jié)舛瘸?.5M，上樣 于用5倍柱體積量的20mM憐酸緩沖液抑7. 0,0. 5M硫酸胺溶液平衡過的疏水柱（Phenyl Se地arose6FastFlow(hi曲sub)柱），W20mM憐酸緩沖液抑7. 0,0. 5M硫酸胺將進(jìn)樣峰 洗至基線，W20mM憐酸緩沖液洗脫出EGF峰，該樣品峰W20mMTris-肥1pH7. 6緩沖液稀 釋 10 倍后上樣于Q-se地aroseHi曲Performance柱，Wa液（20mMTris-肥 1 抑7. 6)至 B液（20mMTris-肥1pH7. 6,0.SMNaCU梯度洗脫方法收集EGF峰，最后用分子篩Superdex 30柱純化重組hEGF蛋白，純度達(dá)99. 1 %。 W65] 實(shí)施例3 :
[0066] 重組人表皮生長因子原液制備方法，包括W下步驟：
[0067] 1)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：由W下重量比例成分制成：
[0068] 書由； 目.0%、
[0069] 酵母堿基（YNB) 3.44%、 微量金屬離子： 2.0%、 '1;物崇 1.0%、 促進(jìn)劑 0呈 水 余量；
[0070] 所述微量金屬離子為硫酸銅；
[0071] 用憐酸鹽緩沖液調(diào)pH為6.0 ;
[0072] 所述促進(jìn)劑采用W下方法制備：
[0073] ①原料處理：將積雪草和金銀花按照等重混合、洗凈、干制、粉碎；
[0074] ②蒸汽爆破處理：將步驟①得到的物料放入蒸汽爆破罐，體積相當(dāng)于蒸汽爆破罐 體積的1/3,爆破壓力3.OMpa,保壓時間維持在150s;
[0075] ③蒸饋處理：將步驟②得到的物料放入蒸饋器，在蒸饋器底部，加熱燃燒或通入蒸 汽，當(dāng)炙熱的蒸氣充滿在蒸饋器里，水蒸氣通過冷凝管，被引入冷凝器內(nèi)，再通過油水分離 器，收集精油；
[0076] ④高剪切均質(zhì)機(jī)處理：將步驟③得到的精油通過高剪切均質(zhì)機(jī)處理，線速度40m/ S，時間5min，制成納米乳，并用微孔濾膜過濾除菌得到；
[0077] 2)發(fā)酵、表達(dá)：應(yīng)用化搖瓶及2化原位滅菌發(fā)酵罐培養(yǎng)遺傳工程菌株，W 10%培 養(yǎng)基接種后，添加誘導(dǎo)劑I. 8%，30°C培養(yǎng)，控制抑7.0,氧飽和度30%，攬拌16化pm，罐壓 0. 02067MPa，流加甘油至每L濕菌達(dá)300g后流加甲醇保持其濃度為1 %W進(jìn)行EGF的誘導(dǎo) 表達(dá)；
[0078] 3)分離：表達(dá)結(jié)束，離屯、分離，既得重組克隆菌株離屯、液；
[00巧]4)純化：將步驟3)得到的重組克隆菌株離屯、液，加入硫酸錠使?jié)舛瘸?. 5M，上樣 于用5倍柱體積量的20mM憐酸緩沖液抑7. 0,0. 5M硫酸胺溶液平衡過的疏水柱（Phenyl Se地arose6FastFlow(hi曲sub)柱），W20mM憐酸緩沖液抑7. 0,0. 5M硫酸胺將進(jìn)樣峰 洗至基線，W20mM憐酸緩沖液洗脫出EGF峰，該樣品峰W20mMTris-肥1pH7. 6緩沖液稀 釋 10 倍后上樣于Q-se地aroseHi曲Performance柱，Wa液（20mMTris-肥 1 抑7. 6)至 B液（20mMTris-肥1pH7. 6,0.SMNaCU梯度洗脫方法收集EGF峰，最后用分子篩Superdex 30柱純化重組hEGF蛋白，純度達(dá)98. 8 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組人表皮生長因子原液制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：由以下重量比例成分制成：所述微量金屬離子為三氯化鐵、氯化鈣、鉬酸鈉、氯化鋅、硫酸銅、硼酸、硫酸鋁中的一 種； 用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH為5. 5-6. 5 ; 所述促進(jìn)劑采用以下方法制備： ① 原料處理：將積雪草和金銀花按照等重混合、洗凈、干制、粉碎； ② 蒸汽爆破處理：將步驟①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破壓力3. 0-3. 5Mpa，保壓 時間維持在150-200s; ③ 蒸餾處理：將步驟②得到的物料放入蒸餾器，在蒸餾器底部，加熱燃燒或通入蒸汽， 當(dāng)炙熱的蒸氣充滿在蒸餾器里，水蒸氣通過冷凝管，被引入冷凝器內(nèi)，再通過油水分離器， 收集精油； ④ 高剪切均質(zhì)機(jī)處理：將步驟③得到的精油通過高剪切均質(zhì)機(jī)處理，線速度30-40m/ s，時間3-5min，制成納米乳，并用微孔濾膜過濾除菌得到； 2) 發(fā)酵、表達(dá)：應(yīng)用2L搖瓶及20L原位滅菌發(fā)酵罐培養(yǎng)遺傳工程菌株，以10%培養(yǎng) 基接種后，添加誘導(dǎo)劑，30°(：培養(yǎng)，控制？!17.0，氧飽和度10-50%，攪拌150-170印111，罐壓 0. 01378-0. 03445MPa，流加甘油至每L濕菌達(dá)100-300g后流加甲醇保持其濃度為1 %以進(jìn) 行EGF的誘導(dǎo)表達(dá)； 3) 分離：表達(dá)結(jié)束，離心分離，既得重組克隆菌株離心液； 4) 純化：將步驟3)得到的重組克隆菌株離心液，加入硫酸銨使?jié)舛瘸?.5M，上樣于用 5倍柱體積量的20mM磷酸緩沖液pH7. 0,0. 5M硫酸胺溶液平衡過的疏水柱，以20mM磷酸緩 沖液pH7. 0, 0. 5M硫酸胺將進(jìn)樣峰洗至基線，以20mM磷酸緩沖液洗脫出EGF峰，該樣品峰以 20mMTris-HClρΗ7· 6 緩沖液稀釋 10 倍后上樣于Q-sepharoseHighPerformance柱，以 A液（20mMTris-HClρΗ7·6)至B液（20mMTris-HClpH7.6,0.5MNaCl)梯度洗脫方法收集 EGF峰，最后用分子篩Superdex30柱純化重組hEGF蛋白，純度可達(dá)98%以上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長因子原液制備方法，其特征在于，步驟1)所 述培養(yǎng)基由以下重量比例成分制成：所述微量金屬離子為三氯化鐵、氯化鈣、鉬酸鈉、氯化鋅、硫酸銅、硼酸、硫酸鋁中的一 種； 用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH為6.0; 所述促進(jìn)劑采用以下方法制備： ① 原料處理：將積雪草和金銀花按照等重混合、洗凈、干制、粉碎； ② 蒸汽爆破處理：將步驟①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破壓力3. 0-3. 5Mpa，保壓 時間維持在150-200s; ③ 蒸餾處理：將步驟②得到的物料放入蒸餾器，在蒸餾器底部，加熱燃燒或通入蒸汽， 當(dāng)炙熱的蒸氣充滿在蒸餾器里，水蒸氣通過冷凝管，被引入冷凝器內(nèi)，再通過油水分離器， 收集精油； ④ 高剪切均質(zhì)機(jī)處理：將步驟③得到的精油通過高剪切均質(zhì)機(jī)處理，線速度30-40m/ s，時間3-5min，制成納米乳，并用微孔濾膜過濾除菌得到。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組人表皮生長因子原液制備方法，其特征在于：所述 積雪草、金銀花的使用量，粉碎后的體積相當(dāng)于蒸汽爆破罐體積的1/4-1/3。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長因子原液制備方法，其特征在于：步驟2)所 述誘導(dǎo)劑為甲醇，用量1.2-1. 8%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組人表皮生長因子原液制備方法，該培養(yǎng)基由以下重量比例成分制成：甘油5.0-7.0％、酵母堿基(YNB)3.0-3.5％、微量金屬離子1.8-2.2％、誘導(dǎo)劑1.2-1.8％、生物素0.5-1.0％、促進(jìn)劑0.5-1.0％、水余量；所述微量金屬離子為三氯化鐵、氯化鈣、鉬酸鈉、氯化鋅、硫酸銅、硼酸、硫酸鋁中的一種；用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH為5.5-6.5。本發(fā)明使用的植物原料成分經(jīng)過了蒸汽爆破、蒸餾、高剪切均質(zhì)機(jī)處理，得到納米乳狀的植物油性成分，和培養(yǎng)基中其他配方的相容性好。本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中添加植物原料成分作為促進(jìn)劑，和現(xiàn)有技術(shù)相比，發(fā)酵液的產(chǎn)量會提高30-38％。
【IPC分類】C12P21/02
【公開號】CN105296574
【申請?zhí)枴緾N201510843236
【發(fā)明人】韋忠明, 黃啟斌, 莫冬海, 馬沖, 包能創(chuàng), 楊輝
【申請人】桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月26日