專利名稱：一種組織工程人角膜上皮的重建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于角膜上皮構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程人角膜上皮的重建方法，即利用人角膜上皮細(xì)胞和脫上皮層消化羊膜來重建組織工程人角膜上皮的方法。
背景技術(shù)：
人角膜上皮層由多層上皮細(xì)胞組成，是角膜的第一道屏障，可以防止角膜水分的散失和外界病原體的入侵，并阻止淚液中液體和電解質(zhì)進(jìn)入基質(zhì)層，使角膜處于透明狀態(tài); 此外，角膜上皮細(xì)胞表面的微絨毛和淚膜相互作用，為透明角膜的前屈光面提供光學(xué)界面 (謝立信，2000)。由于角膜上皮層直接與外界接觸，故易受到損傷和感染而引起角膜上皮損傷或病變，導(dǎo)致視力下降，嚴(yán)重者會(huì)引起角膜上皮盲(樊廷俊等，2010)。角膜病是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲眼病，其中多數(shù)是由于角膜上皮結(jié)構(gòu)和功能異常所引起的(Whitcher 等，2001)。角膜上皮移植是目前角膜上皮病盲治愈的唯一途徑，但由于捐獻(xiàn)的供體角膜數(shù)量嚴(yán)重不足，致使絕大多數(shù)角膜上皮盲病患者無法通過角膜上皮移植而重見光明。近年來， 角膜組織工程的興起使體外重建出形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的組織工程角膜上皮成為可能，是目前解決供體角膜材料不足的一種新的可行途徑，為角膜上皮病盲患者的臨床治療帶來了新的希望，但如何利用角膜上皮細(xì)胞和適宜的載體支架在體外重建出組織工程人角膜上皮已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。利用組織工程技術(shù)對(duì)人角膜上皮的體外重建研究開始于1993年，許多學(xué)者先后利用誘導(dǎo)分化的角膜緣干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、口腔黏膜上皮細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞等作為種子細(xì)胞，以復(fù)合膠原、羊膜、脫細(xì)胞角膜基質(zhì)、殼聚糖、纖維蛋白和聚異丙基丙烯酰胺凝膠等為載體支架開展了組織工程人角膜上皮的體外重建研究(Minami等， 1993 ；Koizumi 等，2001 ；Nakamura 等，2003 Jin 等，2004 ；Ma 等，2006 ；樊廷俊等，2010)，且移植后可使角膜創(chuàng)傷兔或角膜損傷患者恢復(fù)一定的視力。這些研究結(jié)果為組織工程人角膜上皮的體外重建開辟了道路，但由于所用種子細(xì)胞均為誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，因種子細(xì)胞來源有限，或因仍具有原有種類細(xì)胞的特點(diǎn)，故無法開展組織工程人角膜上皮的規(guī)?；w外重建，或體外重建的組織工程人角膜上皮因結(jié)構(gòu)功能不穩(wěn)定而無法臨床應(yīng)用，目前仍只限于實(shí)驗(yàn)研究。2009年，樊廷俊等成功建立了非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的人角膜上皮細(xì)胞系，并從中篩選出核型正常且結(jié)構(gòu)功能正常的角膜上皮細(xì)胞株，成功解決了人組織工程角膜上皮規(guī)?；亟ㄋ璐罅糠N子細(xì)胞的來源問題。因此，盡早建立一種利用人角膜上皮細(xì)胞單克隆細(xì)胞株和去上皮層消化羊膜在體外重建組織工程人角膜上皮的方法，已成為各國學(xué)者的主攻目標(biāo)，也是組織工程角膜上皮規(guī)模化生產(chǎn)及臨床應(yīng)用造福全世界角膜上皮病盲患者的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種組織工程人角膜上皮的重建方法，利用人角膜上皮細(xì)胞單克隆細(xì)胞株和去上皮層消化羊膜載體支架來體外重建人角膜上皮，從而滿足患者對(duì)角膜上皮的移植需求，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的重建方法包括如下步驟1)人角膜上皮種子細(xì)胞懸液的制備取人角膜上皮細(xì)胞系的細(xì)胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在37°C擴(kuò)增培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶溶液消化和1000 1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10 15分鐘獲得人角膜上皮細(xì)胞沉淀，再用含有10%小牛血清和0. 005% 0. 01% IV型膠原蛋白的DMEM/F12培養(yǎng)液將該細(xì)胞沉淀懸浮成人角膜上皮細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度至8X IO6 3X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升；其中人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法是將角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒， 再將角膜進(jìn)行消化處理后，取下帶有前彈力層的角膜上皮，剪成小的角膜上皮組織塊后，將角膜上皮組織塊向下貼于培養(yǎng)孔的底部，使前彈力層向上；然后加入培養(yǎng)液在二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C下進(jìn)行貼板培養(yǎng)，培養(yǎng)期間換培養(yǎng)液，細(xì)胞長成單層后用胰酶消化法進(jìn)行繼代培養(yǎng)，傳代至60代以上完成了人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建；其中，培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、0. 02%。 0. 04%。的人表皮細(xì)胞生長因子、0. 01%。 0. 02%。的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、0. 4%。 1. 0%。羧甲基殼寡糖和0. 25%。 1%。硫酸軟骨素的DMEM/F12培養(yǎng)液。上述的含抗生素的消毒液為用0. 9%生理鹽水配制的質(zhì)量比濃度為20% 70% 的慶大霉素溶液。上述的角膜進(jìn)行消化處理是用濃度為0. 2 0. 5%的胰蛋白酶溶液消化，消化時(shí)間為1 2min。2)載體支架的制備利用0. 25%胰蛋白酶-0. 1% EDTA溶液對(duì)凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化，以得到完全去除上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將去上皮層消化羊膜打成與6孔培養(yǎng)板插入式培養(yǎng)皿孔徑相同的去上皮層消化羊膜圓片，使其上皮面朝上平鋪于插入式培養(yǎng)皿的底部，放置于5% CO2培養(yǎng)箱中在37°C條件下牢固干貼后制成載體支架備用；3)組織工程人角膜上皮的構(gòu)建最后，在貼有去上皮層消化羊膜載體支架的插入式培養(yǎng)皿中，輕輕加入上述準(zhǔn)備好的人角膜上皮細(xì)胞懸液0. 1 0.2毫升，使細(xì)胞懸液均勻分散于插入式培養(yǎng)皿中，6孔培養(yǎng)板孔中不加培養(yǎng)液，置5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)20 M小時(shí)待細(xì)胞完全貼附到載體支架上后，吸去插入式培養(yǎng)皿內(nèi)的舊培養(yǎng)液，將插入式培養(yǎng)皿輕輕放入已加入0. 8毫升含 10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，建立氣-液界面培養(yǎng)環(huán)境，在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)啟動(dòng)組織工程人角膜上皮的體外重建，每隔12小時(shí)輕輕搖動(dòng)6孔培養(yǎng)板，每隔 24 36小時(shí)換液一次，待人角膜上皮細(xì)胞在載體支架上長成6 8層后即為重建的組織工程人角膜上皮。本發(fā)明利用無致瘤性、非轉(zhuǎn)染的人角膜上皮細(xì)胞，能通過連續(xù)傳代為組織工程人角膜上皮的規(guī)模化體外重建提供出足量的種子細(xì)胞；利用商品化凍干羊膜所制備的去上皮層消化羊膜，可滿足組織工程人角膜上皮批量重建所需要的大量載體支架材料；而且可直接應(yīng)用于批量生產(chǎn)和臨床角膜移植；且其生產(chǎn)和臨床治療的成本低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述一、人角膜上皮細(xì)胞系的建立1、角膜片貼板培養(yǎng)的啟動(dòng)從眼庫中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10 30毫升濃度為0. 9%的生理鹽水，清洗5 9分鐘；吸出生理鹽水后，加入 10 30毫升的濃度為20% 70%的慶大霉素，浸泡15 35分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒，以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，所有用品均是無菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，玻璃培養(yǎng)皿中加入0. 2 0. 5%胰蛋白酶 5 10毫升消化1 2分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科鑷撕下帶前彈力層的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把帶有前彈力層的角膜上皮平均剪成8片，用眼科鑷將角膜上皮面朝下平貼入M孔培養(yǎng)板的孔底，向貼入角膜上皮片的培養(yǎng)孔中加入0. 1 0. 3毫升培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的體積量即保證角膜上皮片能夠很好的貼附在培養(yǎng)孔底，又保證組織片不會(huì)干燥。將培養(yǎng)板放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C進(jìn)行培養(yǎng)；2、組織塊法進(jìn)行人角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)角膜上皮片貼板培養(yǎng)12-M小時(shí)后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中補(bǔ)加角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液至1毫升，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C培養(yǎng)； 每間隔3 5天，更換人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液一次。3、人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液的配制取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液3. 0毫升， 然后依次加入硫酸軟骨素1 4毫克、羧甲基殼寡糖0. 2 0. 6毫克和IV型膠原0. 08 0. 4毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，又添加了 0. 01%。 0. 02%。的人表皮細(xì)胞生長因子和0. 01%。 0. 02%。的堿性成纖維細(xì)胞生長因子， 補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至4. 0毫升，即為本發(fā)明的人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液。4、人角膜上皮細(xì)胞的繼代培養(yǎng)待人角膜上皮細(xì)胞長成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0. 5毫升濃度為0. 25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化1 2分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專用培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底 3 5分鐘制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；從每培養(yǎng)孔中分別取出0. 5毫升角膜上皮細(xì)胞懸液， 分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每個(gè)培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液0. 5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜上皮細(xì)胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。實(shí)施例1從眼庫中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10毫升濃度為 0.9%的生理鹽水，清洗5分鐘；吸出生理鹽水后，加入10毫升的濃度為20%的慶大霉素， 浸泡35分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒；以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，所有用品均是無菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入0. 2%胰蛋白酶5毫升消化2分鐘后，去除胰蛋白酶液，用眼科鑷撕下帶有前彈力層的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把帶有前彈力層的角膜上皮平均剪成8片，用眼科鑷將角膜上皮面朝下平貼入M孔培養(yǎng)板的孔底，每個(gè)培養(yǎng)孔補(bǔ)加含有20%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液0. 1毫升；將培養(yǎng)板放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37°C進(jìn)行培養(yǎng)。取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液3. 0毫升，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入0. 8毫升胎牛血清，又加入0. 01%。 0. 02%。的人表皮細(xì)胞生長因子和0. 01%。 0. 02%。的堿性成纖維細(xì)胞生長因子，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至4. 0毫升，即為人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液。貼板培養(yǎng)12小時(shí)后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液至1毫升，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C培養(yǎng)；每間隔3天，更換人角膜上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液一次。待人角膜上皮細(xì)胞長成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0. 5毫升濃度為0. 25% 的胰蛋白酶溶液，靜置消化1分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專用培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底3分鐘制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；從每個(gè)培養(yǎng)孔中分別取出 0. 5毫升角膜上皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述專用培養(yǎng)液0. 5 毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜上皮細(xì)胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。二、組織工程人角膜上皮的重建1、角膜上皮重建專用培養(yǎng)液的配制取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液80毫升，加入 IV型膠原蛋白4 8毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入10毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為本發(fā)明的角膜上皮重建專用培養(yǎng)液。2、人角膜上皮種子細(xì)胞的制備取人角膜上皮細(xì)胞，懸浮于20%小牛血清-DMEM/ F12培養(yǎng)液中，接種至底面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，置37°C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞增殖 72 80小時(shí)至對(duì)數(shù)生長期后，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0. 25%胰蛋白酶溶液消化1 2分鐘，加入此前吸出的培養(yǎng)液終止消化，1000 1500轉(zhuǎn)/分離心10 15分鐘，細(xì)胞沉淀用3毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮均勻制成人角膜上皮種子細(xì)胞懸液，利用Casy細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用角膜上皮重建專用培養(yǎng)液調(diào)整種子細(xì)胞濃度至8X IO6 3X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升。3、去上皮層消化羊膜載體支架的制備利用0. 25%胰蛋白酶-0. EDTA溶液 (1 1)對(duì)凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化15 30分鐘，以得到完全去除上皮層的羊膜， 用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將去上皮層消化羊膜打成直徑2. 5厘米的去上皮層消化羊膜圓片。4、組織工程人角膜上皮的體外重建去上皮層消化羊膜圓片按照上皮面朝上的方向平鋪于6孔培養(yǎng)板插入式培養(yǎng)皿的底部，放置于37°C培養(yǎng)箱中干貼處理20 M小時(shí)后制成去上皮層消化羊膜載體支架。在載體支架的插入式培養(yǎng)皿中，輕輕加入0. 1 0. 2毫升上述準(zhǔn)備好的種子細(xì)胞懸液，輕輕吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于插入式培養(yǎng)皿中，置5% CO2 培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)20 沈小時(shí)待細(xì)胞完全貼附到載體支架上后，吸去插入式培養(yǎng)皿內(nèi)的舊培養(yǎng)液，將插入式培養(yǎng)皿輕輕放入已加入0. 8毫升10%小牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液的6 孔培養(yǎng)板中，在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C進(jìn)行組織工程人角膜上皮的體外重建，每隔12小時(shí)輕輕搖動(dòng)6孔培養(yǎng)板，每隔M 36小時(shí)換液一次，待人角膜上皮細(xì)胞在載體支架上長成6 8層后即為重建的組織工程人角膜上皮。實(shí)施例2取人角膜上皮細(xì)胞，懸浮于20%小牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種至底面積為 75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，置37°C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)80小時(shí)。取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液80 毫升，加入IV型膠原蛋白8毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入10毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為本發(fā)明的角膜上皮重建專用培養(yǎng)液。對(duì)擴(kuò)增培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0. 25%胰蛋白酶溶液消化1. 5分鐘，加入此前吸出的舊培養(yǎng)液終止消化，1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，獲得細(xì)胞沉淀，用 3毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮均勻制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；利用Casy細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用上述專用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升。利用0. 25%胰蛋白酶-0. 1 % EDTA溶液(1 1)對(duì)凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化20分鐘，以得到完全去除上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將去上皮層消化羊膜打成直徑2. 5厘米的去上皮層消化羊膜圓片，按照上皮面朝上的方向平鋪于6 孔培養(yǎng)板插入式培養(yǎng)皿的底部，放置于37°C培養(yǎng)箱中干貼處理M小時(shí)后制成去上皮層消化羊膜載體支架。在載體支架的插入式培養(yǎng)皿中，輕輕加入0. 15毫升上述準(zhǔn)備好的種子細(xì)胞懸液，輕輕吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于插入式培養(yǎng)皿中，置5% (X)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)M 小時(shí)待細(xì)胞完全貼附到載體支架上后，吸去插入式培養(yǎng)皿孔內(nèi)的舊培養(yǎng)液，將插入式培養(yǎng)皿輕輕放入已加入0. 8毫升10%小牛血清-DMEM培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，建立氣-液界面培養(yǎng)環(huán)境，在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C進(jìn)行組織工程人角膜上皮的體外重建，每隔12小時(shí)輕輕搖動(dòng)6孔培養(yǎng)板，每隔30小時(shí)換液一次，待人角膜上皮細(xì)胞在載體支架上長成6 8層后即為重建的組織工程人角膜上皮。實(shí)施例3取人角膜上皮單克隆細(xì)胞株細(xì)胞，懸浮于20%小牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種至底面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，置37°C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)72小時(shí)。取常規(guī)配制的DMEM/ F12培養(yǎng)液80毫升，加入IV型膠原蛋白6毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入10毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為本發(fā)明的角膜上皮重建專用培養(yǎng)液。對(duì)擴(kuò)增培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0. 25%胰蛋白酶溶液消化1分鐘，加入此前吸出的舊培養(yǎng)液終止消化，1000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，獲得細(xì)胞沉淀，用3毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮均勻制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；利用Casy細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用上述專用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升。利用0. 25%胰蛋白酶-0. 1 % EDTA溶液(1 1)對(duì)凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化15分鐘，以得到完全去除上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將去上皮層消化羊膜打成直徑2. 5厘米的去上皮層消化羊膜圓片，按照上皮面朝上的方向平鋪于6 孔培養(yǎng)板插入式培養(yǎng)皿的底部，放置于37°C培養(yǎng)箱中干貼處理20小時(shí)后制成去上皮層消化羊膜載體支架。在載體支架的插入式培養(yǎng)皿中，輕輕加入0. 1毫升上述準(zhǔn)備好的種子細(xì)胞懸液，輕輕吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于插入式培養(yǎng)皿中，置5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)沈小時(shí)待細(xì)胞完全貼附到載體支架上后，吸去插入式培養(yǎng)皿內(nèi)的舊培養(yǎng)液，將插入式培養(yǎng)皿輕輕放入已加入0. 8毫升10%小牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C進(jìn)行組織工程人角膜上皮的體外重建，每隔12小時(shí)輕輕搖動(dòng)6孔培養(yǎng)板，每隔 24小時(shí)換液一次，待人角膜上皮細(xì)胞在載體支架上長成6 8層后即為重建的組織工程人角膜上皮。實(shí)施例4取人角膜上皮單克隆細(xì)胞株細(xì)胞，懸浮于20%小牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種至底面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，置37°C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)75小時(shí)。取常規(guī)配制的DMEM/ F12培養(yǎng)液80毫升，加入IV型膠原蛋白4毫克，完全溶解后用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入10毫升小牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至100毫升，即為本發(fā)明的角膜上皮重建專用培養(yǎng)液。對(duì)擴(kuò)增培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶，用玻璃滴管吸出培養(yǎng)液，加入0. 25%胰蛋白酶溶液消化2分鐘，加入此前吸出的舊培養(yǎng)液終止消化，1200轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，獲得細(xì)胞沉淀，用3毫升上述專用培養(yǎng)液懸浮均勻制成人角膜上皮細(xì)胞懸液；利用Casy細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用上述專用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至8X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升。利用0. 25%胰蛋白酶-0. 1 % EDTA溶液(1 1)溶液對(duì)凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化30分鐘，以得到完全去除上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將去上皮層消化羊膜打成直徑2. 5厘米的去上皮層消化羊膜圓片，按照上皮面朝上的方向平鋪于6孔培養(yǎng)板插入式培養(yǎng)皿的底部，放置于37°C培養(yǎng)箱中干貼處理22小時(shí)后制成去上皮層消化羊膜載體支架。在載體支架的插入式培養(yǎng)皿中，輕輕加入0. 2毫升上述準(zhǔn)備好的種子細(xì)胞懸液，輕輕吹打使細(xì)胞懸液均勻分散于插入式培養(yǎng)皿中，置5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)20小時(shí)待細(xì)胞完全貼附到載體支架上后，吸去插入式培養(yǎng)皿內(nèi)的舊培養(yǎng)液，將插入式培養(yǎng)皿輕輕放入已加入0. 8毫升10%小牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，在5% CO2 培養(yǎng)箱中37°C進(jìn)行組織工程人角膜上皮的體外重建，每隔12小時(shí)輕輕搖動(dòng)6孔培養(yǎng)板，每隔36小時(shí)換液一次，待人角膜上皮細(xì)胞在載體支架上長成6 8層后即為重建的組織工程人角膜上皮。本發(fā)明的方法所重建出的組織工程人角膜上皮在形態(tài)結(jié)構(gòu)和透明度上與正常角膜上皮相似并具有正常角膜上皮的功能。為了更好的驗(yàn)證本發(fā)明方法所獲得的組織工程人角膜上皮具有生物學(xué)上的功能，將本發(fā)明所重建的組織工程人角膜上皮移植到去除角膜緣干細(xì)胞及刮除角膜上皮層的新西蘭兔眼中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移植的組織工程人角膜上皮可使兔眼角膜恢復(fù)透明長達(dá)180天以上，并且移植的上皮能夠防御細(xì)菌的侵染。三次重復(fù)的結(jié)果都表明應(yīng)用本發(fā)明方法構(gòu)建的組織工程人角膜上皮具有替代自生角膜的前景。
權(quán)利要求
1.一種組織工程人角膜上皮的重建方法，包括1)人角膜上皮種子細(xì)胞懸液的制備、 2)羊膜載體支架的制備和幻組織工程人角膜上皮的培養(yǎng)步驟，其特征在于，上述步驟1) 是用人角膜上皮細(xì)胞系的細(xì)胞來制備人角膜上皮種子細(xì)胞懸液，其中人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法是將角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再將角膜進(jìn)行消化處理后，取下帶有前彈力層的角膜上皮，剪成小的角膜上皮組織塊后，將角膜上皮組織塊向下貼于培養(yǎng)孔的底部，使前彈力層向上；然后加入培養(yǎng)液在二氧化碳培養(yǎng)箱中、37°C下進(jìn)行貼板培養(yǎng)，培養(yǎng)期間換培養(yǎng)液，細(xì)胞長成單層后用胰酶消化法進(jìn)行繼代培養(yǎng)，傳代至60代以上完成了人角膜上皮細(xì)胞系的構(gòu)建；所述的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、0. 02%。 0. 04%。的人表皮細(xì)胞生長因子、0. 01%。 0. 02%。的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、0. 4%。 1. 0%。羧甲基殼寡糖和 0. 25%。 1%。硫酸軟骨素的DMEM/F12培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的含抗生素的消毒液為用0.9%生理鹽水配制的質(zhì)量比濃度為20% 70%的慶大霉素溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的角膜進(jìn)行消化處理是用濃度為 0. 2 0. 5%的胰蛋白酶溶液消化，消化時(shí)間為1 anin。
4.如權(quán)利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步驟1)制備人角膜上皮種子細(xì)胞懸液是取人角膜上皮細(xì)胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在37°C擴(kuò)增培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶溶液消化和1000 1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10 15分鐘獲得人角膜上皮細(xì)胞沉淀，再用含有10%小牛血清和0. 005% 0.01% IV型膠原蛋白的DMEM/F12 培養(yǎng)液將該細(xì)胞沉淀懸浮成人角膜上皮細(xì)胞懸液，其中細(xì)胞濃度為8 X IO6 3 X IO7個(gè)/mL。
5.如權(quán)利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步驟幻羊膜載體支架的制備是用 0. 25%胰蛋白酶-0. 1% EDTA溶液等體積混合對(duì)凍干羊膜的上皮面進(jìn)行倒置消化，以徹底去除羊膜上皮細(xì)胞，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器將去上皮層消化羊膜打成與6孔培養(yǎng)板插入式培養(yǎng)皿孔徑相同的去上皮層消化羊膜圓片，使其上皮面朝上平鋪于6孔培養(yǎng)板插入式培養(yǎng)皿的底部，放置于5% CO2培養(yǎng)箱中在37°C條件下牢固干貼后制成載體支架。
6.如權(quán)利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步驟幻組織工程人角膜上皮的培養(yǎng)是將在貼有去上皮層消化羊膜載體支架的插入式培養(yǎng)皿中，輕輕加入上述準(zhǔn)備好的人角膜上皮細(xì)胞懸液0. 1 0.2毫升，使細(xì)胞懸液均勻分散于插入式培養(yǎng)皿中，6孔培養(yǎng)板孔中不加培養(yǎng)液，置5%的CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)20 M小時(shí)待細(xì)胞完全貼附到載體支架上后，吸去插入式培養(yǎng)皿內(nèi)的舊培養(yǎng)液，將插入式培養(yǎng)皿輕輕放入已加入0.8毫升含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，建立氣-液界面培養(yǎng)環(huán)境，在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C 培養(yǎng)啟動(dòng)組織工程人角膜上皮的體外重建，每隔12小時(shí)輕輕搖動(dòng)6孔培養(yǎng)板，每隔M 36 小時(shí)換液一次，待人角膜上皮細(xì)胞在載體支架上長成6 8層后即為重建的組織工程人角膜上皮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織工程人角膜上皮的重建方法，是利用含20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將人角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA消化法獲得完全去除上皮層的消化羊膜載體支架，平鋪在插入式培養(yǎng)皿中牢固干貼后，將懸浮于含有IV型膠原蛋白和10％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的對(duì)數(shù)生長期人角膜上皮細(xì)胞，接種至平鋪有去上皮層消化羊膜載體支架的插入式培養(yǎng)皿中采用氣-液界面培養(yǎng)法進(jìn)行組織工程人角膜上皮的體外重建。本發(fā)明工藝科學(xué)合理，所重建的組織工程人角膜上皮可用于批量生產(chǎn)，滿足廣大角膜上皮病盲患者臨床角膜移植治療對(duì)組織工程人角膜上皮的大量需求，且組織工程人角膜上皮體外重建和臨床治療的成本低。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102166375SQ201110039099
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者孫愛, 徐彬, 楊洪收, 樊廷俊, 王寶泉 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué), 青島中皓生物工程有限公司