專利名稱：有效建立誘導的多能干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及改善誘導的多能干細胞(下文稱為iPS)建立效率的方法。更 具體而言，本 發(fā)明涉及改善iPS細胞建立效率的方法，其包括在其核重編程(nuclear reprogramming)步驟中在低氧條件下培養(yǎng)體細胞。
背景技術：
近年來，小鼠和人iPS細胞已相繼建立。Yamanaka等人通過下列誘導iPS細胞 將0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因引入來自報道小鼠(reporter mouse)的成纖維細胞 內，其中將新霉素抗性基因敲入Fbx 15基因座內，并且迫使細胞表達該基因(1，2)。Okita 等人(3)通過下列成功地建立了 iPS細胞(Nanog iPS細胞)，所述iPS細胞顯示與胚胎干 (ES)細胞中的那些幾乎相同的基因表達和后生修飾產生轉基因小鼠，其中綠色熒光蛋白 (GFP)和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog的基因座內，它們的表達比Fbxl5表達更集中于 多能細胞中，迫使得自小鼠的成纖維細胞表達上述4種基因，以及選擇嘌呤霉素抗性和GFP 陽性的細胞。相似結果也由其他小組獲得(4，5)。其后，揭示iPS細胞也可以利用除c-Myc 基因之外的3種因子來產生(6)。此外，Yamanaka等人通過將與小鼠中所使用的那些相同的4種基因引入人皮膚成 纖維細胞內成功建立了 iPS細胞(1，7)。另一方面，Thomson等人的小組使用Nanog和Lin28 代替Klf4和c-Myc產生了人iPS細胞(8，9)。Park等人(10)使用TERT和SV40大T抗原 加上4種因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc產生了人iPS細胞，其中所述TERT被認為是人 細胞無限增殖基因。因此，已證實就通過將所限定的因子引入到體細胞內在人和小鼠二者 中所能夠產生的多能性而言，iPS細胞與ES細胞相當。然而，iPS細胞建立效率低至小于1%。特別地，當通過引入除c-Myc外的3種因 子(0ct3/4、SoX2、Klf4)而產生它們時，會出現(xiàn)極低效率的iPS細胞建立的問題，其中，擔心 c-Myc在組織中會引起腫瘤發(fā)生和由iPS細胞分化的個體成為體細胞。順便提及，可獲得關于細胞的未分化狀態(tài)和多能性的維持與低氧條件之間的關聯(lián) 的某些報告。Ezashi等人(11)觀察到在低氧條件下培養(yǎng)的人ES(hES)細胞的分化被抑制， 暗示在低氧條件下培養(yǎng)以維持關于hES細胞的足夠多能性的必要性。Covello等人(12) 顯示在低氧條件下早期被誘導的轉錄調節(jié)因子(HIF-2ci)能夠誘導0ct3/4的表達，并且 調節(jié)干細胞的功能和分化。此外，Grayson等人(13，14)顯示低氧條件參與人間質干細胞 (hMSCs)的未分化狀態(tài)和多能性的維持。然而，沒有關于已經分化的體細胞中的核重編程過 程和低氧條件之間的關系的報告。提及的參考文獻1.W0 2007/069666 Al2. Takahashi，K.禾口 Yamanaka，S. , Cell, 126 663-676 (2006)3. Okita, K.等人，Nature，448 :313_317 (2007)4. ffernig, M.等人，Nature，448 :318_324 (2007)5. Maherali, N.等人，Cell Stem Cell，1 :55_70 (2007)
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圖1是比較在正常氧濃度(20% )和低氧濃度(5% )下通過將2種基因0ct3/4 和Klf4引入MEF內建立的iPS細胞集落(GFP陽性集落)數(shù)目的圖示Γρ < 0. 05)。圖2顯示通過將2種基因0ct3/4和c_Myc引入MEF內建立的iPS細胞集落(GFP 陽性集落)的圖像[a)相差圖像；b)GFP陽性集落的圖像]。圖3是使用來自在低氧濃度下建立的iPS細胞的RNA執(zhí)行的RT-PCR結果的照片示圖。檢查了關于未分化狀態(tài)的標記0ct3/4 (末端)、Sox2 (末端)、Klf4 (末端)、c-Myc (末 端)、Nan0g、Rexl和ECATl的表達，和引入的外源0ct3/4(Tg)的表達。對應于各個泳道的 樣品如下· 521AH5-1 和 535AH5-2 引入 4 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c_Myc)；細胞在 5% 氧濃度下培養(yǎng)· 535AH1-1 引入4種基因；細胞在氧濃度下培養(yǎng)· 535BH5-1 和 521BH5-3 引入 3 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)；細胞在 5%氧濃度 下培養(yǎng)· 527CH5-U527CH5-2 和 547CH5-1 引入 2 種基因(0ct3/4、Klf4)；細胞在 5%氧 濃度下培養(yǎng).RF8:對照 ES 細胞· 20D17 對照 Nanog-iPS 細胞[Nature，448，313-317 (2007)]在每個小圖右側上的數(shù)字表示PCR循環(huán)數(shù)目。圖4中的上圖顯示通過將在低氧濃度(5% )下用0ct3/4和Klf4建立的小鼠iPS 細胞(527CH5-2)皮下注射到免疫缺陷小鼠內而形成的畸胎瘤照片。圖4中的下圖顯示所獲 得的畸胎瘤的組織學染色圖像(蘇木精-伊紅染色)[a)軟骨組織，b)內胚層上皮組織， c)肌肉組織，d):角質化上皮組織]。圖5顯示通過將在低氧濃度(5%)下由引入2、3或4種細胞建立的iPS細胞顯微 注射到來自ICR小鼠的胚泡內而產生的成年嵌合體照片，在2周齡時獲取。a)得自通過引入4種基因建立的iPS細胞的嵌合小鼠(雄性)(521AH5-1)b)得自通過引入3種基因建立的iPS細胞的嵌合小鼠(雄性)(535BH5-1)c)得自通過引入3種基因建立的iPS細胞的嵌合小鼠(雌性)(535BH5-1)d)得自通過引入2種基因建立的iPS細胞的嵌合小鼠(雄性)(527CH5-1)e)得自通過引入2種基因建立的iPS細胞的嵌合小鼠(雄性)(527CH5-2)圖6顯示關于實施例7的時間表。圖7是在實施例7中在各種培養(yǎng)條件下建立的iPS細胞集落數(shù)目的圖示。“預先 (Pre)”顯示在低氧條件下具有預培養(yǎng)獲得的結果。“4F”、“3F”和“模擬”分別顯示由引入 4 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)、3 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)和空載體獲得的結^ ο圖8是在實施例7中由引入4種基因獲得的iPS細胞集落形態(tài)的照片示圖，在感 染后第40天時獲取。上和下圖分別顯示不具有預培養(yǎng)在低氧條件下獲得的集落和具有預 培養(yǎng)在低氧條件下獲得的那些集落的圖像。圖9是比較通過下列獲得的iPS細胞集落數(shù)目與在正常氧濃度(20% )下獲得的 那些的圖示引入4種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)，并且在5%氧濃度下從感染后第7天開始培養(yǎng)細胞1、2或3周，或直至感染后第40天。3次獨立實驗的結果顯示在一起。圖10是使用來自在低氧濃度下建立的iPS細胞的RNA執(zhí)行的RT-PCR結果的照片示圖。檢查了關于未分化狀態(tài)的標記0ct3/4 (末端)、Sox2 (末端)、Klf4 (末端)、c-Myc (末 端)、Nanog、Rexl、⑶Fl和ESGl的表達。對應于各個泳道的樣品如下‘ 96AH5-2 和 96AH5-3 引入 4 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c_Myc)；細胞在感染后 第7天到第40天之間在5%氧濃度下培養(yǎng)· 96AH5W3-4、96AH5W3-5、96AH5W3-6 引入4種基因；細胞在感染后第7天開始在
5%氧濃度下培養(yǎng)3周· 96BH5-1 引入3種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)；細胞在5%氧濃度下預培養(yǎng)· 201B2 對照 iPS 細胞(Cell, 131，861—872 (2007))在每個小圖右側上的數(shù)字表示PCR循環(huán)數(shù)目。圖11顯示在5%氧濃度下產生的人ES樣集落(a)和所建立iPS集落的堿性磷酸 酶染色(b)的代表性相差圖像。在5%氧濃度下所產生未分化的人iPS細胞的免疫組織化 學染色。Nanog (c)、SSEA3 (d)、SSEA4 (e)。圖12是證實通過引入4種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)且在5%氧濃度下 培養(yǎng)起始細胞(70AH5-2、70AH5-6)建立的人iPS細胞具有三胚層分化潛力的結果的照片示 圖，通過用針對甲胎蛋白、平滑肌肌動蛋白、β III-微管蛋白、GFAP、結蛋白和波形蛋白的抗 體進行染色而獲得。[左相差圖像；右免疫熒光圖像]。圖13顯示通過將人iPS細胞注射到SCID小鼠的睪丸內獲得的畸胎瘤的組織學 染色圖像(蘇木精-伊紅染色)，所述人iPS細胞通過引入4種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、 c-Myc)且在5%氧濃度下培養(yǎng)起始細胞而建立(70AH5-2) [a)神經上皮組織，b)視網膜上 皮組織，c)骨樣組織，d)平滑肌組織，e)內胚層上皮組織]。圖14(a)至(d)是比較在第21天時(a)和在第28天時(b)來自4因子轉導的 MEF、在第21天時(c)和在第28天時(d)來自3因子轉導的MEF的Nanog-GFP-陽性集落 計數(shù)的圖示。圖14(e)和(f)是比較在第21天時來自4因子轉導的MEF(e)和3因子轉導 的MEF(f)的總集落中的GFP陽性集落百分比的圖示。圖15(a)顯示在第9天時在低氧和正常氧條件下含和不含丙戊酸(VPA)培養(yǎng)的來 自4因子轉導的MEF的GFP-陽性細胞百分比的圖示。圖15(b)至(e)顯示在20%氧(b) 和5%氧(c)不含VPA、以及在20%氧(d)和5%氧(e)含VPA的4因子轉導的MEF的代表 性流式細胞術分析。圖16顯示在轉導后第21天時在20%氧((a)；相差，(b) ；GFP)和5%氧((c)；相 差，(d) ；GFP)下的GFP-陽性集落的代表性圖像。比例條表示200 μ m。圖17顯示在第21天時在20%氧(a)和5%氧(b)下4因子感染的MEF、在第28 天時在20%氧(c)和5%氧(d)下3因子感染的MEF的代表性圖像。圖18顯示527CH5-1的核型分析。圖19顯示比較凋亡細胞ES細胞(RF8) (a)和4因子轉導的MEF (b)百分比的圖示。 將ES細胞以1 X IO5細胞/孔的密度接種到STO細胞的飼養(yǎng)層上，并且從第1到3天在正常 氧或低氧下培養(yǎng)。在第3天時，細胞用膜聯(lián)蛋白V-FITC進行處理，并且進行流式細胞術分 析。條形圖表示凋亡細胞(膜聯(lián)蛋白V-FITC陽性)的百分比。在轉導后第4天時將4因子轉導的MEF接種到STO細胞上，并且從第5天到第9天在正常氧或低氧下培養(yǎng)，并且對細 胞實施膜聯(lián)蛋白-V親和力測定法。條形圖表示凋亡細胞百分比。顯示了 3次實驗的平均 值和標準差。圖20顯示比較ES細胞(RF8) (a)以及4因子和模擬轉導的MEF (b)的細胞數(shù)目的 圖示。將ES細胞以1 X IO5細胞/孔的密度接種到STO細胞的飼養(yǎng)層上，并且從第1到3天 在正常氧或低氧下培養(yǎng)。在第3天時，計數(shù)細胞數(shù)目。條形圖顯示ES細胞的細胞計數(shù)。顯 示了 3次實驗的平均值和標準差。從第1到4天4因子和模擬轉導的MEF分別在低氧或正 常氧條件下培養(yǎng)，并且計數(shù)細胞數(shù)目。條形圖顯示細胞計數(shù)。顯示了 4次實驗的平均值和 標準差。> 0. 05
圖21顯示比較在5%氧下的4因子轉導的MEF與在20%氧下的那些的ES細胞特 異性基因(a)和MEF特異性基因(b)的表達模式的散布圖。選擇在ES細胞和MEF中特異 性表達的基因(超過10倍差異)。在用低氧處理的4因子轉導的MEF中上調和下調的基因 分別以紅色和藍色顯示。綠色線表示基因表達水平中的5倍改變。圖22顯示通過定量實時RT-PCR的內源0ct3/4和Nanog的相對表達。圖23(a)顯示在第21天時比較Nanog-GFP-陽性集落計數(shù)的圖示。顯示了 3次實 驗的平均值和標準差。比例條，200μπι。*表示ρ>0.05。圖23(b)至(e)顯示在20%氧 ((b)；相差，(c) ；GFP)和5%氧((d)；相差，(e) ；GFP)下獲得的GFP-陽性集落的代表性圖 像。圖24 (a)顯示在第21天時比較來自通過piggybac轉座重編程的MEF的 Nanog-GFP-陽性集落的每種計數(shù)的圖示。顯示了 3次實驗的平均值和標準差。*和#分別 表示 ρ > 0. 01 和 ρ > 0. 001。圖 24(b)至(e)顯示在 20%氧((b)；相差，(c) ；GFP)和 5% 氧((d)；相差，(e) ；GFP)下獲得的GFP-陽性集落的代表性圖像。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了改善iPS細胞建立效率的方法，其包括在其核重編程步驟中在低氧 條件下培養(yǎng)體細胞。(a)低氧條件如本文所使用的，術語低氧條件表示在細胞培養(yǎng)過程中在環(huán)境大氣中的氧濃度 顯著低于在空氣中的氧濃度。特別地，此種條件包括比通常用于普通細胞培養(yǎng)的5-10% C02/95-90%空氣的環(huán)境大氣中的氧濃度更低的氧濃度；例如，在環(huán)境大氣中18%或更少的 氧濃度是可應用的。優(yōu)選地，在環(huán)境大氣中的氧濃度是15%或更少(例如，14%或更少、 13%或更少、12%或更少、11 %或更少等)、10%或更少(例如，9%或更少、8%或更少、7% 或更少、6 %或更少等)、或5 %或更少(例如，4%或更少、3 %或更少、2 %或更少等)。在環(huán)境 大氣中的氧濃度優(yōu)選是0. 或更多(例如，0.2%或更多、0.3%或更多、0.4%或更多等)、 0. 5%或更多(例如，0. 6%或更多、0. 7%或更多、0. 8%或更多、0. 9%或更多等)、或或 更多(例如，1. 或更多、1.2%或更多、1.3%或更多、1.4%或更多等)。關于在細胞環(huán)境中如何創(chuàng)造低氧條件沒有限制；最容易的合適方法是在允許控制 氧濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。此種CO2培養(yǎng)箱可從許多設備制造廠家商購獲得(例如， 可以使用由 Thermo Scientific、Ikemoto Scientific Technology、Juji Field Inc、禾口 Wakenyaku Co.，Ltd.制造的用于低氧培養(yǎng)的CO2培養(yǎng)箱)。
在低氧條件下開始細胞培養(yǎng)的時機選擇并無具體限制，只要與在正常氧濃度 (20%)下所獲得的比較，它不干擾改善iPS細胞建立效率。起始時間可以在核重編程物質 與體細胞接觸之前或之后，并且可以在接觸的同時。例如，優(yōu)選在低氧條件下的細胞培養(yǎng)緊 接在使核重編程物質與體細胞接觸后開始，或在接觸后的給定時間后(例如，1-10 (例如， 2、3、4、5、6、7、8 或 9)天)開始。在低氧條件下的細胞培養(yǎng)持續(xù)時間并無具體限制，只要與在正常氧濃度(20% ) 下所獲得 的比較，它不干擾改善iPS細胞建立效率；例子包括但不限于，3天或更多、5天或 更多、7天或更多或10天或更多至50天或更少、40天或更少、35天或更少或30天或更少。 在低氧條件下的細胞培養(yǎng)的優(yōu)選持續(xù)時間還依賴環(huán)境大氣中的氧濃度而變；適當時，本領 域技術人員可以根據所使用的氧濃度來調整細胞培養(yǎng)持續(xù)時間。例如，通過使在低氧條件 下與在正常氧濃度下重編程細胞中的ES細胞特異性基因表達比較來決定優(yōu)選持續(xù)時間。 在本發(fā)明的一個實施方案中，當用藥物抗性作為指示物選擇iPS細胞候選集落時，優(yōu)選到 藥物選擇開始時從低氧條件恢復正常氧濃度。此外，優(yōu)選的起始時間和在低氧條件下的細胞培養(yǎng)持續(xù)時間還依賴所使用核重編 程物質的選擇、在涉及正常氧濃度的條件下的iPS細胞建立效率和其他因素而變。例如，當 3種因子0ct3/4、Klf4和Sox2被引入人體細胞內時，優(yōu)選在與核重編程物質接觸后相對較 早開始(例如，在0-3 (例如，1、2)天后)，細胞在低氧條件下培養(yǎng)3-10 (例如，4、5、6、7、8、 9)天。(b)體細胞來源哺乳動物起源(例如小鼠、人)的任何細胞但除生殖細胞外都可以用作原材料用 于在本發(fā)明中產生iPS細胞。例子包括角質化上皮細胞(例如，角質化的表皮細胞)、粘膜 上皮細胞(例如，舌淺層的上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例如，乳腺細胞)、激素分泌細 胞(例如，腎上腺髓質細胞)、用于代謝或貯藏的細胞(例如，肝細胞)、構成界面的內膜上 皮細胞(例如，I型肺泡細胞)、閉膜管的內膜上皮細胞(例如，血管內皮細胞)、含具有運 輸能力的纖毛的細胞(例如，氣道上皮細胞)、用于細胞外基質分泌的細胞(例如，成纖維細 胞)、收縮細胞(例如，平滑肌細胞)、血液和免疫系統(tǒng)細胞(例如，T淋巴細胞)、感覺相關 細胞(例如，桿狀細胞)、自主神經系統(tǒng)神經元(例如，膽堿能神經元)、感覺器官和外周神 經元的支持細胞(例如，衛(wèi)星細胞)、中樞神經系統(tǒng)的神經細胞和神經膠質細胞(例如，星形 膠質細胞)、色素細胞(例如，視網膜色素上皮細胞)、其祖細胞(組織祖細胞)等。關于細 胞分化程度并無限制；即使未分化的祖細胞(包括體干細胞)和終末分化的成熟細胞也同 樣可以在本發(fā)明中作為體細胞來源。未分化的祖細胞的例子包括組織干細胞(體干細胞) 例如神經干細胞、造血干細胞、間質干細胞和牙髓干細胞。作為體細胞來源的哺乳動物選擇并無具體限制；然而，當獲得的iPS細胞將用于 在人中的再生醫(yī)學時，從預防移植物排斥的觀點來看，特別優(yōu)選的是體細胞是患者自己的 細胞或從與患者具有相同或基本上相同的HLA類型的其他人(供體)收集。如本文所使用 的，“基本上相同的HLA類型”表示供體的HLA類型與患者的HLA類型匹配，其程度達到當它 們借助于免疫抑制劑等移植給患者時，可以移入已通過誘導得自供體的體細胞的iPS細胞 分化獲得的移植細胞。例如，基本上相同的HLA類型包括這樣的HLA類型，其中3種主要的 HLAHLA-A、HLA-B和HLA-DR與受體相同(在下文中將應用相同含義)。當獲得的iPS細胞并非施用于(移植給)人，而是用作例如用于篩選用于評估患者的藥物敏感性或不良反應 的細胞來源時，可能必須收集來自患者或具有相同的與藥物敏感性或不良反應相關遺傳多 態(tài)性的其他人的體細胞，。(C)核重編稈物質在本發(fā)明中，“核重編程物質”指能夠由體細胞誘導iPS細胞的任何一種或多種物質，其可以由任何物質例如蛋白質性質因子或編碼它們的核酸(包括摻入載體中的形式) 或低分子化合物組成。當核重編程物質是蛋白質性質因子或編碼其的核酸時，例如下述組 合是優(yōu)選的(在下文中，僅顯示關于蛋白質性質因子的名稱)。(l)0ct3/4、Klf4、c_Myc(2)0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2(Sox2 可由 Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7 或 Soxl8 代替； Klf4可由Klfl、Klf2或Klf5代替；c-Myc可由T58A (活性突變體),N-Myc或L-Myc代替)(3) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、Fbxl5、Nanog、Eras、ECAT15-2, Tell、β -連環(huán)蛋 白(活性突變體S33Y)(4) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT、SV40 大 T(5) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, HPV16E6(6) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, HPV16E7(7) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, HPV6E6、HPV16E7(8) 0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、TERT, Bmil[關于上述顯示因子的更多信息，參見WO2007/069666 (關于在上述組合(2)中 用 Soxl8 代替 Sox2 和用 Klfl 或 Klf5 代替 Klf4 的信息，參見 Nature Biotechnology, 26，101-106(2008))；關于組合“0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2”，還參 β Cell, 126, 663-676(2006)，Cell，131，861-872 (2007)等，關于組合“0ct3/4、Klf4、c-Myc, Sox2、 hTERT、SV40 大 T”，還參見 Nature，451，141-146 (2008).](9) 0ct3/4、Klf4、Sox2 [參見 Nature Biotechnology, 26，101-106 (2008)](10) 0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28 [參見 Science, 318，1917-1920 (2007)](11)0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40 大 T(參見 Stem Cells,26, 1998-2005(2008))(12)0ct3/4、Klf4、c-Myc , Sox2、Nanog、Lin28 [參見 Cell Research(2008)600-603](13)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40 大 T(還參見 Stem Cells, 26， 1998-2005(2008))(14)0ct3/4、Klf4[還參 β Nature, 454,646-650 (2008) ；CellStem Cell, 2 525-528(2008)](15) 0ct3/4、c-Myc [參見 Nature，454，646-650 (2008)](16) 0ct3/4、Sox2 [參見 Nature, 451,141-146 (2008)、W02008/118820](17) 0ct3/4、Sox2、Nanog (參見 W02008/118820)(18)0ct3/4、Sox2、Lin28(參見 W02008/118820)(19)0ct3/4、Sox2、c_Myc、Esrrb (此處，Essrrb 可由 Esrrg 代替；參見 Nat. Cell Biol. ，11，197-203(2009))
(20) 0ct3/4、Sox2、Esrrb (參見 Nat. Cell Biol.，11，197-203 (2009))(21) 0ct3/4、Klf4、L-Myc(22) 0ct3/4、Nanog (23)0ct3/4(24)0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT (參見 Science, 324 797-801(2009))在上述(l)-(24)中，代替0ct3/4，還可以使用Oct家族的其他成員，例如，OctlA、 0ct6等。代替Sox2 (或Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7、Soxl8)，還可以使用Sox家族的其他成員， 例如，Sox7等。代替c-Myc，還可以使用Myc家族的其他成員，例如，L-Myc等。代替Lin28， 還可以使用Lin家族的其他成員，例如，Lin28b等。未落入上述(1)_(24)中，但包含上述(1)_(24)中任一項的所有組成成分，并且進 一步包含任選選擇的其他物質的任何組合也可以包括在本發(fā)明中的“核重編程物質”范圍 中。前提是經歷核重編程的體細胞以足以引起核重編程的水平內源表達上述(1)_(24)中 任一項的一種或多種組成成分，除去一種或多種組成成分僅其余組成成分的組合也可以包 括在本發(fā)明中的“核重編程物質”范圍中。在這些組合中，作為優(yōu)選核重編程物質的例子，可以提及選自0ct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc、Nanog、Lin28和SV40大T的至少一種、優(yōu)選2種或更多、更優(yōu)選3種或更多。如果獲得的iPS細胞將用于治療目的，則優(yōu)選使用3種因子0ct3/4、Sox2和 Klf4[上述的組合(9)]。如果獲得的iPS細胞并非用于治療目的(例如，用作研究工具用 于藥物開發(fā)篩選等)，那么5種因子0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2和Lin28，或由5種因子和 Nanog組成的6種因子[上述的組合(12)]是優(yōu)選的。在這些優(yōu)選組合中，也可以代替c-Myc 使用L-Myc。參考WO 2007/069666 (在該出版物中，Nanog描述為ECAT4)中提及的NCBI登記號 可獲得關于上述蛋白質性質因子的小鼠和人cDNA序列的信息。關于Lin28、Lin28b、ESrrb 和Esrrgd的小鼠和人cDNA序列信息可以分別通過提及下述NCBI登記號獲得)；本領域技 術人員能夠容易地分離這些cDNA。基因名稱小鼠人Lin28NM_145833NM_024674Lin28bNM_001031772 NM_001004317EsrrbNM_011934NM_004452EsrrgNM_011935NM_001438用于用作核重編程物質的蛋白質性質因子可以通過下列制備將獲得的cDNA插 入合適的表達載體內，將載體引入宿主細胞內，并且從培養(yǎng)細胞或其條件培養(yǎng)基中回收重 組蛋白質性質因子。同時，當所使用的核重編程物質是編碼蛋白質性質因子的核酸時，將獲 得的cDNA插入病毒或質粒載體內，以構建表達載體，并且對載體實施核重編程步驟。當物質是蛋白質性質因子時，核重編程物質與體細胞的接觸可以使用本身已知的 用于將蛋白質轉移到細胞內的方法來達到。此種方法包括例如，使用蛋白質轉移試劑的 方法，使用蛋白質轉移結構域(PTD)-或細胞穿透肽(CPP)-融合蛋白的方法，顯微注射法 等。蛋白質轉移試劑是商購可得的，包括基于陽離子脂質的那些，例如BioPOTERProteinDelivery Reagent (Genlantis)、Pro-Ject Protein TransfectionReagent(PIERCE)、 PULSin 遞送試劑(Polyplus-轉染)和ProVectin(IMGENEX)；基于脂質的那些，例如 Profect-I (Targeting Systems)；基于可透過膜的肽的那些,例如 Penetrain Peptide (Q biogene)和Chariot Kit (Active Motif)等。轉移可以根據這些試劑所附的方案——如下 所述的通用操作來達到。在合適溶劑(例如，緩沖溶液例如PBS或HEPES)中稀釋一種或多 種核重編程物質，加入轉移試劑，使混合物在室溫下溫育5-15分鐘，以形成復合物，在將培 養(yǎng)基更換成無血清培養(yǎng)基后，將這種復合物加入細胞中，并且在37°C下溫育細胞1至數(shù)小 時。其后，去除培養(yǎng)基，并且替換成含血清培養(yǎng)基。使用蛋白質轉移試劑的具體方法公開于 2009/073523 或 WO 2009/032456 中。開發(fā)的PTD包括使用蛋白質的跨細胞結構域的那些，例如果蠅衍生的AntP、HIV 衍生的 TAT(Franke 1, A.等人，Cell 55,1189-93(1988)或 Green, Μ. & Loewenstein, P. Μ. Cell 55,1179-88(1988))、穿膜肽(Penetratin) (Derossi, D.等人，J. Biol. Chem. 269，10444-50(1994))、Buforin II (Park, C. B.等人 Proc.Natl Acad. Sci· USA 97， 8245-50(2000))、Transportan (Pooga，Μ·等人 FASEB J. 12，67-77 (1998) )、MAP (模型 兼性肽)(Oehlke，J.等人 Biochim. Biophys. Acta. 1414,127-39 (1998)), K-FGF (Lin, Y. Ζ.等人 J. Biol. Chem. 270，14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M.等人 Nature Cell Biol. 5，352-7 (2003))、朊病毒(Lundberg, P.等人 Biochem. Biophys. Res. Commun. 299， 85-90 (2002))、ρVEC (Elmquist, A.等人 Exp. CellRes. 269，237-44 (2001))、Pep-I (Morris, M. C.等 A Nature Biotechnol. 19，1173-6 (2001))、P印-7 (Gao，C.等 A Bioorg. Med. Chem. 10，4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle，C.等人 Mol· Pharmacol. 57，679-86 (2000))、 HN-I(Hong，F(xiàn). D. & Clayman，G L. Cancer Res. 60，6551-6 (2000))、和 HSV 衍生的 VP22。得自 PTDs 的 CPPs 包括聚精氨酸例如 IlR(Cell Stem Cell，4，381-384 (2009))和 9R(CellStem Cell，4，472-476 (2009))。制備摻入核重編程物質的cDNA和PTD或CPP序列的融合蛋白表 達載體，以允許融合蛋白的重組表達，并且回收融合蛋白用于在轉移中使用。這種轉移可以 如上所述達到，除不添加蛋白質轉移試劑外。使用CPP的具體方法公開于CellStem Cell, 4:472-6(2009)或 Cell Stem Cell,4 :381_4(2009)中。顯微注射(在具有約1 μ m的尖端直徑的玻璃針中放置蛋白質溶液并且將溶液注 射到細胞內的方法)確保將蛋白質轉移到細胞內。核重編程基因的持續(xù)過表達增加了癌發(fā)生的風險；然而，因為蛋白質性質的重編 程因子在轉染的細胞中經歷經由蛋白酶的降解并且逐漸消失，所以蛋白質性質因子的使用 在其中需要高安全性的情況下可以是合適的，如在其中獲得的iPS細胞用于治療目的的情 況下。然而，考慮到易于轉移到體細胞內，核重編程物質還可以優(yōu)選以編碼蛋白質性質 因子的核酸，而不是實際因子的形式使用。核酸可以是DNA或RNA、或DNA/RNA嵌合體，并且 可以是雙鏈或單鏈的。優(yōu)選地，核酸是雙鏈DNA，特別是cDNA。將核重編程物質的cDNA插入合適的表達載體內，所述表達載體包含能夠在宿主 體細胞中起作用的啟動子?？梢允褂玫谋磉_載體包括例如病毒載體，例如逆轉錄病毒、慢 病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和仙臺病毒，用于在動物細胞中表達的質粒(例如， pAl-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。適當時，可以根據獲得的iPS細胞的預期用途進行選擇所使用的一類載體。在表達載體中所使用的啟動子的例子包括EF-α啟動子、CAG啟動子、SRa啟動 子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV (巨細胞病毒)啟動子、RSV (勞斯(Rous)肉瘤病毒)啟 動子、MoMuLV (莫洛尼(Moloney)小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK (單純皰疹病毒胸苷激酶) 啟動子等，優(yōu)先考慮EF-α啟動子、CAG啟動子、MoMuLV LTR、CMV啟動子、SR α啟動子等。
需要時，除啟動子外，表達載體還可以包含增強子、多腺苷酸化信號、可選標記基 因、SV40復制起點等?？梢允褂玫目蛇x標記基因的例子包括二氫葉酸還原酶基因、新霉素 抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。當2種或更多核酸被引入細胞內作為核重編程物質時，核酸可以由分別的載體攜 帶，并且多個核酸可以串聯(lián)連接，以獲得多順反子載體。在后面的情況下，為了實現(xiàn)有效的 多順反子表達，希望口蹄疫病毒的2A自身切割肽(參見Science，322，949-953，2008等)、 IRES序列等，優(yōu)選2A序列連接在各個核酸之間。具有核酸作為核重編程物質的表達載體可以通過本身已知的技術根據選擇的載 體引入細胞內。在病毒載體的情況下，例如將包含核酸的質粒引入合適的包裝細胞(例如， Plat-E細胞)或互補細胞系(例如，293細胞)內，回收在培養(yǎng)上清液中產生的病毒載體， 并且通過適合于病毒載體的方法使細胞感染載體。例如，使用逆轉錄病毒載體的具體方法 公開于 W02007/69666、Cell，126，663-676 (2006)和 Cell，131，861-872 (2007)中。使用慢 病毒載體的具體方法公開于Science，318，1917-1920 (2007)中。使用腺病毒載體的具體方 法公開于 Science, 322，945-949 (2008)中。如上所述，當iPS細胞用于治療目的時，核重編程基因的持續(xù)過表達潛在增加了 在由iPS細胞分化的組織和器官中的癌發(fā)生風險；因此，作為核重編程物質的核酸優(yōu)選瞬 時表達，而不整合到細胞的染色體內。根據這個觀點，優(yōu)選使用罕見其整合到染色體內的腺 病毒載體。使用腺病毒載體的具體方法公開于Science，322，945-949 (2008)中。因為腺伴 隨病毒載體整合到染色體內的頻率也很低，并且就細胞毒性和炎癥誘導性而言低于腺病毒 載體，所以它可以作為另一種優(yōu)選載體提及。因為仙臺病毒載體能夠穩(wěn)定存在于染色體外， 并且需要時可以使用siRNA進行降解且去除，所以它也是優(yōu)選利用的。關于仙臺病毒載體， 可以使用 J.Biol. Chem.，282，27383-27391 (2007)和 JP-3602058B 中描述的那種。當使用逆轉錄病毒載體或慢病毒載體時，即使轉基因的沉默已發(fā)生，它也可以變 得再活化；因此，例如，優(yōu)選可以使用其中作為核重編程物質的核酸當變得不需要時使用 Cre-IoxP系統(tǒng)切掉的方法。即，用預先排列在核酸的2個末端處的IoxP序列，誘導iPS細 胞，其后使用質粒載體或腺病毒載體允許Cre重組酶作用于細胞，并且可以切掉由IoxP序 列夾在中間的區(qū)域。因為LTR U3區(qū)域的增強子-啟動子序列可能通過插入突變上調在其 附近的宿主基因，所以更優(yōu)選避免內源基因通過保留在基因組中的未切掉IoxP序列外的 LTR的表達調節(jié)，使用通過如下制備的3'自身滅活的(SIN)LTR 缺失序列，或用例如SV40 的多腺苷酸化序列置換序列。使用Cre-IoxP系統(tǒng)和SIN LTR的具體方法公開于Chang等 人，Stem Cells, 27 1042-1049 (2009)中。同時，作為非病毒載體，可以使用脂轉染法、脂質體法、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀 法、DEAE葡聚糖法、顯微注射法、基因槍法等將質粒載體轉移到細胞內。此外，當使用質粒 載體時，它整合到染色體內是罕見的，轉基因通過細胞中的DNA酶得到降解且去除；因此，當iPS細胞用于治療目的時，質粒載體的使用可以是另一種優(yōu)選的實施方案的模式。使用 質粒作為載體的具體方法在例如Science，322，949-953 (2008)等中描述。另一種優(yōu)選的非整合型載體是附加型載體，它可在染色體外自主復制。使用附加型載體的具體方法公開于Science，324，797-801 (2009)中。此外，當使用腺病毒或質粒時，轉基因可以被整合到染色體內；因此，最終需要通 過Southern印跡或PCR證實不存在基因插入染色體內。為此，如同上述Cre-IoxP系統(tǒng)， 使用其中轉基因整合到染色體內其后去除基因的方法可以是有利的。在另一種優(yōu)選的實 施方案的模式中，可以使用一種方法，其中轉基因使用轉座子被整合到染色體內，其后使用 質粒載體或腺病毒載體允許轉座酶作用于細胞，以便從染色體中完全消除轉基因。作為優(yōu) 選轉座子的例子，可以提及piggyBac，得自鱗翅目昆蟲的轉座子等。使用PiggyBac轉座 子的具體方法公開于 Kaji，K.等人，Nature, 458 :771_775 (2009)、Wolt jen 等人，Nature, 458:766-770(2009)中。在另一個實施方案中，在啟動子區(qū)中的四環(huán)素應答元件(Tet-OnR & Tet-Off R Gene Expression Systems, Clontech)可以用于切除轉基因。將腺病毒或非病毒表達載體引入體細胞內的操作重復次數(shù)并無具體限制，轉染可 以執(zhí)行一次或更多任選選擇的次數(shù)(例如，1-10次、1-5次等)。當2個或更多種類的腺病 毒或非病毒表達載體被引入體細胞內時，所有這些種類的腺病毒或非病毒表達載體被同時 引入體細胞內是優(yōu)選的；然而，即使在這種情況下，轉染也可以執(zhí)行一次或更多任選選擇的 次數(shù)(例如，1-10次、1-5次等)，優(yōu)選地轉染可以重復執(zhí)行2次或更多次(例如，3次或4 次)。當核重編程物質是低分子化合物時，它與體細胞的接觸可以這樣達到將所述物 質以合適的濃度溶解于含水或非含水溶劑中，將溶液加入適合于培養(yǎng)從哺乳動物例如人或 小鼠中分離的體細胞的培養(yǎng)基中[例如，包含約5-20%胎牛血清的最小必需培養(yǎng)基(MEM)、 達爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基及其組合 等]，從而使得核重編程物質濃度將落入到足以引起體細胞中的核重編程并且不引起細胞 毒性的范圍中，并且培養(yǎng)細胞給定的時間段。核重編程物質濃度依賴所使用的核重編程物 質種類而變，并且適當時選擇為在約0. InM-約IOOnM的范圍內。接觸的持續(xù)時間并無具體 限制，只要它足以引起細胞的核重編程；通常，可以允許核重編程物質在培養(yǎng)基中共存直至 出現(xiàn)陽性集落。(d) iPS細胞建立效率改進劑近年來，改善通常很低的iPS細胞建立效率的各種物質已相繼提出。當與體細胞 連同上述核重編程物質一起接觸時，這些建立效率改進劑預期進一步提高iPS細胞建立效率。iPS細胞建立效率改進劑的例子包括但不限于，組蛋白脫乙?；?HDAC)抑 制劑[例如，丙戊酸(VPA) (Nat. Biotechnol.，26 (7) =795-797 (2008)]，低分子抑制劑 例如曲古抑菌素A、丁酸鈉、MC 1293和M344，基于核酸的表達抑制劑例如針對HDAC的 siRNA 禾Π shRNA(例如，HDACl siRNA Smartpool (Millipore)、針對 HDACl 的 HuSH29 聚 體shRNA構建體(OriGene)等)，等]、DNA甲基轉移酶抑制劑(例如，5'-氮雜胞苷) [Nat. Biotechnol. ,26(7) :795_797 (2008) ]，G9a組蛋白甲基轉移酶抑制劑[例如，低分 子抑制劑例如BIX-01294 (Cell Stem Cell，2 :525_528 (2008)]，基于核酸的表達抑制劑例如針對 G9a 的 siRNA 和 shRNA[例如，G9a siRNA (人)(Santa CruzBiotechnology)等)， 等]，L-通道鈣激動劑(例如，Bayk8644) [CellStem Cell, 3，568-574 (2008) ]，p53 抑制 劑[例如，針對 p53 的 siRNA 和 shRNA (Cell Stem Cell，3，475-479 (2008) )、UTFl [Cell Stem Cell，3，475-479 (2008)]，Wnt 信號誘導物(例如，可溶性 Wnt3a) [CellStem Cell, 3，132-135 (2008) ]，2i/LIF[2i是絲裂原活化蛋白激酶信號和糖原合酶激酶_3的抑制劑， PloS Biology, 6 (10)，2237-2247 (2008)]等。如上所述，基于核酸的表達抑制劑可以為具有 編碼siRNA或shRNA的DNA的表達載體形式。
在上述核重編程物質的組成成分中，例如SV40大T等也可以包括在iPS細胞建立 效率改進劑的范圍中，因為它們被視為體細胞核重編程的非必需的但是輔助的因子。在關 于核重編程的機制仍不明了的情況下，并非核重編程必需的輔助因子可以方便地被視為核 重編程物質或iPS細胞建立效率改進劑。因此，因為體細胞核重編程過程被理解為起因于 一種或多種核重編程物質和一種或多種iPS細胞建立效率改進劑與體細胞接觸的總體事 件，所以似乎本領域技術人員無需總是區(qū)分重編程物質和iPS細胞建立效率改進劑。如上所述對于下列3種情況的每一種都可以達到iPS細胞建立效率改進劑與體細 胞的接觸(a)改進劑是蛋白質性質因子，(b)改進劑是編碼蛋白質性質因子的核酸，和(c) 改進劑是低分子化合物。iPS細胞建立效率改進劑可以和核重編程物質同時與體細胞接觸，或任何一種可 以預先接觸，只要與不存在改進劑的情況下比較，iPS細胞由體細胞的建立效率得到顯著改 善。在一個實施方案中，例如，當核重編程物質是編碼蛋白質性質因子的核酸和iPS細胞建 立效率改進劑是化學抑制劑時，iPS細胞建立效率改進劑可以在基因轉移處理后細胞培養(yǎng) 給定時間長度后被加入培養(yǎng)基中，因為核重編程物質涉及從基因轉移處理到蛋白質性質因 子的大量表達的給定延時長度，而iPS細胞建立效率改進劑能夠快速作用于細胞。在另一 個實施方案中，當核重編程物質和iPS細胞建立效率改進劑都以病毒或非病毒載體形式使 用時，例如，2種可以被同時引入細胞內。從哺乳動物例如小鼠或人中分離的體細胞可以使用本身已知適合于其培養(yǎng)的培 養(yǎng)基進行預培養(yǎng)，這依賴于細胞的種類。此種培養(yǎng)基的例子包括但不限于包含約5-20%胎 牛血清的最小必需培養(yǎng)基(MEM)、達爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640培養(yǎng)基、 199培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基及其組合等。可獲得通過在5%或更少的低血清濃度下進行預培養(yǎng)， 改善iPS細胞建立效率的報告(例如，W02009/006997)。當在使細胞與一種或多種核重編 程物質和一種或多種iPS細胞建立效率改進劑的接觸中使用例如轉染試劑，例如陽離子脂 質體時，有時優(yōu)選先用無血清培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，以防止轉染效率中的減少。在一種或多種 核重編程物質(和一種或多種iPS細胞建立效率改進劑)與細胞接觸后，可以在適合于培 養(yǎng)例如ES細胞的條件下培養(yǎng)細胞。在小鼠細胞的情況下，通過向普通培養(yǎng)基中添加作為分 化抑制劑的白血病抑制因子(LIF)進行培養(yǎng)。同時，在人細胞的情況下，希望加入堿性成纖 維細胞生長因子(bFGF)和/或干細胞因子(SCF)代替LIF。通常，在作為飼養(yǎng)細胞的小鼠 胚胎衍生的成纖維細胞(MEF)的共存在下培養(yǎng)細胞，所述MEF用輻射或抗生素處理，以終 止其細胞分裂。通常，STO細胞等通常用作MEF，但對于誘導iPS細胞，通常使用SNL細胞 [McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073-1085 (1990)]等。與飼養(yǎng)細胞的共培養(yǎng)可以在 核重編程物質接觸前、接觸時或接觸后(例如，10天后)開始。
iPS細胞的候選集落可以通過用藥物抗性和報道物活性作為指示劑的方法，以及 通過基于形態(tài)目測的方法進行選擇。作為前者的例子，使用重組體細胞選擇對于藥物抗 性和/或報道物活性陽性的集落，在所述重組體細胞中藥物抗性基因和/或報道基因靶 向在多能細胞中高度特異性表達的基因的基因座(例如，F(xiàn)bxl5、Nanog, 0ct3/4等，優(yōu)選 Nanog或0ct3/4)。此種重組體細胞的例子包括來自具有敲入Fbxl5基因座中的β geo (其 編碼β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸轉移酶的融合蛋白)基因的小鼠的MEF[Takahashi & Yamanaka, Cell，126，663-676 (2006)]、來自具有整合在Nanog基因座中的綠色熒光 蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因的轉基因小鼠的MEF[Okita等人，Nature, 448, 313-317(2007)]等。同時，基于形態(tài)目測的后面一種方法的例子包括由Takahashi等人在 Cell, 131,861-872(2007)中描述的方法。盡管使用報道細胞的該方法是方便和有效 的，但 從安全性的觀點來看，當iPS細胞制備用于人治療目的時，希望通過目測選擇集落。當3種 因子0ct3/4、Klf4和Sox2用作核重編程物質時，建立的集落數(shù)目減少，但所得到的集落大 多數(shù)是與ES細胞相當?shù)母哔|量的iPS細胞，從而使得甚至無需使用報道細胞也可以有效建 立iPS細胞。選擇的集落細胞作為iPS細胞的同一性可以這樣加以證實通過對Nanog(或 0ct3/4、Fbxl5)報道物(GFP陽性、β -半乳糖苷酶陽性等)的陽性應答和對選擇標記(嘌 呤霉素抗性、G418抗性等)的陽性應答，以及通過可見ES細胞樣集落的形成，如上所述。然 而，為了確保更高的準確度，可以執(zhí)行諸如分析各種ES細胞特異性基因的表達且將選擇的 細胞移植給小鼠且證實畸胎瘤形成的測試。因此建立的iPS細胞可以用于各種目的。例如，通過利用用于ES細胞的分化誘導 的報道方法，可以誘導iPS細胞分化成各種細胞(例如，心肌細胞、血細胞、神經細胞、血管 內皮細胞、胰島素分泌細胞等)。因此，使用從患者收集的體細胞誘導iPS細胞將使得基于 自體移植的干細胞治療成為可能，其中iPS細胞分化成所需細胞(患者的受影響器官的細 胞、對疾病具有療效的細胞等)，并且將分化細胞移植給患者。不是從患者而是從具有與患 者具有相同或基本上相同的HLA類型的其他人收集的體細胞可以用于誘導iPS細胞，這分 化成所需細胞用于在給患者的移植中使用。此外，因為由iPS細胞分化的功能細胞(例如， 肝細胞)被認為比相應的現(xiàn)有細胞系更好地反映功能細胞在體內的實際狀態(tài)，所以它們還 可以適合于用于就藥物候選化合物的有效性和毒性的體外篩選等。本發(fā)明在下文借助于下述實施例進一步詳細描述，然而，本發(fā)明決不限制于所述 實施例。
實施例實施例1 低氧培養(yǎng)法對iPS細胞建立的作用(1)具有Nanog報道物的小鼠用作實驗系統(tǒng)。通過將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和 嘌呤霉素抗性基因插入購自BACPAC Resources的BAC (細菌人工染色體)的Nanog基因座 內制備所使用的 Nanog 報道物[Okita K.等人，Nature 448，313-317 (2007)]。小鼠 Nanog 基因在多能細胞例如ES細胞和早期胚胎中特異性表達。已變得對這種報道物陽性的小鼠 iPS細胞已知就分化潛能而言幾乎等價于ES細胞。對得自具有這種Nanog報道物的Nanog 報道小鼠的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和尾尖成纖維細胞(TTF)借助于逆轉錄病毒進行轉染，以建立iPS細胞，并且計算表達來自Nanog報道物的EGFP的集落，以評估iPS細胞建立效率。通過將每種逆轉錄病毒表達載體[pMXs_0ct3/4、pMXs_Sox2、pMXs_Klf4、 pMXs-cMyc :Cell，126，663-676 (2006)]引入在前一天以 2 X IO6 細胞 /IOOmm 培養(yǎng)皿 (Falcon)接種的Plat-E細胞(Morita，S.等人，Gene Ther. 7，1063-1066)內，制備用于重編 程的逆轉錄病毒。所使用的培養(yǎng)基是DMEM/10 % FCS [補充有10 %胎牛血清的DMEM (Nacalai Tesque)]，并且細胞在5% CO2的存在下于37°C進行培養(yǎng)。對于載體引入，將27 μ L FuGene6 轉染試劑(Roche)置于 300 μ IOpti-MEM I Reduced-Serum Medium(Invitrogen)中，并且 允許培養(yǎng)基在室溫下靜置5分鐘。其后，加入9 μ g每種表達載體，并且允許培養(yǎng)基在室溫 下靜置15分鐘，并且隨后加入Plat-E培養(yǎng)肉湯。在第2天時，用新鮮培養(yǎng)基替換Plat-E 培養(yǎng)上清液。在第3天時，回收培養(yǎng)上清液并且過濾通過0. 45 μ m無菌濾器(Whatman)，加 入聚凝胺(Nacalai Tesque)以獲得4 μ g/mL的濃度，并且將其用作病毒液體。從在Nanog報道小鼠受精后13. 5天時的胎兒分離小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)，并且用培養(yǎng)基(DMEM/10% FCS)進行培養(yǎng)。所使用的尾尖成纖維細胞(TTF)是如下獲得的將 Nanog報道小鼠的尾尖切碎，將組織小片靜置在明膠包被的6孔皿上，將它們在原代培養(yǎng)細 胞起始培養(yǎng)基(Toyobo Life Science Department)中培養(yǎng)5天，并且用DMEM/10% FCS培 養(yǎng)基進一步培養(yǎng)從尾尖組織移動到皿上的成纖維細胞。不表達Nanog基因，則MEF和TTF不表達EGFP，并且不發(fā)出綠色熒光。不表達嘌 呤霉素抗性基因，則MEF和TTF對抗生素嘌呤霉素敏感。像這樣，將MEF和TTF以IXlO5 細胞/孔接種至用0. 1 %明膠(Sigma)包被的6孔培養(yǎng)板(Falcon)。所使用的培養(yǎng)基是 DMEM/10% FCS,并且細胞在37°C和5% CO2下進行培養(yǎng)。第二天，加入每種逆轉錄病毒液體 以通過過夜感染引入基因。在病毒感染后第3天開始，使用補充LIF的ES細胞培養(yǎng)基[通過向DMEM(Nacalai Tesque)中加入15 %胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、100 μ M非必需氨基 B. (Invitrogen)UOOyM 2- Jfl S Zi Il (Invitrogen) >50U/mL ^MM (Invitrogen)禾口 50mg/mL鏈霉素(Invitrogen)制備]培養(yǎng)細胞。在感染后第4天時，回收MEF和TTF的 培養(yǎng)基，并且通過加入ImL PBS洗滌細胞。在去除PBS后，加入0.25%胰蛋白酶/ImM EDTA(Invitrogen)，并且允許反應在37°C下進行約5分鐘。細胞浮起后，通過加入ES細胞 培養(yǎng)基使它們懸??；將IX IO4MEF細胞(當引入4種因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc時) 或IX IO5MEF細胞(當引入3種因子0ct3/4、Sox2和Klf4時)接種至具有先前接種在其 上的飼養(yǎng)細胞的100-mm皿。對于TTF細胞，以相同方式接種2X IO4TTF細胞(當引入上述 4種因子時)UXlO5TTF細胞(當引入上述3種因子時)、或1.5X IO5TTF細胞(當引入3 種因子0ct3/4、Klf4和c-Myc時)。所使用的飼養(yǎng)細胞是用絲裂霉素C處理以終止其細胞 分裂的 SNL 細胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073-1085 (1990)]。隨后，每 2 天 用新鮮供應更換ES細胞培養(yǎng)基，直至集落變得可被觀察到。在感染后第5至14天之間，在設為正常氧濃度(20%)或低氧濃度(5%、1%)的 培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)中培養(yǎng)細胞。對于用 4 種因子(0ct3/4、Sox2、Klf4、c_Myc) 感染的細胞，用嘌呤霉素(1.5yg/mL)的選擇在第14天時開始，并且對于用3種因子 (0ct3/4、Sox2、Klf4或0ct3/4、Klf4、c-Myc)感染的細胞在第21天時開始。對于4種因子集落在約第10天時出現(xiàn)，并且對于3種因子在約第20天時出現(xiàn)，并且逐漸變得GFP陽性。在感染后第21和28天時，計數(shù)GFP陽性集落；在正常氧濃度(20%)下培養(yǎng)的細 胞和在低氧濃度(5%、1% )下培養(yǎng)的那些之間進行比較。關于MEF的結果顯示于表1中； 關于TTF的結果顯示于表2和3中。這些結果證實iPS細胞建立效率由于在低氧條件下的 細胞培養(yǎng)而增加。特別地，當氧濃度為5%時，獲得良好結果(表1-3)。在引入3種因子的 情況下，發(fā)現(xiàn)不僅可以用0ct3/4、Sox2和Klf4，還可以用0ct3/ 4、Klf4和c_Myc建立iPS 細胞(表2)。表 1
b)、c)和d))。此外，低氧處理增加在來自4或3因子轉導的MEF的總集落中的GFP陽性集 落百分比(圖14e)和f))。在低氧處理后獲得的GFP陽性集落在形態(tài)和大小方面與在正常 氧濃度條件下獲得的那些相當(圖16)。堿性磷酸酶染色顯示在5%氧下的培養(yǎng)增加具有 陽性堿性磷酸酶活性的集落數(shù)目(圖17)。為了研究GFP陽性細胞是否較早檢測出，從轉導后第5天到第9天，在20 %氧下或 在5%氧下含或不含2mM丙戊酸(VPA)培養(yǎng)4因子轉導的MEF，并且在第9天時實施流式細 胞術分析。在轉導后第9天時，4種因子的逆轉錄病毒表達誘導0. 01%的細胞成為GFP陽 性。用低氧或用VPA處理4因子轉導的MEF4天分別使GFP陽性細胞百分比增至0. 40%和 0.48%。此外，用低氧和VPA的共處理使GFP陽性細胞百分比增至2. 28%。這些數(shù)據暗示 GFP陽性細胞可以較早被檢測出，并且低氧培養(yǎng)與VPA具有協(xié)同作用(圖15a)、b)、c)、d) 和 e))。隨后，使用成人表皮成纖維細胞(HDF)檢查低氧培養(yǎng)的作用。借助于逆轉錄病毒 引入全都得自人的4種因子(0CT3/4、S0X2、KLF4、c-MYC)或3種因子(0CT3/4、S0X2、KLF4)， 如Cell，131,861-872(2007)中所述。病毒感染后6天，回收細胞并且再接種到飼養(yǎng)細胞 上。所使用的飼養(yǎng)細胞是用絲裂霉素C處理以終止其細胞分裂的SNL細胞[McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073-1085 (1990)]。第二天，用通過將 4ng/ml 重組人 bFGF (WAKO)加 入靈長類動物ES細胞培養(yǎng)(ReproCELL)中制備的培養(yǎng)基使細胞開始細胞培養(yǎng)。在感染后第7天和集落計數(shù)日(感染后第24和32天)之間，在設為正常氧濃度 (20%)或低氧濃度(5%、1%)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。結果顯示于表4中。當引入4種因 子時，與正常氧濃度比較，iPS細胞建立效率在5%的氧濃度下升高。同時，當氧濃度為 時或當引入3種因子時，在這個實驗中檢查的培養(yǎng)條件下未獲得iPS細胞，這涉及細胞在低 氧條件中的長期維持。這暗示用更極端的低氧條件，例如的氧濃度，或利用3種因子的 引入，這基本上產生比4種因子更低的iPS細胞建立效率，可能必須使在低氧條件下的細胞 培養(yǎng)具有較短的持續(xù)時間。表 4
實施例2 低氧培養(yǎng)法對iPS細胞建立的作用(2)進行實驗以測定低氧培養(yǎng)法對于僅引入2種基因0ct3/4和Klf4是否有效。實驗 使用來自與實施例1中相同的Nanog報道小鼠的MEF。以與實施例1相同的方式，使MEF感在感染后第5至14天之間，在設為正常氧濃度(20%)或低氧濃度(5%)的培養(yǎng) 箱(Thermo Scientific)中培養(yǎng)細胞。無需藥物選擇繼續(xù)培養(yǎng)，直至第28天計數(shù)GFP陽性 集落時。結果顯示于圖1中。執(zhí)行4次獨立實驗。當氧濃度為20%時，集落僅在4次實驗 之一中出現(xiàn)，而當氧濃度為5%時，集落在所有4次實驗中都出現(xiàn)。如圖1中所示，與20% 氧濃度比較，GFP陽性集落的數(shù)目對于在5%氧濃度下的細胞培養(yǎng)顯著增加&<0.05)；發(fā) 現(xiàn)低氧培養(yǎng)在提高iPS細胞建立效率方面有效。執(zhí)行進一步的實驗以測定低氧培養(yǎng)法是否對于2種基因0ct3/4和c-Myc的轉 移也有效。以與上述用0ct3/4和Klf4描述相同的方式使用Nanog-MEF執(zhí)行實驗。在感 染后第5至14天之間，在設為正常氧濃度(20%)和低氧濃度(5%)的培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)中培養(yǎng)細胞。無需藥物選擇繼續(xù)培養(yǎng)，直至第42天檢查GFP陽性集落時。因此， 當培養(yǎng)在正常氧濃度(20% )下進行時，未出現(xiàn)GFP陽性集落，而當培養(yǎng)在低氧濃度(5% ) 下進行時，集落出現(xiàn)(圖2)。這些發(fā)現(xiàn)顯示iPS細胞建立效率可以通過在低氧條件下培養(yǎng) 起始細胞得到改善，即使引入2種基因0ct3/4和c-Myc。實施例3 在小鼠iPS細胞中關于未分化狀態(tài)標記的表達使用Rever Tra Ace試劑盒(Takara)通過RT-PCR分析檢查在實施例1和2中建 立的MEF衍生的iPS細胞中關于未分化狀態(tài)標記的表達。所使用的引物序列由SEQ ID NO 1-18顯示。RT-PCR結果顯示于圖3中。通過在低氧濃度(5%、1%)下的細胞培養(yǎng)由引入4 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)、3 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)或 2 種基因(0ct3/4、 Klf4)建立的iPS細胞全都表達在ES細胞中特異性表達的基因，即0ct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc、Nanog、Rexl和ECAT1，表達的量等價于在小鼠ES細胞(RF8)和過去用4種基因建立 的iPS細胞[20D17 :Nature, 448, 313-317 (2007)]中的那些。因為未觀察到引入的0ct3/4 基因(0ct3/4(Tg))的表達，所以證實沉默發(fā)生?；谶@些結果，在低氧條件下建立的細胞 被鑒定為iPS細胞。實施例4 建立的iPS細胞用于畸胎瘤形成的潛力在低氧濃度(5% )下用0ct3/4和Klf4建立的小鼠iPS細胞(527CH5-2)允許形 成畸胎瘤，如Cell，126，663-676 (2006)中所述。具體地，將1 X 106iPS細胞皮下注射到免 疫缺陷小鼠內；4周后，分離呈現(xiàn)的畸胎瘤(圖4中的上圖)。將每個畸胎瘤切碎，并且在含 4%甲醛的PBS(-)中固定。石蠟包膜的組織進行切片并且用蘇木精-伊紅進行染色。結果 顯示于圖4中的下圖中。在組織學上，腫瘤由多種細胞組成，其中觀察到軟骨組織、內胚層 上皮組織、肌肉組織和角質化上皮組織。因此，證實了 iPS細胞的多能性。實施例5 嵌合小鼠的產生將在實施例1和2中在低氧濃度(5%)下由引入2、3或4種基因建立的iPS細胞 顯微注射到來自ICR小鼠的胚泡內。因此，產生成年嵌合體。結果顯示于圖5中。實施例6 :iPS細胞系的核型在實施例1和2中在低氧處理后獲得的iPS細胞系(521AH5-1和527CH5-1)的核 型，并且這些細胞系顯示正常核型(圖18)。
實施例7 低氧培養(yǎng)的持續(xù)時間對人iPS細胞建立的作用檢查了在低氧條件(5%)下的細胞培養(yǎng)起始時間和持續(xù)時間對人iPS細胞建立效 率的作用。所使用的體細胞是成人表皮成纖維細胞(成人HDF)。關于低氧培養(yǎng)的時間表顯 示于圖6中。首先，如Cell，131,861-872(2007)中所述，使用慢病毒允許HDF表達小鼠同 向性病毒受體Slc7al基因。借助于逆轉錄病毒將全都得自人的4種因子(0ct3/4、Sox2、 Klf4、c-Myc)或 3 種因子(0ct3/4、Sox2、Klf4)引入這些細胞(8X105 細胞)內，如 Cell， 131,861-872(2007)中所述。病毒感染后6天，回收細胞并且再接種到飼養(yǎng)細胞上(在引入 4種基因的情況下，1 X 105細胞/100mm皿；在引入3種基因的情況下，5X 105細胞/100mm 皿)。所使用的飼養(yǎng)細胞是用絲裂霉素C處理以終止其細胞分裂的SNL細胞[McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell62,1073-1085 (1990)]。第二天，使用通過將 4ng/ml 重組人 bFGF (WAK0)加 入靈長類動物ES細胞培養(yǎng)(ReproCELL)中制備的培養(yǎng)基開始細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)在6種條件下繼續(xù)(1)在正常氧濃度(20%)下直至感染后第40天時， 或在低氧濃度(5%)下從感染后第7天開始1周(2)、1.5周(3)、2周(4)、或3周(5)，并 且隨后在正常氧濃度(20%)下直至感染后第40天時，和(6)在低氧濃度(5%)下在感染 后第7到40天之間。還檢查的是通過在低氧濃度(5%)下在感染后當天到再其接種到飼 養(yǎng)細胞上之間預培養(yǎng)細胞，并且在上述的條件(1)至(6)中的任何下進一步培養(yǎng)它們獲得 的結果。計數(shù)到感染后第24、32和40天時出現(xiàn)的iPS細胞集落。這3種計數(shù)的結果一起 顯示于圖7中。利用4種基因的引入，與正常氧濃度(20% )比較，當細胞在上述的低氧濃度條件 (2)至(6)的任何下培養(yǎng)時，iPS細胞建立效率較高。此外，即使利用在低氧濃度下的預培 養(yǎng)，也觀察到在增加iPS細胞建立效率中的作用。利用4種基因的引入在感染后第40天時 獲得的集落圖像顯示于圖8中。利用3種基因的轉移，與正常氧濃度比較，當在低氧濃度下執(zhí)行預培養(yǎng)時建立更 大數(shù)目的iPS細胞(圖7)。利用4 種基因(0Ct3/4、Klf4、SOX2、C-MyC)的引入，在上述的條件(1)、(2)、(4)、 (5)和(6)下執(zhí)行3次獨立實驗。結果一起顯示于圖9中。在所有情況下，與正常氧濃度 (20%)比較，當培養(yǎng)在低氧濃度(5%)下進行時，iPS細胞建立效率提高。特別地，通過在 低氧濃度下從感染后第7天開始2周或更久的細胞培養(yǎng)獲得顯著作用。實施例8 在人iPS細胞中關于未分化狀態(tài)標記的表達使用Rever Tra Ace試劑盒(Takara)通過RT-PCR分析檢查在實施例7中建立的 成人HDF衍生的iPS細胞中關于未分化狀態(tài)標記的表達。所使用的引物序列由SEQ ID NO 19-36顯示；RT-PCR結果顯示于圖10中。通過在低氧濃度(5% )下的細胞培養(yǎng)由引入4種 基因(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)或 3 種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)建立的 iPS 細胞全都 表達在ES細胞中特異性表達的基因，即0ct3/4、Sox2、Klf4、c_Myc、Nanog、Rexl、⑶F3和 ESG1，表達的量等價于過去用4種基因建立的iPS細胞[201B2 :Cell，131，861—872 (2007)] 中的那些。基于這些結果，在低氧濃度下建立的細胞被鑒定為iPS細胞。此外，這些iPS細胞對于堿性磷酸酶都是強陽性的，并且免疫細胞化學染色顯示 所有iPS細胞都表達Nanog、SSEA3和SSEA4 (圖11)。實施例9 體外分化誘導
將人iPS細胞接種至低結合皿，并且如Cell，131,861-872(2007)中所述培養(yǎng)8 天以形成胚狀體(EB) (100mm皿)，其中，通過引入4種基因0ct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc, 并且在5%氧濃度下在感染后第7天到第40天之間培養(yǎng)起始細胞建立所述人iPS細 胞(70AH5-2、70AH5-6)。培養(yǎng)8天后，使用抗體使胚狀體染色，所述抗體針對內胚層細 胞分化標記甲胎蛋白(R&D systems)，中胚層細胞分化標記平滑肌肌動蛋白(DAK0)、結 蛋白(NeoMarkers)和波形蛋白(Santa Cruz)，以及外胚層分化標記0III-微管蛋白 (Chemicon)和GFAP(DAKO)。結果顯示于圖12中。這種染色證實這些標記的表達，證實建 立的人iPS細胞具有用于三胚層分化的潛力。實施例10 關于建立的iPS細胞的畸胎瘤形成的潛力就畸胎瘤形成的潛力檢查人iPS細胞，其中，通過引入4種基因并且在5%氧濃度 下培養(yǎng)起始細胞建立所述人iPS細胞(70AH5-2)。在補充有重組人bFGF(4ng/ml)和Rho 激酶抑制劑Y-27632 (10 u M)的靈長類動物ES細胞培養(yǎng)基(IteproCELL)中培養(yǎng)人iPS細胞 (70AH5-2)。1小時后，用膠原IV處理并且收集細胞，這之后經由離心回收它們，并且懸浮于 補充有Y-27632(10iiM)的DMEM/F12中。將已變得匯合(100mm皿)的四分之一細胞量注 射到SCID小鼠的睪丸內。9周后，將所得到的腫瘤切碎，并且在含4%甲醛的PBS(-)中固 定。對石蠟包埋的組織進行切片并且用蘇木精-伊紅進行染色。結果顯示于圖13中。在 組織學上，腫瘤由多種細胞組成，其中觀察到神經上皮組織、視網膜上皮組織、骨樣組織、平 滑肌組織和內胚層上皮組織。因此，證實了 iPS細胞的多能性。實施例11 低氧培養(yǎng)對增殖、存活和基因表達的作用使用膜聯(lián)蛋白V的流式細胞術分析證實低氧培養(yǎng)對小鼠ES細胞或4因子轉導的 MEF無保護作用(圖19)。此外，低氧培養(yǎng)顯示對小鼠ES細胞的增殖沒有作用(圖20a))。 盡管從轉導后第1天到第4天的低氧溫育對模擬轉導的MEF的增殖沒有顯著作用，但它對 4因子轉導的MEF有顯著作用(圖20b))。為了研究細胞在重編程過程中的表達譜，執(zhí)行微 陣列分析和定量實時RT-PCR。從第1天到第4天，在低氧和正常氧濃度下培養(yǎng)的4因子轉 導的MEF的微陣列分析顯示，73. 2%的ES細胞特異性基因(總共1045種基因中的765種 基因)在用低氧處理的細胞中上調，并且85.8%的MEF特異性基因(總共1142種基因中的 980種基因)下調(圖21a)和b))。此外，定量實時RT-PCR分析證實，在低氧處理3天后， 內源0ct3/4和Nanog的表達在4因子轉導的MEF中分別增加3. 4倍和2. 1倍(圖22a)和 b))。為了排除低氧通過刺激ST0細胞來增強iPS細胞產生的可能性，在不含ST0細胞 的飼養(yǎng)層的低氧培養(yǎng)下檢查了 iPS細胞的生長情況。圖23顯示在5%氧下的培養(yǎng)增加了 GFP陽性集落的數(shù)目，暗示重編程的低氧增強并非由ST0細胞介導。實施例12 通過在低氧培養(yǎng)下表達質粒載體的瞬時轉染建立iPS細胞如先前所述(0kita，K，等人Science 322，949-953，(2008))執(zhí)行由質粒轉染產生 iPS細胞。簡言之，將包含Nanog-GFP-IRES-Puror報道物的MEF以1. OX 105細胞/孔接種 在6孔板中(第0天)。在第1、3、5和7天時，用pCX-0KS-2A和pCX-c-Myc轉染細胞，并且 在第9天時，用胰蛋白酶收獲細胞，并且再接種到具有ST0飼養(yǎng)細胞的100-mm皿上。在第 25天時，計數(shù)GFP陽性集落的數(shù)目。對于低氧處理，從第10天到第24天，細胞在5%氧下 培養(yǎng)。
25 表5顯示低氧培養(yǎng)使GFP陽性集落數(shù)目增加2. 0倍。表5
實施例13 通過在低氧培養(yǎng)下的piggyback轉染系統(tǒng)建立iPS細胞
如先前所述且具有某些修改(Woltjen等人，Nature ；458 =766-70, (2009))執(zhí)行由
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26piggyback(PB)轉座的直接重編程。簡言之，將包含Nanog-GFP-IRES-Purc/報道物的MEF以 1. 0X105細胞/孔接種在6孔板中。培養(yǎng)24小時后，F(xiàn)ugene HD (Roche, Switzerland)用于 為細胞轉染PB-TET-MKOS、PB-CA-rtTA Adv和PB轉座酶表達載體。24小時后，用含多西環(huán) 素的培養(yǎng)基(1. 5ug/ml)替換培養(yǎng)基(第0天)。細胞在低氧或正常氧條件下進行培養(yǎng)，并且 在第 12 天時計數(shù) GFP 陽性集落數(shù)目。PB-TET-MK0S 和 PB-CA-rtTA adv 由 Addgene (Addgene 質粒20910和20959)提供。PB轉座酶構建體通過PCR由pBSII-IFP2_orf (來自Dr. Malcolm J. Fraser, Jr，University of Notre Dame的慷慨贈予)進行擴增，并且插入經由CAG-啟 動子(pCX-EGFP)驅動的表達載體內。圖24顯示低氧處理5和10天分別使GFP陽性集落數(shù)目增加2. 9倍和4. 0倍。這 些數(shù)據暗示低氧可以增加通過非病毒載體例如Piggybac轉座系統(tǒng)的iPS產生效率。雖然本發(fā)明已著重于優(yōu)選實施方案進行描述，但對于本領域技術人員顯而易見的 是，優(yōu)選實施方案可以進行修改。本發(fā)明意欲本發(fā)明可以通過除本說明書中詳細描述的那 些外的方法來實現(xiàn)。因此，本發(fā)明包含了在所附“權利要求”的要旨和范圍中包含的所有修 改。此外，本文引用的所有出版物包括專利和專利申請中公開的內容在此通過參考整 體引入，其程度與它們已在本文中公開一樣。本申請基于美國臨時專利申請?zhí)?1/084，842,61/141, 177和61/203，931，所述美 國臨時專利申請的內容在此通過參考引入。
權利要求
改善誘導的多能干細胞建立效率的方法，其包括在其核重編程步驟中在低氧條件下培養(yǎng)體細胞。
2.權利要求1的方法，其中在環(huán)境大氣中的氧濃度為_10%。
3.權利要求2的方法，其中所述在環(huán)境大氣中的氧濃度為-5%。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中核重編程物質是下述物質，或編碼它們的 核酸
5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其包括將丙戊酸在所述核重編程步驟中用作效 率改進劑的進一步步驟。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中在接觸核重編程物質后，在低氧條件下執(zhí) 行培養(yǎng)體細胞超過3天。
全文摘要
提供的是改善誘導的多能干細胞建立效率的方法，其包括在其核重編程步驟中在低氧條件下培養(yǎng)體細胞。
文檔編號C12N5/10GK101848994SQ20098010006
公開日2010年9月29日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權日2008年7月30日
發(fā)明者吉田善紀, 山中伸彌 申請人:國立大學法人京都大學