人角膜上皮片的制造法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種移植用人角膜上皮片，詳細(xì)地，涉及一種人角膜上皮片的制造法， 其使用了將人角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)而得到的來(lái)自人角膜上皮的細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 角膜是透明組織，其從外側(cè)向內(nèi)側(cè)由角膜上皮、前彈力層、角膜基質(zhì)層、后彈力層、 角膜內(nèi)皮5層細(xì)胞層構(gòu)成，其沒(méi)有血管但有神經(jīng)分布。角膜上皮是厚度約50μm的非角化 復(fù)層扁平上皮，其構(gòu)成眼表面的一部分，并且限制物質(zhì)的透過(guò)，而且作為防止細(xì)菌、真菌等 向角膜內(nèi)部侵入的屏障起作用。對(duì)于角膜上皮的屏障功能的維持，在最表層的細(xì)胞間存在 的緊密連接起著重要的作用。
[0003]角膜上皮有再生能力，即使上皮受傷，也能從角膜上皮干細(xì)胞供給用于修復(fù)損傷 的角膜上皮細(xì)胞，進(jìn)一步細(xì)胞間的緊密連接也再生，從而恢復(fù)并維持屏障功能。
[0004] 對(duì)于角膜上皮的屏障功能受到不可逆地?fù)p害的角膜疾病，角膜移植作為有效的治 方療法正在普及。角膜移植主要分為移植角膜全層的全層角膜移植和移植角膜組織的一部 分的角膜移植。由于全層角膜移植存在因角膜全層切開(kāi)而引起的眼球的脆弱性等問(wèn)題，因 此近年來(lái)，正在普及移植角膜組織的一部分的方法。作為這種移植角膜組織的一部分的方 法，有同時(shí)移植角膜基質(zhì)的一部分和角膜上皮的表層角膜移植、及僅移植及角膜上皮的角 膜上皮移植，這些方法以復(fù)發(fā)性角膜營(yíng)養(yǎng)不良患者等為對(duì)象，已在臨床情況中確立。
[0005] 在角膜緣組織的基底部存在具有分化為角膜上皮細(xì)胞的能力的角膜上皮干細(xì)胞。 因此，若角膜緣組織受到損害，則不能供給用于修復(fù)角膜上皮細(xì)胞的角膜上皮干細(xì)胞。此 外，在角膜上皮大范圍地受到損害的情況下，直到從角膜上皮干細(xì)胞供給用于修復(fù)損傷的 必要量的角膜上皮細(xì)胞為止，需要花費(fèi)時(shí)間。另外在作為角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的前 彈力膜受到損害的情況下，角膜上皮細(xì)胞發(fā)生粘著不良，從而不能夠給角膜上皮供給足夠 的細(xì)胞。這樣，角膜上皮在數(shù)周以上的期間內(nèi)未修復(fù)，若其屏障功能受損的狀態(tài)繼續(xù)，則眼 表面容易被細(xì)菌感染。一旦在眼表面發(fā)生感染，則結(jié)膜上皮隨著血管新生會(huì)覆蓋眼表面，此 外，由于免疫細(xì)胞的游走，會(huì)產(chǎn)生炎癥。另外，還有細(xì)菌分泌的酶導(dǎo)致角膜組織破壞，從而達(dá) 到失明的情況。這樣，因角膜上皮干細(xì)胞的供給的不能或降低而產(chǎn)生的疾病稱為角膜上皮 干細(xì)胞缺陷癥。對(duì)于因角膜上皮干細(xì)胞缺陷癥而產(chǎn)生炎癥的角膜，角膜上皮移植因排斥反 應(yīng)而成活率低。
[0006] 此外，角膜上皮移植還存在無(wú)法獲得滿足需要的移植用角膜上皮的捐贈(zèng)者不足的 問(wèn)題。對(duì)于該捐贈(zèng)者不足，考慮在體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞，制作細(xì)胞片，然后將該片移植到 角膜上皮的損傷部位的方法。在這種將人角膜上皮片移植到損傷部位的情況下，移植部位 的炎癥也成為問(wèn)題。因此，作為抑制炎癥并移植人角膜上皮片的方法，正在嘗試使人角膜上 皮片在羊膜上形成，從而制作具有羊膜層的人角膜上皮片，然后將其移植的方法。
[0007] 作為使細(xì)胞片在羊膜上形成的方法，報(bào)告了在人基質(zhì)羊膜（剝離除去了羊膜上皮 細(xì)胞的羊膜）上接種健康正常的白色家兔的角膜上皮緣片，與支持細(xì)胞（NIH-3T3細(xì)胞）一 起培養(yǎng)的方法（非專利文獻(xiàn)1)。確認(rèn)這里所得的人角膜上皮片在形態(tài)學(xué)上也具有與生物角 膜上皮類(lèi)似的層結(jié)構(gòu)。顯示進(jìn)行用健康正常的人角膜上皮緣片通過(guò)同樣的方法制作人角膜 上皮片，然后將其移植給難治性眼表面疾病患者的臨床試驗(yàn)，通過(guò)該方法得到的人角膜上 皮片的移植作為眼功能恢復(fù)手段是有效的（非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3)。
[0008] 此外，作為使細(xì)胞片在羊膜上形成的方法，報(bào)告了將健康正常的白色家兔或人的 角膜上皮緣片進(jìn)行酶處理并使角膜上皮細(xì)胞懸濁，將其接種到人基質(zhì)羊膜（剝離除去了羊 膜上皮細(xì)胞的羊膜）上，與支持細(xì)胞（NIH-3T3細(xì)胞）一起培養(yǎng)的方法（專利文獻(xiàn)1，非專 利文獻(xiàn)4)。確認(rèn)這里所得的人角膜上皮片在形態(tài)學(xué)上也具有與生物角膜上皮類(lèi)似的層結(jié) 構(gòu)。此外，確認(rèn)在人角膜上皮片的培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)將培養(yǎng)細(xì)胞的表面暴露于氣相并進(jìn)行培 養(yǎng)（air-lifting)，誘導(dǎo)緊密連接關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)：
[0010] 專利文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)1 :W02004/078225
[0012] 非專利文獻(xiàn)
[0013] 非專利文獻(xiàn)1 :KoizumiN.et al.，Cornea，19,65-71 (2000)
[0014] 非專利文獻(xiàn)2 :KoizumiN.et al.，Archives of Ophthalmology，119， 298-300(2001)
[0015] 非專利文獻(xiàn) 3:KoizumiN.et al·，The American Academy of Ophthalmology， 108,1569-74(2001)
[0016] 非專利文獻(xiàn)4 :KoizumiN.et al·，Invest Ophthalmol Vis Sci，43， 2114-21(2002)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 發(fā)明要解決的課題
[0018] 在上述背景下，本發(fā)明的目的在于，提供一種高效地制造品質(zhì)穩(wěn)定的人角膜上皮 片的方法。
[0019] 解決課題的方法
[0020] 在針對(duì)上述目的的研究中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，可用人間充質(zhì)干細(xì)胞作為支持細(xì)胞，在 將ROCK抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、MAP激酶抑制劑及TGF- β受體抑制劑進(jìn)行各種組合而 添加的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)自人角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞，進(jìn)一步地，通過(guò)將在該培養(yǎng)中所得的人 角膜上皮細(xì)胞在人羊膜上培養(yǎng)，能夠高效地制造人角膜上皮細(xì)胞片，從而完成本發(fā)明。即， 本發(fā)明提供以下方案。
[0021] (1) -種制造方法，其是來(lái)自人角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞的制造方法，
[0022] 其包括：在由具有細(xì)胞不能通過(guò)的微細(xì)孔的膜隔成第1室和第2室的培養(yǎng)容器的 該第1室中加入支持細(xì)胞，在該第2室中加入人角膜上皮細(xì)胞，用含有ROCK抑制劑及磷酸 二酯酶抑制劑的第1培養(yǎng)基培養(yǎng)該人角膜上皮細(xì)胞，接著，用含有磷酸二酯酶抑制劑、MAP 激酶抑制劑及TGF-β受體抑制劑的第2培養(yǎng)基培養(yǎng)該人角膜上皮細(xì)胞。
[0023] (2)上述（1)記載的制造方法，其中，該培養(yǎng)容器由具有該微細(xì)孔的膜隔成上下2 室，即上側(cè)室和下側(cè)室。
[0024] (3)上述（2)記載的制造方法，其中，該下側(cè)室為該第1室，該上側(cè)室為該第2室， 并且在具有該微細(xì)孔的膜上培養(yǎng)該人角膜上皮細(xì)胞。
[0025] (4)上述（3)記載的制造方法，其中，使人角膜上皮細(xì)胞在具有該細(xì)胞不能通過(guò)的 微細(xì)孔并且在該培養(yǎng)容器內(nèi)被支持的膜上，不與該支持細(xì)胞直接接觸而進(jìn)行培養(yǎng)。
[0026] (5)上述（1)-⑷中任一項(xiàng)記載的制造方法，其中，在該第1培養(yǎng)基中含有的該 ROCK抑制劑為Y27632,在該第1及該第2培養(yǎng)基中含有的該磷酸二酯酶抑制劑為3-異 丁基-1 -甲基黃嘌呤，在該第2培養(yǎng)基中含有的MAP激酶抑制劑為選自SB203580、或者 SB239063、或其組合的物質(zhì)，在該第2培養(yǎng)基中含有的TGF-β受體抑制劑為選自SB431542、 LY364947、或者A83-01、或其組合的物質(zhì)。
[0027] (6)上述（1)-⑷中任一項(xiàng)記載的制造方法，其中，在該第1培養(yǎng)基中含有的該 ROCK抑制劑為Y27632,在該第1及該第2培養(yǎng)基中含有的該磷酸二酯酶抑制劑為3-異丁 基-1-甲基黃嘌呤，在該第2培養(yǎng)基中含有的MAP激酶抑制劑為SB203580,在該第2培養(yǎng)基 中含有的TGF-β受體抑制劑為SB431542。
[0028] (7)上述（6)記載的制造方法，其中，在該第1培養(yǎng)基中含有的Y27632的濃度為 1-20μM，在該第1及該第2培養(yǎng)基中含有的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的濃度為50-150μM， 在該第2培養(yǎng)基中含有的SB203580的濃度為0. 2-2μΜ，SB431542的濃度為0. 2-2μΜ。
[0029] (8)上述（6)記載的制造方法，其中，在該第1培養(yǎng)基中含有的Υ27632的濃度為約 10μΜ，在該第1及該第2培養(yǎng)基中含有的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的濃度為約100μΜ，在 該第2培養(yǎng)基中含有的SB203580的濃度為約1μΜ，SB431542的濃度為約1μΜ。
[0030] (9)上述（1)-⑶中任一項(xiàng)記載的制造方法，其中，該支持細(xì)胞為人間充質(zhì)干細(xì) 胞。
[0031] (10) -種制造方法，其包括使通過(guò)上述（1)-(9)中任一項(xiàng)記載的制造方法得到的 細(xì)胞懸濁于細(xì)胞冷凍液中并冷凍，成為冷凍細(xì)胞的步驟。
[0032] (11) -種細(xì)胞，其來(lái)自通過(guò)上述（1)-(10)中任一項(xiàng)記載的制造方法得到的人角 膜上皮細(xì)胞。
[0033] (12) -種細(xì)胞，其來(lái)自通過(guò)上述（10)記載的制造方法得到的冷凍后的人角膜上 皮細(xì)胞。
[0034] (13) -種制造方法，其是人角膜上皮片的制造方法，
[0035] 其包括：對(duì)于上述（11)記載的來(lái)自人角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞，在其解凍后，將上述 (11)或（12)記載的來(lái)自人角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞，在含有支持細(xì)胞的培養(yǎng)容器中，在置于具 有該支持細(xì)胞不能通過(guò)的微細(xì)孔并且在該培養(yǎng)容器內(nèi)被支持的膜上的基質(zhì)羊膜上，使用含 有ROCK抑制劑的第3培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，接著，使用含有MAP激酶抑制劑及TGF-β受體抑制 劑的第4培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在該基質(zhì)羊膜上形成由來(lái)自該人角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞構(gòu)成的細(xì) 胞層的步驟；以及接著，在該細(xì)胞層的表面的全部或一部分沒(méi)有被培養(yǎng)基覆蓋的狀態(tài)下，使 用該第4培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
[0036] (14)上述（13)記載的制造方法，其中，該基質(zhì)羊膜以剝離了羊膜上皮的一側(cè)朝上 的方式放置在該培養(yǎng)容器中。
[0037] (15)上述（13)或（14)記載的制造方法，其中，在該第3培養(yǎng)基中含有的該ROCK 抑制劑為Y27632,在該第4培養(yǎng)基中含有的MAP激酶抑制劑為SB203580,在該第4培養(yǎng)基 中含有的TGF-β受體抑制劑為SB431542。
[0038] (16)上述（15)記載的制造方法，其中，在該第3培養(yǎng)基中含有的Y27632的濃度 為1-20μM，在該第4培養(yǎng)基中含有的SB203580的濃度為0. 2-2μM，在該第4培養(yǎng)基中含 有的SB431542的濃度為0. 2-2μΜ。
[0039] (17)上述（15)記載的制造方法，其中，在該第3培養(yǎng)基中含有的Υ27632的濃度 為約ΙΟμΜ，在該第4培養(yǎng)基中含有的SB203580的濃度為約ΙμΜ，SB431542的濃度為約 1μΜ，。
[0040] (18)上述（13)-(17)中任一項(xiàng)記載的制造方法，其中，該支持細(xì)胞為人間充質(zhì)干 細(xì)胞。
[0041] (19) 一種人角膜上皮片，其通過(guò)上述（13)-(18)中任一項(xiàng)記載的制造方法得到， 并包括該基質(zhì)羊膜和該來(lái)自人角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞。
[0042] (20)上述（19)記載的人角膜上皮片，其中，剝離了該基質(zhì)羊膜的羊膜上皮的一側(cè) 的面積的95%以上由通過(guò)該來(lái)自人角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞形成的細(xì)胞層覆蓋。
[0043] (21)上述（20)記載的人角膜上皮片，其中，該細(xì)胞層的90%以上具有由二層以上 細(xì)胞層構(gòu)成的復(fù)層結(jié)構(gòu)。
[0044] (22)上述（19)-(21)記載的任意一種人角膜上皮片，其中，該來(lái)自人角膜上皮細(xì) 胞的細(xì)胞的98%以上為細(xì)胞角蛋白AE1/AE3陽(yáng)性，并且80%以上為細(xì)胞角蛋白12陽(yáng)性。
[0045] (23)上述（19)-(21)記載的任意一種人角膜上皮片，其中，該來(lái)自人角膜上皮細(xì) 胞的細(xì)胞的99%以上為細(xì)胞角蛋白AE1/AE3陽(yáng)性，85%以上為細(xì)胞角蛋白12陽(yáng)性。
[0046] (24)上述（19)-(23)記載的人角膜上皮片，其用于角膜疾病的治療。
[0047] (25)上述（24)記載的人角膜上皮片，其中，該角膜疾病為角膜上皮的屏障功能受 到不可逆地?fù)p害的疾病。
[0048] (26)上述（24)記載的人角膜上皮片，其中，該角膜疾病選自角膜營(yíng)養(yǎng)不良、 Stevens-Johnson綜合征、化學(xué)外傷及角膜上皮干細(xì)胞缺陷癥。
[0049] (27) -種人角膜上皮片，其中，基質(zhì)羊膜表面的99. 5%以上由通過(guò)來(lái)自膜上皮 細(xì)胞的細(xì)胞形成的細(xì)胞層覆蓋，該細(xì)胞的98%以上為細(xì)胞角蛋白AE1/AE3陽(yáng)性，該細(xì)胞的 80%以上為細(xì)胞角蛋白12陽(yáng)性，該細(xì)胞層的95%以上具有由四層以上的細(xì)胞層構(gòu)成的復(fù) 層結(jié)構(gòu)，該細(xì)胞層表面的90%以上由扁平的細(xì)胞覆蓋，該細(xì)胞層內(nèi)的纖維母細(xì)胞的比率不 足 0. 1 %。
[0050] 發(fā)明的效果
[0051] 根據(jù)本發(fā)明，因?yàn)槟軌蚍€(wěn)定地供給可給復(fù)發(fā)性角膜營(yíng)養(yǎng)不良等角膜疾病的患者移 植的、品質(zhì)穩(wěn)定的人角膜上皮片，所以可以解決角膜上皮移植的捐贈(zèng)者不足。
【附圖說(shuō)明】
[0052] 圖1是示出HE染色后的人角膜上皮片的表面的放大圖（觀察倍率100倍）。
[0053] 圖2是示出HE染色后的人角膜上皮片的截面的放大圖（觀察倍率200倍）。A 表示表層的扁平的細(xì)胞，B表示