昆蟲定點基因敲入組合物及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及遺傳學(xué)轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及生物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及將 帶有可視性篩選標(biāo)記的外源性DNA片段高效、精確地導(dǎo)入昆蟲基因組的定點基因敲入組合 物及其使用方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展完善以及大型基因組注釋項目的實施，生物科 學(xué)的研究進入后基因組時代。研究重心也轉(zhuǎn)向基因功能，即由測定基因的DNA序列、解釋生 命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到從分子整體水平對生物學(xué)功能的研究上，在分子層面上探索人類 健康和疾病的奧秘（Peltonen和McKusick，2001)。不過如何將海量枯燥的基因組信息數(shù)據(jù) 轉(zhuǎn)換成有意義的基因組功能是很大的挑戰(zhàn)，從而需要有高效、可靠的方法來研究基因型對 表型的影響。
[0003] 同源重組機制（HR)可以對基因進行定向失活（Targeted gene inactivation)， 從而幫助科研人員明確基因的功能（Capecchi，2005)。但該方法存，例如效率低、費時 費力、而且有可能導(dǎo)致突變等缺陷。RNA干擾技術(shù)（RNA interference, RNAi)等基因革巴 向敲除技術(shù)是快捷、廉價而且可以開展高通量研究的新方法（Hannon, 2002 ;McManus和 Sharp，2002)。但這種技術(shù)的敲除效果不徹底，每次試驗以及每個實驗室的試驗結(jié)果都 會有差異，還存在不可預(yù)知的脫祀情況（off-target effect),故只能暫時抑制基因功能 (Jackson 等·，2003 ;Jackson 和 Linsley, 2004)。
[0004] 近十年來出現(xiàn)的"基因組編輯技術(shù)（genome editing)"可以對各種細(xì)胞和生物體 內(nèi)的幾乎任意基因進行人工操作。但采用這些技術(shù)實現(xiàn)基因組精準(zhǔn)定點改造的效率依然很 低。
[0005] 昆蟲的代表模式生物是果蠅，早期主要通過放射性誘變或者化學(xué)誘變使果蠅的基 因產(chǎn)生突變。隨著轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)，P因子在果蠅中成為制造突變體的主要方式。然而，單獨 的P因子及其他很多轉(zhuǎn)座子在基因組的一些位置很難插入。同時，上述這些方法不能對基 因組定點進行改造。
[0006] 傳統(tǒng)的果蠅基因組定點改造技術(shù)基于DNA雙鏈缺口（double-strain breaks, DSB)可以誘發(fā)HR的原理，可以分為Ends-out和Ends-in兩種途徑（Rong和 Golic, 2000 ;Maggert等.，2008)。然而，無論是Ends-out還是Ends-in途徑，均存在著繁 瑣，需要大量篩選實驗，所需時間長（6個月甚至1年）的缺點。而且，采用這些方法進行基 因定點改造，HR的發(fā)生概率其實很低，通常低于0. 1% (Huang等.，2009)。總之，傳統(tǒng)果蠅 基因定點改造的方法缺點是效率低、周期長。
[0007] 上述的基因編輯技術(shù)也已應(yīng)用于果蠅。但是這些技術(shù)會產(chǎn)生indels(插入和缺 失，insertions and deletions),不能精確地整合外源DNA，而且外源基因的整合效率不高 (Bassett等·，2014 ;Gratz等·，2014)。雖然基因編輯技術(shù)縮短了操作時間，但是在HR效 率上沒有明顯改進。同時，這些新技術(shù)在進行果蠅基因同源重組的同時未能引入標(biāo)記以提 高后續(xù)的轉(zhuǎn)基因篩選效率。
[0008] 此外，由于昆蟲細(xì)胞不似哺乳動物細(xì)胞那樣，在建立轉(zhuǎn)基因昆蟲品系時，重組組 合物進入昆蟲早期胚胎（如受精卵）后，隨著胚胎的發(fā)育，組合物被隨機分配入極少數(shù) 生殖前體細(xì)胞；生殖細(xì)胞本身的數(shù)目相對較少；昆蟲早期發(fā)育細(xì)胞周期短、細(xì)胞快速分 裂導(dǎo)致實際復(fù)合物濃度快速稀釋，但提供組合物的初始濃度不可能無限制地提高等等原 因，現(xiàn)有技術(shù)中在昆蟲細(xì)胞中誘發(fā)同源重組整合并產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因昆蟲品系的效率 往往不高。目前，現(xiàn)有技術(shù)中制備定點轉(zhuǎn)基因整合昆蟲品系的效率只能達到0.3%，參見 Gratz SJ 等· （2013)Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9nuclease. Geneticsl94:1029 - 35。在地中海黑腹果蠅中，如果預(yù)先制備好特殊的工 具轉(zhuǎn)基因果蠅品系，然后在工具果蠅品系中進行定點轉(zhuǎn)基因整合反應(yīng)，效率也只達到〇~ 10% ;此外，由于需要事先制備工具轉(zhuǎn)基因果蠅品系，不僅操作本身比較繁瑣，而且對于其 他昆蟲物種并沒有實用價值。參見Gratz SJ等.（2014)Highly Specific and Efficient CRISPR/Cas9-Catalyzed Homology-Directed Repair in Drosophila. Genetics. On line publication。
[0009] 綜上所述，本領(lǐng)域急需能將外源性DNA片段高效、精確地導(dǎo)入昆蟲基因組的物質(zhì) 手段和技術(shù)手段，所述外源性DNA片段可以帶有篩選標(biāo)記，更優(yōu)選可視性篩選標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供用于昆蟲定點基因敲入的組合物。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供在昆蟲細(xì)胞中穩(wěn)定、高效地進行定點基因敲入的方法。
[0012] 本發(fā)明還有一目的是提供制備轉(zhuǎn)基因昆蟲的方法。
[0013] 在第一方面，本發(fā)明提供一種用于昆蟲定點基因敲入的重組因子組合物，所述重 組因子組合物由重組因子RecA、Rec0、RecF和RecR中的一種或多種組成或由所述重組因子 的編碼多核苷酸中的一種或多種組成，
[0014] 其中，所述重組因子RecA是：
[0015] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白；或
[0016] (ii)由SEQ ID N0:3所示氨基酸序列經(jīng)過一個或少數(shù)幾個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0017] 所述重組因子RecA的編碼核苷酸序列是：
[0018] ⑴如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；或
[0019] (ii)由SEQ ID N0:3所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:3所7K蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列；
[0020] 所述重組因子RecO是：
[0021] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的蛋白；或
[0022] (ii)由SEQ ID N0:5所示氨基酸序列經(jīng)過一個或少數(shù)幾個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0023] 所述重組因子RecO的編碼核苷酸序列是：
[0024] ⑴如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或
[0025] (ii)由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:5所7K蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列；
[0026] 所述重組因子是RecF是：
[0027] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示的蛋白；或
[0028] (ii)由SEQ ID N0:7所示氨基酸序列經(jīng)過一個或少數(shù)幾個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0029] 所述重組因子RecF的編碼核苷酸序列是：
[0030] ⑴如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列；或
[0031] (ii)由SEQ ID N0:7所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:7所7K蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列；
[0032] 所述重組因子RecR是：
[0033] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白；或
[0034] (ii)由SEQ ID N0:9所示氨基酸序列經(jīng)過一個或少數(shù)幾個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0035] 所述重組因子RecR的編碼核苷酸序列是：
[0036] ⑴如SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列；或
[0037] (ii)由SEQ ID N0:9所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:9所7K蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列。
[0038] 在優(yōu)選的實施方式中，所述重組因子組合物由重組因子RecA、RecO、RecF和RecR 組成或由所述重組因子的編碼多核苷酸組成。
[0039] 在第二方面，本發(fā)明提供一種用于昆蟲定點基因敲入的組合物，所述組合物包含 以下組分：
[0040] 1).單切口酶或其編碼多核苷酸；
[0041] 2).重組因子或其編碼多核苷酸；和
[0042] 3).任選的，包含外源性基因的供體DNA。
[0043] 在優(yōu)選的實施方式中，所述單切口酶在欲加以改造的DNA序列上產(chǎn)生雙重單鏈缺 口或多對雙重單鏈缺口。
[0044] 在優(yōu)選的實施方式中，所述單切口酶在欲加以改造的DNA序列上產(chǎn)生雙重單鏈缺 □。
[0045] 在優(yōu)選的實施方式中，所述單鏈缺口之間的距離為50-500bp ;優(yōu)選70-400bp ;最 優(yōu)選 80-200bp。
[0046] 在優(yōu)選的實施方式中，所述單切口酶包括但不限于：基因工程改造過的I-scel、 I-AniI、Talen-FokI、CRISPR/Cas9 以及一些合成的多核苷酸，如 LNA、PNA。
[0047] 在優(yōu)選的實施方式中，所述單切口酶是Cas9_D10A。
[0048] 在優(yōu)選的實施方式中，所述單切口酶是Cas9_D10A，其是：
[0049] ⑴氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白；或
[0050] (ii)由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或少數(shù)幾個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0051] 所述單切口酶Cas9_D10A的編碼核苷酸序列是：
[0052] ⑴如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；或
[0053] (ii)由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID NO: 1所7K蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列。
[0054] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述重組因子是RecA、Rec0、RecF和RecR中一種或多 種的組合；優(yōu)選地，所述重組因子是RecA、RecO、RecF和RecR的組合。
[0055] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述組合物由以下部分組成：
[0056] 1) ·單切口酶Cas9_D10A或其編碼多核苷酸；
[0057] 2).重組因子RecA、Rec0、RecF和RecR的組合或所述重組因子的編碼多核苷酸的 組合物；
[0058] 3).根據(jù)欲加以改造的昆蟲DNA序列設(shè)計的兩種或兩種以上的sgRNA ;和
[0059] 4).任選的，包含外源性基因的供體DNA。
[0060] 在第三方面，本發(fā)明提供一種昆蟲細(xì)胞定點基因敲入的方法，所述方法包括：
[0061] 1).利用單切口酶或其編碼多核苷酸在欲加以改造的DNA序列上產(chǎn)生雙重單鏈缺 口或多對雙重單鏈缺口；和
[0062] 2).利用重組因子將外源性基因敲入昆蟲細(xì)胞的基因組。
[0063] 在優(yōu)選的實施方式中，利用單切口酶或其編碼多核苷酸在欲加以改造的DNA序列 上產(chǎn)生雙重單鏈缺口。
[0064] 在優(yōu)選的實施方式中，在欲加以改造的DNA序列上產(chǎn)生的單鏈缺口之間的距離為 50-500bp ;優(yōu)選 70-400bp ;最優(yōu)選 80-200bp。
[0065] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述重組因子是RecA、Rec0、RecF和RecR中一種或多 種的組合。
[0066] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述重組因子是RecA、Rec0、RecF和RecR的組合。
[0067] 在優(yōu)選的實施方式中，所述昆蟲包括但不限于：果蠅、蠅、蚊、蝗蟲、白蟻、水稻虱、 蚜蟲、棉鈴蟲等致病或有害昆蟲,或瓢蟲、螳螂等有益昆蟲，蜜蜂、螞蟻等經(jīng)濟昆蟲有益昆 蟲。
[0068] 在優(yōu)選的實施方式中，所述組合物或方法可在昆蟲細(xì)胞中精確整合10kb以上的 外源性DNA片段。
[0069] 在優(yōu)選的實施方式中，所述組合物或所述方法在昆蟲細(xì)胞中誘發(fā)同源重組整合的 效率高于40% ;更優(yōu)選地，高于50% ;最優(yōu)選地，所述組合物或所述方法誘發(fā)同源重組整合 的效率為55~70%。
[0070] 在優(yōu)選的實施方式中，所述組合物或所述方法在昆蟲細(xì)胞中誘發(fā)同源重組整合并 廣生穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因昆蟲品系的效率商于25%。
[0071] 在第四方面，本發(fā)明提供一種制備轉(zhuǎn)基因昆蟲細(xì)胞或個體的方法，所述方法包括 以下步驟：
[0072] 1).利用本發(fā)明第二方面所述的組合物將外源性基因?qū)肜ハx細(xì)胞；和
[0073] 2).由得到的細(xì)胞衍生昆蟲個體或品系。
[0074] 在優(yōu)選的實施方式中，所述昆蟲包括但不限于：果蠅、蠅、蚊、蝗蟲、白蟻、水稻虱、 蚜蟲、棉鈴蟲等致病或有害昆蟲,或瓢蟲、螳螂等有益昆蟲，蜜蜂、螞蟻等經(jīng)濟昆蟲有益昆 蟲。
[0075] 在優(yōu)選的實施方式中，所述昆蟲細(xì)胞包括但不限于昆蟲受精卵、昆蟲原代培養(yǎng)細(xì) 胞、昆蟲細(xì)胞系如S2、Sf9等等。
[0076] 在第五方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一或第二方面所述的組合物在昆蟲細(xì)胞定點基 因敲入或制備轉(zhuǎn)基因昆蟲動物中的用途。
[0077] 在優(yōu)選的實施方式中，所述昆蟲包括但不限于：果蠅、蠅、蚊、蝗蟲、白蟻、水稻虱、 蚜蟲、棉鈴蟲等致病或有害昆蟲,或瓢蟲、螳螂等有益昆蟲，蜜蜂、螞蟻、家蠶等經(jīng)