專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組人apoE擬肽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物及應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種重組的人載脂蛋白E(apoE)模擬活性肽，同時(shí)涉及一種載脂蛋白E(apoE)擬肽的制備方法，還涉及一種載脂蛋白E(apoE)擬肽在治療和/或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化及其所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化是多種復(fù)雜的病因(氧化應(yīng)激、炎癥、血脂紊亂、高糖等)誘發(fā)下的血管壁功能失調(diào)，其特征是動(dòng)脈壁內(nèi)膜下脂質(zhì)聚積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括巨噬細(xì)胞泡沫化、平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的大量積聚，最后形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致血管管腔變 窄，彈性減少，影響動(dòng)脈血流，嚴(yán)重時(shí)完全堵塞血管或斑塊破裂、并發(fā)血栓栓塞，從而導(dǎo)致血流灌注的組織器官局部缺血，其并發(fā)癥或嚴(yán)重后果包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)心肌缺血造成心絞痛、心肌梗塞，腦動(dòng)脈和頸動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血造成中風(fēng)，外周循環(huán)或內(nèi)臟循環(huán)的動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的器官損傷(如腎動(dòng)脈狹窄造成繼發(fā)性高血壓)。動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈硬化在定義內(nèi)涵上有不同的病理特征，本發(fā)明中所指的動(dòng)脈粥樣硬化是由于動(dòng)脈粥樣斑塊使動(dòng)脈硬化或失去彈性，動(dòng)脈硬化是指任何一個(gè)或多個(gè)原因造成的動(dòng)脈硬化或失去彈性。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體血脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷及炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的基本病理過(guò)程主要為早期在氧化應(yīng)激及炎癥因素的刺激下，內(nèi)皮功能受損，內(nèi)皮細(xì)胞激活分泌黏附分子，使循環(huán)中單核細(xì)胞向受損內(nèi)膜下滲入、遷移，演變成巨噬細(xì)胞后，通過(guò)細(xì)胞因子的釋放、與其他細(xì)胞的相互作用參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，同時(shí)巨噬細(xì)胞自身攝取大量氧化低密度脂蛋白(LDL)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞而成為斑塊中心，故巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展全過(guò)程中扮演著多方面的重要角色。目前臨床上治療和/或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的推薦方案包括藥物防治和手術(shù)治療。藥物常以降脂/膽固醇為目的，具體的廣泛采用的是降低LDL-膽固醇(LDL-C)的藥物，包括他汀類(lèi)(statins)，HMGCoA還原酶抑制劑，消膽胺等降低膽固醇吸收的藥物，以及丙丁酚等。其次常采用的阿司匹林用于抑制血栓形成，抗氧化抗炎作用的藥物也被人們廣泛接受應(yīng)用。手術(shù)治療主要適用于動(dòng)脈粥樣硬化已產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥或后果的情況，如球囊成形術(shù)、內(nèi)膜切除術(shù)、內(nèi)置支架、血管搭橋術(shù)等介入治療手術(shù)。當(dāng)然，由于動(dòng)脈粥樣硬化所致的嚴(yán)重并發(fā)癥和后果，最好還是治療或控制危險(xiǎn)因素，如保證合理低脂、低膽固醇、清淡飲食，積極治療和控制高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、糖尿病、高血壓等相關(guān)疾病、注意經(jīng)常鍛煉、降低體重、改善心功能，增強(qiáng)心血管保護(hù)因素等。已證實(shí)高密度脂蛋白(HDL)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要負(fù)相關(guān)因素，HDL具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用涉及多種機(jī)制，包括促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、促進(jìn)一氧化氮產(chǎn)生、以及保護(hù)內(nèi)皮功能等。由于針對(duì)LDL-C的降脂治療仍存在心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性，且急、慢性炎癥狀態(tài)下，HDL功能的異常較HDL-膽固醇(HDL-C)濃度的改變更為突出，因此針對(duì)HDL功能的治療成為代謝性疾病和炎癥狀態(tài)下抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要途徑。在HDL眾多優(yōu)點(diǎn)中，介導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和抗炎兩個(gè)功能尤為重要，而且可能存在本質(zhì)上相互聯(lián)系。近年的研究表明HDL對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用可能部分是通過(guò)ABCAl和ABCGl介導(dǎo)的膽固醇外流實(shí)現(xiàn)的。目前增強(qiáng)HDL功能的藥物和HDL類(lèi)似物的研發(fā)在動(dòng)脈粥樣硬化治療上顯示了巨大的應(yīng)用前景。有研究證實(shí)他汀類(lèi)藥物治療就能糾正HDL的功能障礙，恢復(fù)其抗炎作用；傳統(tǒng)治療中的貝特類(lèi)藥物也能有效改善代謝性疾病中HDL顆粒的功能；目前已上市的或正在研發(fā)中的一系列HDL增強(qiáng)劑還包括尼克酸(niacin)、膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)抑制劑、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)激活劑、載脂蛋白Al (apoAI)表達(dá)刺激物、內(nèi)皮脂肪酶抑制劑、PPAR/LXR激動(dòng)劑以及HDL載脂蛋白或其類(lèi)似物。其中尼克酸因其明顯的升高HDL作用而成為最常規(guī)的一種，然而，其引起面色潮紅的不良反應(yīng)顯然限制了它的使用，并且其抗動(dòng)脈粥樣硬化和減少心血管疾病發(fā)生的效果還待考證。其他的治療劑也都在不同的改進(jìn)階段。 HDL是一種脂質(zhì)和蛋白含量大致均等的異質(zhì)性脂蛋白，組成包括多種載脂蛋白、甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯，其中載脂蛋白包括apo Al (占65-70%)，apO AU (20-25%),apo AIV, apo AV, apo C, apo D, apo E, apo J,等。目前已證實(shí)HDL主要有益作用可歸因于它主要的載脂蛋白apoAI和apoE，這促使研究者開(kāi)發(fā)apoAI、apoE或者它們的擬肽以增強(qiáng)HDL的功能。利用人全長(zhǎng)apoAI或其突變體apoAI-milano,無(wú)脂或與磷脂重構(gòu)的HDL,還有短的apoAI模擬肽開(kāi)發(fā)增強(qiáng)HDL功能和抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，都聚集了人們巨大的興趣，部分研發(fā)已在臨床試驗(yàn)中取得可喜效果。ApoE是HDL另一種主要的載脂蛋白，同時(shí)apoE也是其他脂蛋白包括極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒的成分，在脂蛋白代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的致病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用而使apoE成為一種多功能蛋白，其主要作用是介導(dǎo)循環(huán)中膽固醇的清除和血管壁巨噬細(xì)胞膽固醇的外流。它是apoE受體、LDL受體(LDLR)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)的配體，介導(dǎo)攝取脂蛋白殘粒促成肝臟對(duì)血漿膽固醇的清除。ApoE還通過(guò)其受體介導(dǎo)途徑下調(diào)血管壁巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)一步抑制與動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(細(xì)胞泡沫化、平滑肌細(xì)胞增殖等)。無(wú)論是游離的蛋白還是HDL顆粒的組分，apoE可促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、抗炎、抗平滑肌細(xì)胞增殖和激活HDL中LCAT活性等，從而實(shí)現(xiàn)HDL的部分功能，降低或減輕了動(dòng)脈粥樣斑塊的形成，達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的效果。人血漿中apoE濃度平均為5mg/dL。apoE主要由肝臟產(chǎn)生，也有極少量可由血管壁局部的巨噬細(xì)胞分泌，在動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)由血管壁巨噬細(xì)胞分泌的apoE可顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，即使低apoE濃度改變不了血漿中高膽固醇水平。例如，apoE基因缺陷型(apoE+)小鼠被認(rèn)為是高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的典型動(dòng)物模型，早在1995年，Linton和Fazio等就報(bào)道了利用骨髓移植技術(shù)使apoE+小鼠獲得野生型小鼠能分泌apoE的巨噬細(xì)胞，其結(jié)果可顯著降低apoE+小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成；而野生型小鼠的巨噬細(xì)胞如更換為apoE+鼠的巨噬細(xì)胞，則加速動(dòng)脈粥樣硬化改變，即使不影響肝臟合成主要的apoE。申請(qǐng)者也曾證實(shí)，補(bǔ)償性給予巨卩遼細(xì)胞源性的apoE,可有效改善apoE和SRBI雙基因敲除鼠的高脂血癥并緩解動(dòng)脈粥樣硬化病程，避免其早發(fā)性心衰及幼年夭折。另外apoE在體內(nèi)具有再循環(huán)功能，apoE以乳糜微粒的形式被肝細(xì)胞吞噬，隨后一直分離，游離的apoE在胞內(nèi)與新合成的apoAI結(jié)合后，胞吐進(jìn)入血循環(huán)系統(tǒng)成為HDL的重要組分，隨著HDL的成熟，apoE從HDL中脫落再次與乳糜微粒結(jié)合而循環(huán),該機(jī)制為apoE的革巴向性治療提供非常有益的生物特性，可延長(zhǎng)生物半衰期，增加載脂蛋白的功能，這使得人們相信apoE是一類(lèi)有前景的體內(nèi)HDL功能增強(qiáng)劑，有望成為一種理想的防治動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。研究顯示人類(lèi)apoE基因具有多態(tài)性，可分別表達(dá)出3種異構(gòu)體apoE2、apoE3和apoE4，其中ε 3為野生型基因，占總基因70%-80%， ε2和ε 4則為異構(gòu)體基因，分別占5% -10%和10% -15%，人群中約14%個(gè)體的血漿膽固醇升高就源于apoE的基因多態(tài)性即表達(dá)的功能異構(gòu)體。野生型apoE3肽段的112位為半胱氨酸(Cys)殘基、158位為精氨酸(Arg)殘基，apoE2則112位和158位均為Cys, E4的112位和158位均為Arg。異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致apoE2、apoE4在體內(nèi)代謝速率或受體結(jié)合力與apoE3明顯不同，而表現(xiàn)出血膽固醇水平的升高。大量研究均已證實(shí)，存在apoE基因突變型異構(gòu)體的人群中，其內(nèi)源性apoE功能降低或異構(gòu)體是發(fā)生或易感動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’ sdisease)等相關(guān)疾病的重要因素。ApoE按基本功能可分為氨基端(N末端)(第1-191氨基酸殘基)區(qū)域和羧基端(C末端)(第192-299氨基酸殘基)區(qū)域組成，包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，分別為L(zhǎng)DLR結(jié)合域和脂質(zhì)結(jié)合域，即4個(gè)螺旋束N端的負(fù)責(zé)結(jié)合LDLR和HSPG，C端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合脂質(zhì)和A β肽。apoE的N端呈球形結(jié)構(gòu)，其中第131-162位氨基酸肽段為L(zhǎng)DLR結(jié)合域，尤其結(jié)構(gòu)相對(duì)保守的第141-150位氨基酸肽段由一串帶正電荷的精氨酸(Arg)和賴(lài)氨酸(Lys)組成，可通過(guò)離子鍵與負(fù)電性的LDLR結(jié)合，被認(rèn)為是LDLR結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域肽段；C端結(jié)構(gòu)域的一個(gè)雙性α螺旋模序則是脂質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其第220 260氨基酸殘基的α螺旋首先與脂質(zhì)結(jié)合后，再引發(fā)N末端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變。這種脂質(zhì)引發(fā)的N端結(jié)構(gòu)域的改變保證了對(duì)LDLR結(jié)合的能力。Mahley等報(bào)道其中第244-272氨基酸肽段為主要的脂質(zhì)結(jié)合域，Dr. Fan早期曾對(duì)多種屬間的apoE的C端脂質(zhì)結(jié)合域(第200-299位氨基酸肽段)進(jìn)行了比較，提出其螺旋結(jié)構(gòu)中的保守肽段(第253-289氨基酸殘基)和234-254氨基酸肽段可能是發(fā)揮脂質(zhì)結(jié)合能力的主要結(jié)構(gòu)，并對(duì)全長(zhǎng)apoE進(jìn)行的核磁共振光譜學(xué)分析，顯示絞鏈區(qū)肽段(第192-215位氨基酸肽段)對(duì)于調(diào)控功能結(jié)構(gòu)域間的相互作用發(fā)揮著重要作用。鑒于apoE在脂質(zhì)代謝中的重要性及多態(tài)性的異構(gòu)體“失功能性”，靶向增加機(jī)體正常功能的apoE水平，有望成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要策略。但是，apoE (34kD)含有299個(gè)氨基酸，要獲得高表達(dá)產(chǎn)率的apoE目前并未成功，其次全長(zhǎng)的apoE作為治療藥物應(yīng)用于臨床還存在一些其它問(wèn)題，包括溶解度低、易于在體內(nèi)被酶降解產(chǎn)生細(xì)胞毒性片段，作為藥物開(kāi)發(fā)時(shí)分子量較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時(shí)以基因工程技術(shù)手段進(jìn)行apoE的基因調(diào)控也存在著種屬間的免疫原性和安全性及器官特異性等問(wèn)題。因此，為克服這些問(wèn)題，已開(kāi)始發(fā)展取代全長(zhǎng)apoE、構(gòu)建結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的小分子apoE功能擬肽,將有可能發(fā)展祀向apoE的As及相關(guān)重大疾病的防治新策略。已公認(rèn)apoE含LDLR結(jié)合域的片段具有抗炎抗氧化作用；而脂質(zhì)結(jié)合區(qū)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇的外流，尤其是其含有至少2個(gè)兩性螺旋時(shí)。故Datta課題組巧妙設(shè)計(jì)并通過(guò)化學(xué)合成方式了得到一種小分子apoE衍生肽Ac-hE18A-NH2。其選擇apoE中保守性的LDLR結(jié)合域序列與apoAI來(lái)源的18個(gè)氨基酸殘基的兩性螺旋結(jié)合而成，該肽具有介導(dǎo)血漿VLDL/LDL的清除及促巨噬細(xì)胞膽固醇外流的作用，并顯示了抗炎和抗氧化的活性，同時(shí)該小分子擬肽具有類(lèi)似于apoE的體內(nèi)再循環(huán)現(xiàn)象，故顯著延長(zhǎng)了擬肽的體內(nèi)半衰期及其生物學(xué)效應(yīng)。盡管此肽還存在含異源性18個(gè)氨基酸殘基，可能會(huì)潛在地引起人體的免疫反應(yīng)，隨時(shí)間而削減它的治療效力，但此肽的合成和相關(guān)功能研究給我們帶來(lái)了光明小分子apoE擬肽具有發(fā)展成為動(dòng)脈粥樣硬化及其所致心腦血管疾病等相關(guān)疾病的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種重組的人apoE模擬活性肽(擬肽)，其基本結(jié)構(gòu)為NH2-CLRKLRKRLLRKKKKKKQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE-COOH，其中包含了一段 apoE 的 LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位氨基酸肽段)和一段ap·oE的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位氨基酸肽段)，apoE擬肽具有明顯的結(jié)合HDL，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流及抗炎抗氧化活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種重組人apoE擬肽的制備方法，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，于細(xì)菌中表達(dá)的重組apoE擬肽經(jīng)過(guò)chitinbeads及heparin Sepharose CL-6B兩步親和層析得到純化的apoE擬肽。其優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高、成本低、純化流程簡(jiǎn)單、可獲得無(wú)任何標(biāo)簽的高純蛋白，其制備過(guò)程中氨基酸序列出錯(cuò)率明顯低于化學(xué)合成法，并且易于規(guī)?；磉_(dá)和純化，更易獲得高量純品肽。本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種重組人apoE擬肽在作為制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。這種重組的人apoE擬肽(EpK)可增強(qiáng)HDL介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并增加細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力。本發(fā)明制備的EpK在血循環(huán)中具有與HDL結(jié)合的特征，并顯著提高HDL介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流和抑制巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)，這種針對(duì)性改善HDL功能的機(jī)制在抗動(dòng)脈粥樣硬化的治療上顯示了重要的應(yīng)用潛能，可以采用現(xiàn)有技術(shù)已知的合適方法，例如胃腸外施用，可以是部位特異性的或者進(jìn)入全身血流的方式(包括通過(guò)靜脈、肌肉或經(jīng)皮注射)，施用本發(fā)明的重組apoE擬肽，用以防治機(jī)體主要?jiǎng)用}的粥樣硬化病變，包括冠狀動(dòng)脈，供應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的頸動(dòng)脈，及外周循環(huán)或內(nèi)臟循環(huán)動(dòng)脈的粥樣硬化病變，尤其涉及動(dòng)脈粥樣硬化所致的冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等嚴(yán)重心腦血管疾病的防治。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明設(shè)計(jì)并得到一種重組的人apoE擬肽(命名為EpK)，其包含了一個(gè)氨基端(NH2-)的半胱氨酸(Cys，C)殘基、一段apoE的LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位的LRKLRKRLLI^i段)、六個(gè)賴(lài)氨酸(Lys，K)的連接子區(qū)和羧基端(-C00H)的apoE的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位的 QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE 肽段)，故其基本結(jié)構(gòu)為NH2_CLRKLRKRLLRKKKKKKQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE-C00H。本發(fā)明得到的EpK，來(lái)源于基因工程技術(shù)制備，利用原核表達(dá)體系表達(dá)并經(jīng)兩步親和層析可得到純化的多肽。由于多肽較短(含38個(gè)氨基酸殘基的肽段)，故制備中也可選擇利用化學(xué)合成法合成。一種重組人apoE擬肽的制備方法，其步驟是(I)重組載體的構(gòu)建及EpK肽的表達(dá)利用人apoE的結(jié)構(gòu)功能域,設(shè)計(jì)了一種含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位氨基酸肽段)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位氨基酸肽段)的衍生肽(EpK),此肽包含N端的一個(gè)半胱氨酸(Cys),通過(guò)六個(gè)賴(lài)氨酸(Lys, K)殘基連接apoE的LDLR結(jié)合區(qū)及脂質(zhì)結(jié)合區(qū)。所述的人apoE的N端LDLR結(jié)合區(qū)為第141-150位的LRKLRKRLLR肽段；所述的人apoE的C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)為第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段。首先利用BLAST軟件(NCBI)設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成編碼EpK的DNA序列，DNA序列亞克隆插入到pTWINl載體(購(gòu)于New England Biolabs)中與N端內(nèi)含肽融合。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21pLysS(購(gòu)于 Stratagene)感受態(tài)細(xì)胞，利用LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)平板篩選(含100mg/L氨節(jié)青霉素)，證實(shí)EpK可于BL2IpLysS細(xì)菌中高效表達(dá)，然后于37°C液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌直到OD6tltl達(dá)到0. 8 I. 0，加入異丙基 _ β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β -D-l-thiogalactopyranoside, IPTG)至終濃度0. 5mM，再于25°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8 10小時(shí)。
(2) EpK 肽的純化離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌沉淀，菌體沉淀用buffer BI (20mM Tris-HCl，pH8. 5，500mM NaCl,lmM EDTA)重懸并超聲裂解，然后進(jìn)行EpK的兩步純化首先，細(xì)胞提取物上樣到裝有Chitin beads的層析柱,用buffer BI洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。加入buffer B2 (20mMTris-HCl, pH7. 0,500mM NaCl,lmM EDTA)于室溫(20-25 °C，以下相同)下平衡過(guò)夜，使Chitin beads上的intein tag剪切,然后,用足量的buffer B2洗脫目的多肽。第二步,洗脫出的多肽用IOmM磷酸鹽結(jié)合緩沖液(PBS，含IOOmM NaCl，pH7. 4)按I : 10比例稀釋?zhuān)⑸蠘又粮嗡赜H和柱(Heparin Sepharose CL-6B)中，然后用15倍柱床體積的PBS (含200mMNaCl,pH7. 4),洗去微量的未結(jié)合的intein tag、chitin結(jié)合區(qū)蛋白(CBD)以及其他的雜質(zhì)蛋白。目的多肽EpK最后通過(guò)增高NaCl的濃度而洗脫，即收集含500 600mM NaCl的梯度洗脫液，并在IOmM NH4HCO3進(jìn)行透析，最后凍干保存EpK粉末。采用pTWINl表達(dá)載體，其優(yōu)點(diǎn)是利用其內(nèi)可誘導(dǎo)的Intern蛋白剪切活性將靶蛋白肽鏈與親和標(biāo)簽(tag)分離開(kāi)，無(wú)需外源蛋白酶，可通過(guò)親和層析獲得N端為Cys的重組蛋白。(3)純化后EpK肽的鑒定EpK的最終產(chǎn)率是IL LB培養(yǎng)菌獲得5 10mg，經(jīng)15%還原型SDS-PAGE證實(shí)兩步純化后為一條蛋白帶，提示為高純的多肽(圖1A)。一種分離的多肽，其序列為SEQ ID N01所示的氨基酸序列。如圖1B，質(zhì)譜證實(shí)了其正確的分子量(4686. 981對(duì)應(yīng)推算的4654. 69)、純度和部分二聚體的形成(分子量9397. 116對(duì)應(yīng)推算的9307. 364)。EpK的凍干粉溶于PBS至lmg/ml [在PBS中的最大溶解度可達(dá)10mg/ml ( 2mM)]。(4)重組人apoE擬肽(EpK)的結(jié)構(gòu)功能A、EpK包含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)(LRKLRKRLLR)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE)，此肽N端加有一個(gè)半胱氨酸(Cys)，并通過(guò)六個(gè)正電荷的Lys連接apoE的LDLR結(jié)合區(qū)及脂質(zhì)結(jié)合區(qū)。Lys可增加EpK溶解性,并通過(guò)Lys側(cè)鏈與磷脂?；捕说氖杷韵嗷プ饔?，以及帶正電的Lys氨基與帶負(fù)電的磷脂頭部基團(tuán)的親水性相互作用，增強(qiáng)EpK與磷脂結(jié)合的親和力。此特點(diǎn)通過(guò)EpK易于與富含磷脂的HDL結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)。B、本發(fā)明采用新型原核表達(dá)載體pTWINl(New England Biolabs)構(gòu)建含EpKDNA的重組表達(dá)載體，于BL21pLysS細(xì)菌中表達(dá)的重組肽經(jīng)過(guò)chitin beads及heparinSepharose CL-6B兩步親和層析得到了無(wú)任何標(biāo)簽的含38個(gè)氨基酸的高純EpK肽。此法優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高、成本低、純化流程簡(jiǎn)單、制備過(guò)程中氨基酸序列出錯(cuò)率明顯低于化學(xué)合成法，無(wú)需化學(xué)合成法的特殊精密設(shè)備，并且易于規(guī)?；磉_(dá)和純化，獲得高量純品肽。C、本發(fā)明通過(guò)親和層析獲得了 N端為Cys的重組EpK。N端Cys可促使分子間反應(yīng)，形成靶分子的二聚體，在保證多肽形成特定模體、結(jié)構(gòu)域而具有功能活性的基礎(chǔ)上，二聚體的結(jié)構(gòu)提供了 EpK雙倍的功能，即增強(qiáng)LDLR結(jié)合區(qū)和脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的能力。D、EpK具有apoE的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)結(jié)合活性,這與EpK涉及介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流作用密切相關(guān)。Ε、ΕρΚ優(yōu)先與HDL結(jié)合，可通過(guò)DMPC結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EpK較全長(zhǎng)的apoE3與較大的DMPC囊泡結(jié)合動(dòng)力學(xué)更慢。此特征也賦予EpK —些優(yōu)勢(shì)①因?yàn)椴唤Y(jié)合VLDL和LDL，EpK不會(huì)很快通過(guò)LDLR從血漿中清除，故EpK在循環(huán)中的半衰期延長(zhǎng)級(jí)EpK主要與HDL結(jié)合 從而明顯增強(qiáng)HDL的功能。F、EpK在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中顯示了與脂蛋白結(jié)合的部位。利用人全長(zhǎng)的apoE3作比較，無(wú)論EpK與體外的血清孵育，還是EpK注射入血液后，均顯示EpK沒(méi)有與VLDL或很少和LDL相結(jié)合，而主要存在于HDL組分中，從而也說(shuō)明了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血漿膽固醇水平和改變脂蛋白分布的現(xiàn)象?！N重組人apoE擬肽在作為制備治療或預(yù)防在動(dòng)脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用的機(jī)制與過(guò)程是apoE在脂蛋白代謝和抗動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其機(jī)制涉及促進(jìn)循環(huán)中膽固醇的清除和血管壁巨噬細(xì)胞膽固醇的外流，抗氧化、抗炎等作用。其可存在于VLDL和乳糜微粒中，也作為HDL中主要載脂蛋白實(shí)現(xiàn)HDL的抗動(dòng)脈粥樣硬化功能，降低或減輕了動(dòng)脈粥樣斑塊的形成，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病有巨大的應(yīng)用前景。(I)本發(fā)明的EpK在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表明，EpK介導(dǎo)荷載膽固醇的巨噬細(xì)胞的膽固醇外流。此與apoE及其他apoE擬肽的報(bào)道結(jié)果一致。EpK肽C端的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)可能涉及介導(dǎo)膽固醇外流作用有關(guān)。本發(fā)明的EpK易于與HDL結(jié)合，在體外實(shí)驗(yàn)中顯示了與缺乏apoE的HDL結(jié)合后，可增強(qiáng)HDL作為膽固醇接受體的功能，促巨噬細(xì)胞膽固醇外流。(2)炎癥是重要的介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的一個(gè)方面。本發(fā)明的EpK在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中有效地抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。和來(lái)源于apoE+小鼠的HDL結(jié)合后，也顯示抑制LPS誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，相比而言，含EpK的HDL較apoE缺乏的HDL具有更加有效的抗炎功能。EpK多肽N端的LDLR結(jié)合區(qū)可能與其抗炎功能有關(guān)。本文中采用來(lái)源于apoE+小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞或THP-I源性巨噬細(xì)胞，分別經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生炎癥因子作為炎癥典型的細(xì)胞模型，此上的結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的EpK可單獨(dú)使用或與其它已知的抗炎因子組合用于治療一些急慢性炎性相關(guān)的疾病中，包括動(dòng)脈粥樣硬化，急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默氏癥等。(3)抗氧化作用是apoE抗動(dòng)脈粥樣硬化的功能之一。已經(jīng)證明H0X-1可通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抗炎而具有防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用。一些致動(dòng)脈粥樣硬化的刺激因素如高血壓、氧化脂質(zhì)和LPS都可以誘導(dǎo)HOX-I的表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)論是基礎(chǔ)水平還是oxLDL刺激下，EpK均可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中H0X-1的表達(dá)。因此，誘導(dǎo)H0X-1的表達(dá)是EpK抗動(dòng)脈粥樣硬化的又一有益的特性。(4)本發(fā)明中EpK的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均通過(guò)靜脈、肌肉或經(jīng)皮注射進(jìn)入全身血流的方式施用。說(shuō)明可采用現(xiàn)有的胃腸外施用的合適技術(shù)方法部位特異性的或者直接進(jìn)入全身血液循環(huán)，施用本發(fā)明的重組apoE擬肽，用以增強(qiáng)血液中HDL的抗動(dòng)脈粥樣硬化功能，防治機(jī)體主要?jiǎng)用}的粥樣硬化病變，包括冠狀動(dòng)脈，供應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的頸動(dòng)脈，及外周循環(huán)或內(nèi)臟循環(huán)動(dòng)脈的粥樣硬化病變，尤其涉及一種重組人apoE擬肽在作為制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致的冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等嚴(yán)重心腦血管疾病藥物中的用途。本發(fā)明與現(xiàn)有apoE擬肽相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果(I)本發(fā)明中設(shè)計(jì)的EpK的重要特征之一，是同時(shí)包含了人apoE的一個(gè)LDLR結(jié)合區(qū)和一個(gè)脂質(zhì)結(jié)合區(qū)，具有α螺旋結(jié)構(gòu)，其中LDLR結(jié)合區(qū)提供了其抗炎作用，而脂質(zhì)結(jié)合 區(qū)是其與脂蛋白結(jié)合的基礎(chǔ)；(2)本發(fā)明中設(shè)計(jì)的EpK的重要特征之一，其N(xiāo)端的Cys殘基介導(dǎo)了二聚體的形成，EpK 二聚體通過(guò)脂質(zhì)結(jié)合區(qū)作用可有效地結(jié)合于脂蛋白表面，雙倍的LDLR結(jié)合區(qū)和脂質(zhì)結(jié)合區(qū)可增強(qiáng)EpK的功能。(3)本發(fā)明中的EpK結(jié)構(gòu)中在LDLR結(jié)合區(qū)與脂質(zhì)結(jié)合區(qū)間有6個(gè)帶正電荷的Lys，可增加EpK的溶解度,并增強(qiáng)EpK與磷脂結(jié)合的親和力。6個(gè)Lys連接體還可能在EpK被細(xì)胞攝取時(shí)保護(hù)其免遭內(nèi)涵體-溶酶體的降解，這就使得EpK有機(jī)會(huì)重新循環(huán)至血漿。(4)本發(fā)明中的EpK來(lái)源于重組載體在細(xì)菌表達(dá)體系中的表達(dá)與純化的制備。與其他研究中的化學(xué)合成的apoE擬肽相比，其純化流程簡(jiǎn)單、可獲得無(wú)任何標(biāo)簽的高純蛋白，產(chǎn)率約為5 10mg/L LB培養(yǎng)基，且序列出錯(cuò)率、所需費(fèi)用也明顯低于化學(xué)合成法，并且更易規(guī)?；磉_(dá)和純化，獲得大量純品肽。(5)本發(fā)明中的EpK易于結(jié)合HDL，與EpK結(jié)合的HDL增強(qiáng)了介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制LPS刺激引起的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可改善HDL的功能；(6)本發(fā)明中的EpK還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化的活性。(7)本發(fā)明中的EpK選擇了人apoE的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)作為EpK肽的C端，這樣更好地消除了對(duì)人體潛在的免疫反應(yīng)。


圖I顯示了重組的人apoE擬肽(EpK)的兩步純化結(jié)果及純化EpK的質(zhì)譜特征。A. SDS-PAGE鑒定，分別顯示第一步及第二步純化的EpK產(chǎn)品；B.純化EpK的質(zhì)譜圖證實(shí)了其正確的分子量。圖2顯示了 EpK肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)結(jié)合活性.A.溶液中EpK肽的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖說(shuō)明EpK易傾向于形成α螺旋結(jié)構(gòu)；B. 24°C下EpK與DMPC囊泡孵育，A49tl的時(shí)間曲線顯示EpK與脂質(zhì)的結(jié)合及隨時(shí)間對(duì)囊泡的顯著清除效率，但較對(duì)照的完整apoE3的清除率低，其中清除1/2的時(shí)間，EpK為10分鐘，apoE3僅為3分鐘。圖3顯示了 EpK肽未介導(dǎo)血漿膽固醇的清除，但主要與血漿HDL結(jié)合。A. 100 μ g溶于PBS的EpK或全長(zhǎng)人apoE3眼眶后靜脈注射入apoE+小鼠體內(nèi)，在所示時(shí)間點(diǎn)采取血樣檢測(cè)血漿膽固醇水平，顯示對(duì)照的apoE3注射后可立即顯著降低小鼠血漿膽固醇水平并持續(xù)至少4小時(shí)，而EpK并沒(méi)有改變小鼠血漿膽固醇水平；B.收集apoE+小鼠注射EpK后的血漿，及未注射EpK的小鼠血漿體外與EpK孵育，分別進(jìn)行快速蛋白液相色譜(FPLC)，顯示脂蛋白膽固醇分布無(wú)明顯差異；C. Western blot檢測(cè)EpK在不同F(xiàn)PLC組分中的分布,表明EpK主要與HDL聯(lián)系，而沒(méi)有與VLDL或很少和LDL相結(jié)合，解釋了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血衆(zhòng)膽固醇水平的現(xiàn)象。D.顯示人apoE3注射入小鼠后的血衆(zhòng)FPLC組分Western blot作為對(duì)照，可見(jiàn)apoE3能與各種脂蛋白結(jié)合。圖4顯示了 EpK肽增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。A.原代培養(yǎng)的apoE+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞通過(guò)3天的acLDL孵育進(jìn)行膽固醇荷載，然后分別用含人apoAI,人全長(zhǎng)apoE3或EpK的DMEM孵育，與相同量的人apoAI和apoE3比較，20 μ g/ml EpK顯示了更高的介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的能力，*P < O. 01，η = 3 ；B-D.來(lái)源于apoE+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS (100ng/ml)和所示濃度的EpK處理6h，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，顯示5 μ g/ml和10 μ g/ml的EpK均顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF α (圖4Β)、IL6 (圖4C)和MCPl (圖4D)三種致炎因子的表達(dá)。與LPS組比較，*Ρ< 0. 05，#Ρ < 0. 01，η = 3ο圖5顯示了含EpK的HDL增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流并抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。A. apoE+小鼠注射EpK后的血漿HDL作為膽固醇接受體，利用THP-I衍生的巨噬細(xì)胞進(jìn)行膽固醇外流實(shí)驗(yàn)，可見(jiàn)作用4h時(shí)，含EpK的HDL介導(dǎo)膽固醇外流作用明顯高于不含EpK的HDL (*P < 0. 01) ；B-D.來(lái)源于THP-I的巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS(50ng/ml)刺激和含或不含EpK的HDL (100 μ g膽固醇/ml)處理6h，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，顯示含EpK的HDL能更有效抑制LPS誘導(dǎo)的THP-I源性巨噬細(xì)胞IL6 (圖5B)、IL-I β (圖5C)和CCL2 (圖5D)三種細(xì)胞因子的表達(dá)，表明EpK與HDL的結(jié)合使apoE+小鼠的HDL更具抗炎活性。(與LPS組比較，*P < 0. 05，*#P < O. 01，η = 3)圖6顯示了 EpK增強(qiáng)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中血紅素加氧酶-I (hemeoxygenase-1, H0X-1)的表達(dá)。無(wú)論有無(wú)oxLDL的刺激,5 μ g/ml和10 μ g/ml的EpK都能顯著提高H0X-1的表達(dá)(*P < 0.01)，說(shuō)明EpK可進(jìn)一步增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化和抗炎作用的 H0X-1活性而有益于防治動(dòng)脈粥樣硬化。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)被視為是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :設(shè)計(jì)重組載體及EpK肽的純化鑒定本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的衍生肽(EpK)，此肽包含N端的一個(gè)半胱氨酸(Cys)，一個(gè)apoE LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位的LRKLRKRLLR肽段)，其后通過(guò)6個(gè)Lys殘基連接一個(gè)apoE脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE 肽段)。EpK的38個(gè)氨基酸序列如下nh2-clrklrkrllrkkkkkkqvaevrakleeqaqqirlqae-cooh本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組載體，于細(xì)菌中表達(dá)的重組肽經(jīng)過(guò)chitinbeads及heparin Sepharose CL-6B兩步親和層析得到一種純化的重組人apoE擬肽(EpK),其具體步驟是(I)重組載體的構(gòu)建及EpK肽的表達(dá)首先利用BLAST軟件(NCBI)設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成編碼EpK的DNA序列，DNA序列亞克隆插入到pTWINl載體(購(gòu)于New England Biolabs)中與N端內(nèi)含肽融合。編碼EpK的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，具體的為5’ TGCCGCCGCAAATTACGCAAGCGTCTGCTGCGCAAGAAGAAGAAAAAGAA GCAGGTGGCCGAGGTCCGTGCCAAGTTAGAAGAACAGGCACAGCAGATCCGCCT GCAAGCGGAG 3’重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21pLysS(購(gòu)于 Stratagene)感受態(tài)細(xì)胞，利用LB培養(yǎng)平板篩選(含100mg/L氨芐青霉素)，過(guò)夜生長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌 落液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng),Western blotting證實(shí)EpK成功于BL21pLysS細(xì)菌中高效表達(dá),然后在37°C液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌直到OD6tltl達(dá)到0. 8 I. 0，加入終濃度0. 5mM的IPTG，再于25°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8 10小時(shí)。(2) EpK 肽的純化離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌沉淀，菌體沉淀用buffer BI (20mM Tris-HCl，pH8. 5，500mM NaCl,lmM EDTA)重懸并超聲裂解，然后進(jìn)行EpK的兩步純化首先，細(xì)胞提取物上樣到裝有Chitin beads的層析柱,用buffer BI洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。加入buffer B2 (20mMTris-HCl, pH7. 0,500mM NaCl,lmM EDTA)于室溫(20-25 °C，以下相同)下平衡過(guò)夜，使Chitin beads上的intein tag剪切,然后,用足量的buffer B2洗脫目的多肽。第二步,洗脫出的多肽用IOmM磷酸鹽結(jié)合緩沖液(PBS，含IOOmM NaCl，pH7. 4)按I : 10比例稀釋?zhuān)⑸蠘又粮嗡赜H和柱(Heparin Sepharose CL-6B)中，然后用15倍柱床體積的PBS (含200mMNaCl,pH7. 4),洗去微量的未結(jié)合的intein tag、chitin結(jié)合區(qū)蛋白(CBD)以及其他的雜質(zhì)蛋白。目的多肽EpK最后通過(guò)增高NaCl的濃度而洗脫，即收集含500 600mM NaCl的梯度洗脫液，并在IOmM NH4HCO3進(jìn)行透析，最后凍干保存EpK粉末。(3)純化后EpK肽的鑒定EpK的最終產(chǎn)率是IL LB培養(yǎng)菌獲得5 10mg，經(jīng)15%還原型SDS-PAGE證實(shí)兩步純化后為一條蛋白帶，提示為高純的多肽(圖1A)。一種分離的多肽，其序列為SEQ ID N01所示的氨基酸序列。如圖1B，質(zhì)譜證實(shí)了其正確的分子量(4686. 981對(duì)應(yīng)推算的4654. 69)、純度和部分二聚體的形成(分子量9397. 116對(duì)應(yīng)推算的9307. 364)。EpK的凍干粉溶于PBS至lmg/ml [在PBS中的最大溶解度可達(dá)10mg/ml ( 2mM)]。(4)表達(dá)和純化人apoE3本發(fā)明的apoE擬肽(EpK)的生物活性鑒定利用了全長(zhǎng)的人apoE3作為對(duì)照。采用慢病毒載體PWPI-apoE3轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，高表達(dá)人的apoE3和GFP。以GFP標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)以獲得穩(wěn)定表達(dá)apoE3的HEK293T細(xì)胞系，收集培養(yǎng)液直接用HeparinSepharose CL-6B柱純化apoE3，目的蛋白用含350 500mM NaCl的梯度洗脫液洗脫，并置于IOmMNH4HCO3中透析，經(jīng)15% SDS-PAGE證實(shí)為高純的apoE3，凍干保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS溶解至蛋白濃度為lmg/ml。實(shí)施例2 :純化的EpK肽二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)合脂質(zhì)活性的特征檢測(cè)ApoE具有很高的α螺旋結(jié)構(gòu)，根據(jù)設(shè)計(jì)的EpK肽序列包含人apoE的一部分LDLR結(jié)合區(qū)和一個(gè)脂質(zhì)結(jié)合區(qū)，基于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(Network Protein SequenceAnalysis)預(yù)測(cè)，EpK可能含有89. 74%的α螺旋結(jié)構(gòu)，為證實(shí)EpK形成α螺旋的能力，我們采用圓二色法分析了 EpK的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并用DMPC結(jié)合實(shí)驗(yàn)將EpK和人全長(zhǎng)的apoE3進(jìn)行對(duì)比，觀察它們同脂質(zhì)結(jié)合的能力。(I) EpK肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征鑒定圓二色法(Circular dichroism,⑶)測(cè)量EpK肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即于37°C,采用O. 2cm液層厚度的比色皿測(cè)量樣品遠(yuǎn)紫外區(qū)(190-260nm)的光譜圖，掃描過(guò)程中電腦溫控變化在0.2 °C以?xún)?nèi)。EpK樣品濃度為O. 25mg/ml，溶于IOmM磷酸鉀溶液中(pH7. O)，或溶于25%或50%的三氟乙醇(2，2，2-trif Iuoroethanol，TFE)中。二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)如圖2A，在IOmM磷酸鉀緩沖液中EpK的α螺旋含量很低，只有16. 9%;然而在25%或50% TFE ( 一種α螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑)中，α螺旋的含量分別提高至63. 1%和81.5%，這說(shuō)明EpK具有易于形成 α螺旋的結(jié)構(gòu)。EpK在TFE溶液中易于形成兩性α螺旋結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)是其脂質(zhì)結(jié)合活性的構(gòu)象基礎(chǔ)。⑵EpK肽的脂質(zhì)結(jié)合活性為驗(yàn)證EpK的脂質(zhì)結(jié)合能力，我們用完整的人apoE3作為對(duì)照，進(jìn)行了 DMPC結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將 IOmg 二豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC, Avanti Polar Lipids Inc. , Alabaster, AL)溶于氯仿/甲醇(3 lv/v)混合液中并用氮?dú)飧稍?。預(yù)熱的Iml緩沖液(20mM Tris-HCl,pH7. 2,250mM NaCl, and ImM EDTA)加入使脂質(zhì)終濃度為10mg/mL，30秒渦旋混勻數(shù)次，監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)DMPC囊泡轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)/DMPC盤(pán)狀復(fù)合物的時(shí)間。將100 μ g DMPC囊泡和100 μ g EpK或者apoE3的溶液置于24°C恒溫比色杯中，混合溶液5_10秒，通過(guò)分光光度計(jì)(SpectraMax M5)監(jiān)測(cè)490nm處吸光度值(A49tl)，反映DMPC囊泡溶液的清除率。(注所有的試劑實(shí)驗(yàn)前都于24°C預(yù)溫)。如圖2B，EpK濃度為0. 25mg/ml時(shí)，可以明顯觀察到DMPC囊泡溶液從混濁變成清亮，這個(gè)結(jié)果同人全長(zhǎng)的apoE孵育Ih的結(jié)果一樣。但EpK的清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于apoE3 :清除1/2的時(shí)間，EpK為10分鐘，apoE3僅為3分鐘。即相對(duì)于apoE3而言，EpK結(jié)合DMPC囊泡的動(dòng)力學(xué)較慢。總之，DMPC結(jié)合實(shí)驗(yàn)支持EpK能和DMPC囊泡結(jié)合并將其轉(zhuǎn)化成更小的顆粒，此也進(jìn)一步證實(shí)了它的脂質(zhì)結(jié)合能力。(3) EpK肽與血漿脂蛋白的結(jié)合利用apoE+小鼠進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)EpK是否與血漿脂蛋白結(jié)合及結(jié)合的部位。本實(shí)驗(yàn)采用的apoE+小鼠(來(lái)源于Jackson Laboratory)模型,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF級(jí))。動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程和實(shí)驗(yàn)方法均獲得湖北省動(dòng)物飼養(yǎng)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。apoE+小鼠分兩組，一組收集小鼠血漿，將90 μ I血漿與10 μ I EpK (終濃度為0. lmg/ml)共孵育30min后進(jìn)行快速蛋白液相色譜(FPLC)分離不同脂蛋白組分。另一組小鼠預(yù)先注射100 μ g EpK入血液，30min后收集血漿進(jìn)行FPLC分離，即分別取100 μ I的小鼠血楽·上樣于AKTApurifier (GE Healthcare)系統(tǒng)的Superose610/200GL凝膠層析柱,流動(dòng)相(0. 15mol/L NaCl、0. 01mol/L Na2HPO4 和 0. lmol/LEDTA, pH 7. 5)，流速 0. 5ml/min。樣品連續(xù)收集40管，每管0.5ml。小鼠血漿膽固醇水平采用膽固醇檢測(cè)試劑盒(Raichem)進(jìn)行酶法比色測(cè)定。如圖3B，EpK進(jìn)入體內(nèi)血循環(huán)，短時(shí)間對(duì)血漿脂蛋白的分布及血漿膽固醇水平不產(chǎn)生影響。
隨后利用羊抗人apoE抗體(50A_Glb, Academy Biomedical)可識(shí)別EpK,米用Western blot檢測(cè)EpK是否與脂蛋白組分結(jié)合，即EpK在不同F(xiàn)PLC組分中的分布。將FPLC分離得到的樣品管各取30μ I進(jìn)行15% SDS-PAGE，然后凝膠中蛋白被轉(zhuǎn)印到NC膜(Amersham Biosciences),米用羊抗人 apoE 抗體(50A_Glb, Academy Biomedical)和 HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG孵育,ECL試劑盒(Amersham Bioscieces)顯色,檢測(cè)FPLC的不同分離組分中EpK的分布，同時(shí)采用人全長(zhǎng)apoE3注射入小鼠血液，30min后收集血漿進(jìn)行FPLC分離及Western blot檢測(cè)，用于對(duì)照。圖3C顯示了體外孵育實(shí)驗(yàn)中，EpK存在于FPLC第28-40管的洗脫組分(HDL和不含脂質(zhì)的部分)，而體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)中EpK主要存在于FPLC第28-37管的洗脫組分(HDL部分)，僅檢測(cè)到極少量EpK存在于FPLC第24-27管(LDL)和第38-40管(不含脂質(zhì))的部分中，而apoE3的體內(nèi)外對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示(圖3D)，apoE3可結(jié)合VLDL、LDL和HDL的任何部分，尤其以結(jié)合VLDL和LDL為主。這表明EpK與apoE3不同，主要與血漿中HDL結(jié)合，而與VLDL或/和LDL很少結(jié)合，此實(shí)驗(yàn)可解釋了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血漿膽固醇水平的現(xiàn)象。盡管EpK帶有LDLR結(jié)合區(qū)及較強(qiáng)的肝素結(jié)合活性，但為什么EpK未與VLDL和LDL 結(jié)合目前還不清楚，我們推測(cè)是EpK優(yōu)先與較小的脂蛋白如HDL結(jié)合，可能是因?yàn)镠DL有更多彎曲的富含磷脂的表面，正如DMPC結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，相對(duì)于全長(zhǎng)的apoE3，EpK應(yīng)用更慢的動(dòng)力學(xué)與較大的DMPC囊泡結(jié)合，故可能EpK首先與HDL結(jié)合。檢測(cè)到EpK優(yōu)先與HDL結(jié)合，這也賦予EpK —些優(yōu)勢(shì)①因?yàn)椴唤Y(jié)合VLDL和LDL，EpK不會(huì)很快通過(guò)LDLR從血漿中清除，故EpK在循環(huán)中的半衰期延長(zhǎng)EpK主要與HDL結(jié)合從而有利于明顯增強(qiáng)HDL的功能，此將在下面的實(shí)施例中證實(shí)。實(shí)施例3 =EpK增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制巨噬細(xì)胞炎癥利用小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞對(duì)純化的EpK進(jìn)行功能評(píng)價(jià)。檢測(cè)EpK是否介導(dǎo)荷載膽固醇的巨噬細(xì)胞中膽固醇的外流。其次，檢測(cè)EpK是否抑制原代apoE+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。apoE+小鼠(來(lái)源于Jackson Laboratory)模型,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF級(jí))。(I)細(xì)胞培養(yǎng)為得到小鼠的巨噬細(xì)胞，采用3ml 3% thioglycollate小鼠腹腔內(nèi)注射，3天后小鼠行安樂(lè)死，用IOml PBS灌流收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。細(xì)胞接種于6孔或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，含 10 % 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的 Dulbecco’ s Modified EagleMedium(DMEM)(均購(gòu)于GIBC0)培養(yǎng)lh，然后用無(wú)FBS的DMEM洗滌2次以洗去未貼壁的細(xì)胞，貼壁的巨噬細(xì)胞以適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)巨噬細(xì)胞膽固醇外流培養(yǎng)于24孔板的小鼠巨噬細(xì)胞，加入100 μ g/ml3H-膽固醇的乙?；疞DL(acLDL)孵育3天進(jìn)行膽固醇荷載，其后更換含一定量EpK的DMEM培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入100 μ g/ml 3H-膽固醇(購(gòu)于PerkinElmer)的乙酸化LDL(acLDL,購(gòu)于Biomedical Technologies)。培養(yǎng)48小時(shí)，然后分別加入含人apoAI，人全長(zhǎng)apoE3 (hapoE3)或EpK的DMEM孵育，作為引發(fā)膽固醇外流的培養(yǎng)基，并分別于I小時(shí)和4小時(shí)取出培養(yǎng)液。在4小時(shí)的時(shí)間點(diǎn),完全去除培養(yǎng)液并用PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞用異丙醇溶解收集，利用Beckman LS6500液閃儀進(jìn)行培養(yǎng)基和細(xì)胞3H放射性計(jì)數(shù)。以3H外流的百分率計(jì)算膽固醇外流率。
與只有DMEM(不含外源性的膽固醇接受體)孵育相比，加10 μ g/ml EpK可增加細(xì)胞的膽固醇外流為I. 3% 6. 1%，加入20 μ g/ml EpK則進(jìn)一步增加膽固醇外流至13. 4%,而蛋白濃度為20 μ g/ml時(shí)，apoAI介導(dǎo)10%的膽固醇外流，apoE3介導(dǎo)膽固醇外流率為
9.7%，與相同量的人apoAI和apoE3比較，EpK顯示了更高的介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的能力(P < O. 01)(圖 4A)。(3)巨噬細(xì)胞炎癥因子的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)技術(shù)我們檢測(cè)巨卩遼細(xì)胞受LPS刺激后EpK對(duì)細(xì)胞炎癥因子TNFa、IL_6、MCP-ImRNA表達(dá)水平的影響。從小鼠腹腔新取出的巨噬細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中貼壁I小時(shí)，用DMEM洗滌兩次后在無(wú)血清的DMEM中培養(yǎng)過(guò)夜，然后用含50ng/ml LPS的DMEM更換培養(yǎng)基，同時(shí)給予適量EpK(μ g/ml級(jí)別)進(jìn)行處理。培養(yǎng)6小時(shí)后棄去培養(yǎng)基并用DMEM 洗滌細(xì)胞兩次，采用的Trizol試劑(Invitrogen)和RNeasy試劑盒(Qiagen)提取細(xì)胞總RNA,使用iScript cDNA Synthesis試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,于Eppendorf Realplex2Mastercycler (Eppendprf)進(jìn)行qPCR檢測(cè)目標(biāo)基因mRNA的水平。以小鼠18s rRNA為內(nèi)參基因。qPCR的引物序列如下小鼠18s rRNA 正向引物5’ CGCGGTTCTATTTTGTTGGT 3’ ；反向引物5，AGTCGGCATCGTTTATGGTC3，；小鼠TNFa 正向引物5’ CGTCAGCCGATTTGCTATCT 3，；反向引物5’CGGACTCCGCAAAGTCTAAG 3’ ；小鼠IL-6 正向引物5’ AGTTGCCTTCTTGGGACTGA3’反向引物5’TCCACGATTTCCCAGAGAAC 3’小鼠MCP-I 正向引物5’ AGGTCCCTGTCATG CTTCTG 3’反向引物5’TCTGGACCCATTCCTTCTTG 3’采用GraphPad PRISM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間平均值差異使用one-way ANOVA和student t_tests顯示。P < O. 05認(rèn)為有顯著性差異。如圖4B-4D，與僅含DMEM培養(yǎng)基的空白組，LPS顯著增加巨噬細(xì)胞中TNF a、IL6和MCPl三種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，與LPS組比較，加入5 μ g/ml和10 μ g/ml的EpK均顯著降低LPS所致TNF α、IL6和MCPl三種因子的表達(dá)(*Ρ < O. 05，**Ρ < O. 01)。實(shí)施例4 :體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)含EpK的HDL的功能通過(guò)純化的EpK 二級(jí)結(jié)構(gòu)及其脂質(zhì)結(jié)合活性的研究實(shí)施例中，證實(shí)EpK與apoE3不同，主要與血漿中HDL結(jié)合，而與VLDL或/和LDL很少結(jié)合。為進(jìn)一步研究EpK和HDL的結(jié)合對(duì)機(jī)體脂蛋白代謝的影響，能否增強(qiáng)HDL抗動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)功能。HDL抗動(dòng)脈粥樣硬化的眾多作用中，介導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和抗炎兩個(gè)功能尤為重要，而且可能存在本質(zhì)上相互聯(lián)系。我們利用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，從EpK與apoE+小鼠HDL結(jié)合的角度觀察對(duì)機(jī)體血漿膽固醇的清除及對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇外流和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。(I)進(jìn)入體內(nèi)的EpK結(jié)合HDL，但不介導(dǎo)血漿膽固醇的清除根據(jù)實(shí)施例2中體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)EpK與血漿脂蛋白的結(jié)合分布，EpK主要存在于FPLC洗脫的HDL組分，僅極少量EpK存在于FPLC洗脫的LDL和無(wú)脂部分。進(jìn)一步利用100 μ g溶于PBS的EpK或全長(zhǎng)人apoE3眼眶后靜脈注射入4月齡的apoE+小鼠體內(nèi)，并于注射后lmin、10min、30min、lh、2h、4h和24h米取30 μ I血樣檢測(cè)血衆(zhòng)膽固醇水平。結(jié)果顯示，對(duì)照的apoE3注射后可立即顯著降低血漿膽固醇水平，并持續(xù)至少4小時(shí)，而EpK并沒(méi)有改變apoE+小鼠血漿膽固醇水平(圖3A)。結(jié)合實(shí)施例2中的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，無(wú)論EpK進(jìn)入小鼠體內(nèi)30min后收集血清進(jìn)行FPLC檢測(cè)，還是EpK與血漿孵育后30min后進(jìn)行FPLC檢測(cè)，結(jié)果EpK注射組的脂蛋白分布無(wú)顯著變化(圖3B)。Western blot檢測(cè)比較apoE3和EpK在FPLC不同組分中的分布，圖3C-3D顯示了人apoE3注射入小鼠后的血漿，可見(jiàn)apoE3能與各種脂蛋白結(jié)合。而EpK盡管帶有LDLR結(jié)合區(qū)及較強(qiáng)的肝素結(jié)合活性，但注射EpK入apoE+小鼠主要與HDL聯(lián)系，與VLDL或很少和LDL相結(jié)合，故不介導(dǎo)血漿膽固醇的清除，這也合理解釋了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血漿膽固醇水平及改變脂蛋白分布的現(xiàn)象。(2)含EpK的HDL增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流本實(shí)驗(yàn)我們收集實(shí)施例2中注射過(guò)EpK的apoE+小鼠的血漿FPLC第30_37 管HDL組分，同樣以注射過(guò)PBS的apoE+小鼠血漿FPLC相同組分作為對(duì)照，通過(guò)centricom (Mi 11 ipore)濃縮樣品HDL組分，并經(jīng)O. 45 μ m濾器過(guò)濾除菌。利用30ng/ml的PMA誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系THP-I細(xì)胞3天使其分化成巨噬細(xì)胞，以HDL作為膽固醇接受體進(jìn)行膽固醇外流實(shí)驗(yàn)，將100yg/ml 3H標(biāo)記的acLDL孵育細(xì)胞48h荷載膽固醇后，洗滌、更換含有100 μ g膽固醇/ml HDL (膽固醇受體)的RPMI培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。分別于Ih和4h時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)基進(jìn)行3H放射性計(jì)數(shù)，在4h點(diǎn)培養(yǎng)基被完全除去，PBS洗滌細(xì)胞2次后，異丙醇溶解細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的3H放射性計(jì)數(shù)。膽固醇外流率以計(jì)算外流3H的百分比表示。結(jié)果如圖5A顯示，在Ih時(shí)間點(diǎn)，與單純RPMI1640培養(yǎng)基相比，無(wú)論是否含有EpK的HDL都顯著增強(qiáng)了細(xì)胞膽固醇的外流(5. 78%,4. 86% vs 0· 93%；Ρ< 0· 01)，但有無(wú)EpK結(jié)合的HDL在介導(dǎo)膽固醇外流的能力上并無(wú)明顯不同(5. 78% vs 4. 86% ) 而在4h時(shí)間點(diǎn)，含EpK的HDL介導(dǎo)膽固醇外流的作用明顯高于不含EpK的HDL(10. 58% vs 7. 42%, P
<0. 01)。(3)含EpK的HDL抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)我們繼續(xù)利用THP-I源性巨噬細(xì)胞，檢測(cè)是否含EpK的HDL能更有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)首先用30ng/mlPMA誘導(dǎo)THP-I細(xì)胞3天分化成巨噬細(xì)胞，以LPS(50ng/ml)刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞，同時(shí)加入含有EpK的HDL(100 μ g膽固醇/ml)共孵育，實(shí)驗(yàn)設(shè)立不含EpK的HDL為對(duì)照組。LPS和HDL共孵育6h后，采用的Trizol試劑和RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)THP-1源巨噬細(xì)胞中IL6、IL-I β和CCL2三種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。以人的基因GAPDH為內(nèi)參基因。qPCR的引物序列如下人GAPDH 正向引物5 ’ GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3 ’反向引物5’TTGATTTT GGAGGGATCTCG 3’人IL-6 正向引物5 ’ TACCCCCAGGAGAAGATTCC 3 ’反向引物5’TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT 3’人IL-1 β 正向引物5 ’ GGGCCTCAAGGAAAAGAATC 3 ’反向引物5’ TTCTGCTTGAGAGGTGCTGA3 ’
人CCL2 正向引物5 ’ CCCCAGTCACCTGCTGTTAT 3 ’反向引物5’TGGAATCCTGAACCCACTTC 3’結(jié)果如圖5B-5D，顯示LPS均明顯刺激巨噬細(xì)胞中IL6、IL_10和CCL2三種細(xì)胞因子的表達(dá)，來(lái)源于apoE+小鼠的HDL無(wú)論是否含有EpK都顯著抑制了 IL6、IL-I β和CCL2這三種細(xì)胞因子的表達(dá)，但含EpK的HDL更加有效(P < O. 01)，表明來(lái)源于apoE+小鼠體內(nèi)的與EpK結(jié)合的HDL抗炎活性更高。實(shí)施例5 =EpK增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中血紅素加氧酶-I的表達(dá)巨曬細(xì)胞血紅素加氧酶-I (heme oxygenase-1,H0X-1)具有抗氧化和抗炎的作用。我們檢測(cè)EpK是否可以刺激小鼠原代巨噬細(xì)胞H0X-1表達(dá)。apoE+小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)見(jiàn)實(shí)施例3中的方法，收集的巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 過(guò)夜，更換含50 μ g/ml氧化型LDL (oxidized LDL, oxLDL)和/或適量的EpK的新鮮DMEM培養(yǎng)6h后，采用的Trizol試劑和RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)H0X-1的mRNA表達(dá)水平。仍以小鼠18s rRNA為內(nèi)參基因。qPCR的引物序列如下小鼠18s rRNA 正向引物5’ CGCGGTTCTATTTTGTTGGT 3’反向引物5’ AGTCGGCATCGTTTATGGTC 3 ’小鼠H0X-1 正向引物5 ’ CACGCATATACCCGCTACCT 3，反向引物5，CCAGAGTGTTCATTCGAGCA3’結(jié)果如圖6顯示oxLDL可明顯增加H0X-1的mRNA表達(dá)(P < 0. 01)，而無(wú)論有無(wú)oxLDL的刺激，加入5和10 μ g/ml的EpK都能顯著提高HOX-1的表達(dá)(P < O. 01)，說(shuō)明EpK可進(jìn)一步增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化和抗炎作用的H0X-1活性而有益于防治動(dòng)脈粥樣硬化。
權(quán)利要求
1.一種分離的重組人apoE擬肽(EpK)，其序列為SEQ ID NO :I所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的一種重組人apoE擬肽(EpK)的制備方法，其步驟是 (1)重組載體的構(gòu)建及EpK肽的表達(dá) 利用人apoE的結(jié)構(gòu)功能域,設(shè)計(jì)了一種含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的衍生肽，此肽包含N端的一個(gè)半胱氨酸，通過(guò)六個(gè)賴(lài)氨酸殘基連接apoE的LDLR結(jié)合區(qū)及脂質(zhì)結(jié)合區(qū)； 所述的人apoE的N端LDLR結(jié)合區(qū)為第141-150位的LRKLRKRLLR肽段；所述的人apoE的C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)為第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段； 首先利用BLAST軟件設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)合成編碼EpK的DNA序列，編碼EpK的DNA序列如下5’ TGCCGCCGCAAATTACGCAAGCGTCTGCTGCGCAAGAAGAAGAAAAAGAAGCAGGTGGCCGAGGTCCGTGCCAAGTTAGAAGAACAGGCACAGCAGATCCGCCTGCAAGCGGAG 3， DNA序列亞克隆插入到pTWINl載體中與N端內(nèi)含肽融合； 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21pLysS感受態(tài)細(xì)胞，利用LB培養(yǎng)平板篩選，證實(shí)EpK于BL2IpLysS細(xì)菌中高效表達(dá)，然后于37°C液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌直到OD6tltl達(dá)到O. 8 I. 0，加入IPTG至終濃度O. 5 mM，再于25°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8 10小時(shí)； (2)EpK肽的純化 離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌沉淀，用buffer BI重懸并超聲裂解，然后進(jìn)行兩步純化首先，細(xì)胞提取物上樣到裝有Chitin beads的層析柱,用buffer BI洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì),加入buffer B2于室溫下平衡過(guò)夜,使Chitin beads上的intein tag剪切，再用足量的buffer B2洗脫目的多肽；第二步，洗脫出的多肽用10 mM磷酸鹽結(jié)合緩沖液(PBS)按I 10比例稀釋?zhuān)⑸蠘又粮嗡赜H和柱中，然后用15倍柱床體積的PBS，洗去微量的未結(jié)合的intein tag、chitin結(jié)合區(qū)蛋白以及其他的雜質(zhì)蛋白，目的多肽EpK最后通過(guò)增高NaCl的濃度而洗脫，收集含500 600 mM NaCl的梯度洗脫液，并在10 mM NH4HCO3進(jìn)行透析，最后凍干保存EpK粉末； (3)純化后EpK肽的鑒定 EpK的最終產(chǎn)率是IL LB培養(yǎng)菌獲得5 10 mg,經(jīng)15%還原型SDS-PAGE證實(shí)兩步純化后為一條蛋白帶，提示為高純的多肽，質(zhì)譜證實(shí)了其正確的分子量、純度和部分二聚體的形成。
3.權(quán)利要求I所述一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致心腦血管疾病藥物中的用途。
4.權(quán)利要求I所述的一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致冠心病藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致心肌梗塞疾病藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致中風(fēng)疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人apoE擬肽及制備方法和應(yīng)用，一種分離的重組apoE擬肽(EpK)，其序列為SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。采用原核表達(dá)體系表達(dá)并經(jīng)兩步親和層析制備純化的EpK，其優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高、成本低、純化流程簡(jiǎn)單、獲得無(wú)任何標(biāo)簽的高純蛋白，并且規(guī)模化表達(dá)和純化，更易獲得高量純品肽。EpK的功能特征在于具有α螺旋結(jié)構(gòu)，無(wú)論體內(nèi)外均能與脂質(zhì)結(jié)合，并優(yōu)先與HDL結(jié)合。EpK及與其結(jié)合的HDL顯著增強(qiáng)了介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流及抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的功能，同時(shí)，EpK還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化的活性。一種重組人apoE擬肽在治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102863525SQ201110185560
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者喻紅, 樊大平, 杜芬, 商亮, 吳堯, 潘陽(yáng), 曹佳, 李小明 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)