的用 REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體與ZNF580基因的混合物。從圖中可以看出當(dāng)?shù)妆却?于等于10時(shí)用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體就可以很好的阻滯ZNF580基因的遷移, 說(shuō)明當(dāng)?shù)妆却笥诘扔?0時(shí)用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體可以和ZNF580基因形 成穩(wěn)定的包結(jié)物。
[0044] 圖9為實(shí)施例6中PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV基因載體與ZNF580基因復(fù)合物對(duì) EA. hy926細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果。PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV基因載體與DNA的N/P比為20。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-色氨酸的多肽簡(jiǎn)稱為CREDVW, 委托上海吉爾生化有限公司制備。
[0046] 分子量為2000的端基為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的異端聚乙二醇簡(jiǎn)稱 為0PSS-PEG-NHS,購(gòu)于北京鍵凱科技有限公司。
[0047] 分子量為2000-5000的聚乙二醇單甲醚,購(gòu)于天津希恩思生化科技有限公司。
[0048] 分子量為1800的支鏈的聚乙烯亞胺,購(gòu)于天津希恩思生化科技有限公司。
[0049] 1-溴乙基苯購(gòu)于百靈威科技有限公司。
[0050] 式(II)所示的帶苯環(huán)基的聚甲基丙烯酸羥乙酯梳型大分子引發(fā)劑簡(jiǎn)稱為PHEMA。
[0051] 式(III)所示的疏水性聚酯內(nèi)核簡(jiǎn)稱為PHEMA-PCL。
[0052] 式(IV)所示的羧基端疏水性聚酯內(nèi)核簡(jiǎn)稱為PHEMA-PCL-C00H。
[0053] 式(V)所示的帶兩種親水段修飾的梳型聚合物簡(jiǎn)稱為PHEMA-PCL-PEI-PEG。
[0054] 式⑴所示的用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體簡(jiǎn)稱為 PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV。
[0055] 式(I)中的
代表沒(méi)有連接巰基的半胱氨酸C。
[0056] 帶兩種親水段修飾的梳型聚合物(V)通過(guò)聚乙烯亞胺的氨基與0PSS-PEG-NHS中 的琥珀酰亞胺酯反應(yīng),將0PSS-PEG-NHS引入到帶兩種親水段修飾的梳型聚合物(V)表面, 再通過(guò)半胱氨酸的巰基與0PSS-PEG-NHS的吡啶二硫基反應(yīng),從而制備得到用REDV多肽修 飾的雙親梳形基因載體。通過(guò)檢測(cè)色氨酸的熒光發(fā)射峰,判斷CREDVW多肽成功連接。
[0057] 實(shí)施例1:用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體的制備方法,包括如下步驟:
[0058] (1)帶苯環(huán)基的聚甲基丙烯酸羥乙酯梳型大分子引發(fā)劑(II-1)的制備:
[0059] 在氮?dú)夥毡Wo(hù)下,將聚合管高溫烘烤除水,自然冷卻后在鼓吹氮?dú)饬鞯耐瑫r(shí),依次 加入37.0臟〇1甲基丙烯酸輕乙酯反應(yīng)單體,0.0581111]1〇1溴化亞銅和0.1171111]1〇12,2'-聯(lián) 吡啶催化劑以及〇.〇73mmol 1-溴乙基苯引發(fā)劑到無(wú)水丁酮溶劑中使溶解,密封后在液氮 冷卻下,反復(fù)進(jìn)行抽真空,通氮?dú)獠僮?次,在60°C反應(yīng)20小時(shí)得混合液,混合液用二氯 甲烷稀釋后過(guò)硅膠柱除去未反應(yīng)的溴化亞銅,然后用冰乙醚沉淀后真空干燥得白色產(chǎn)物 PHEMA(II-l) 〇
[0060] 采用N,N-二甲基甲酰胺做溶劑,利用烏式粘度計(jì)在30°C恒溫水浴中測(cè)定PHEMA的 粘度,通過(guò)Mark-Houwink方程=人計(jì)算得到PHEMA的粘均分子量(α = 〇. 78, K = 7.9X102cm3/g)為 12500。x+y= (12500-184)/130 = 95。
[0061] 4 NMR(DMS0-d6, δ,ppm) :4. 810 (0H),3. 905 (C00CH2),3. 585 (CH20H),1. 783 (CH2CC H3), 0· 775(CH2CCH3)。見(jiàn)圖 1。
[0062] (2)疏水性聚酯內(nèi)核(III-l)的制備:
[0063] 在氮?dú)夥毡Wo(hù)下,將制得的0. 0133mmol PHEMA(II-l)加入到無(wú)水Ν,Ν-二甲基甲 酰胺溶劑中使溶解,攪拌均勻后加入ε -己內(nèi)酯和催化劑辛酸亞錫密封后,反復(fù)進(jìn)行抽真 空,通氮?dú)獠僮?次后,在11(TC聚合反應(yīng)26小時(shí),冷卻到室溫,用二氯甲烷溶解得到粗產(chǎn) 物,粗產(chǎn)物經(jīng)冰乙醚沉析、分離,沉淀物真空干燥后得到白色的PHEMA-PCL(ΙΙΙ-1)。
[0064] ε-己內(nèi)酯與ΡΗΕΜΑ的摩爾比為30:1,為0. 399mmol ;所述辛酸亞錫與ε-己內(nèi)酯 的摩爾比為1:800,為0. 5 μ mol。
[0065] NMR (CDCl3-d, δ , ppm) :4.079 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0) ,3.668 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OH), 2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO), 1. 400, 1. 664 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO), x+y =95。
[0066] 通過(guò)聚ε -己內(nèi)酯上的亞甲基(C0(CH2) (CH2)3(CH2)0C0)的特征吸收峰面積和末 端ε-己內(nèi)酯上的亞甲基(C0(CH2)(CH2)3(CH2)0H)的特征吸收峰面積比得到主鏈上連接 ε -己內(nèi)酯的重復(fù)單元數(shù)為27,即η = 27。見(jiàn)圖2。
[0067] (3)羧基端疏水性聚酯內(nèi)核(IV-1)的制備:
[0068] 在氮?dú)夥毡Wo(hù)下,將 13. Ομπιο? PHEMA-PCL(III-l),0· 976mmol 丁二酸酐, 0. 976mmol催化劑4-二甲氨基吡啶和326 μ mol縛酸劑三乙胺加入到30mL無(wú)水二氧六環(huán)中 使溶解,在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí),在冰乙醚中沉析得到粗產(chǎn)物,真空干燥,干燥物用N,N-二 甲基甲酰胺溶解,用截留分子量為7000的透析管在蒸餾水中透析48h,冷凍干燥,得到白色 的 PHEMA-PCL-C00H (IV-1)。4 NMR (CDCl3-d,δ,ppm) : 4. 081 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0),2. 6 71 (C0CH2CH2C0),2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO),1. 402, 1. 665 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO);見(jiàn) 圖3。
[0069] x+y = 95, η = 27。
[0070] (4)帶兩種親水段修飾的梳型聚合物(V-l)的制備:
[0071] 在氮?dú)夥毡Wo(hù)下,將 1. 22μπιο1 PHEMA-PCL-C00H(IV-1),0. 122mmol 1-(3-二 甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺,0. 073mmol N-羥基丁二酰亞胺,0. 049mmol 4-二甲氨 基吡啶,0. 0245mmol分子量為2000的聚乙二醇單甲醚和0. 067mmol分子量為1800的 支鏈的聚乙烯亞胺加入到4mL二甲基亞砜和2mL三氯甲烷的混合溶劑中使溶解,在室溫 攪拌反應(yīng)24h,用截留分子量為7000的透析管在蒸餾水中透析48h,冷凍干燥,得到白色 的 PHEMA-PCL-PEI-PEG(V-l)。4 匪R(CDCl3-d, S,ppm):4.081〇:0(CH2)(CH2)3(CH 2)(XO ),3. 680(0CH2CH2),3· 401 (CH30),3· 154-2. 401 (NHCH2CH2NH), 2. 327(C0(CH2) (CH2)3(CH2) 0C0), 1. 665, 1. 403(C0(CH2) (CH2)3(CH2)0C0);見(jiàn)圖 4。
[0072] 通過(guò)聚乙二醇單甲醚上的亞甲基(0CH2CH2)的特征吸收峰面積和聚乙烯亞胺上的 亞甲基(NHCH2CH2NH)的特征吸收峰面積比得到x:y = 7:1。
[0073] 其中 x+y = 95, η = 27, m = 45, 43ml+86m2 = 1740 ;
[0074] 實(shí)驗(yàn)證明,用二氯甲烷替代本步驟中的三氯甲烷,其它同本步驟,可以完成本步 驟;
[0075] (5)在氮?dú)夥毡Wo(hù)下,將 60mg PHEMA-PCL-PEI-PEG(V-l)和 7. 5mg 分子量為 2000 的0PSS-PEG-NHS用3mL pH = 7. 4的0. lmol/L磷酸緩沖溶液和3mL二甲基亞砜的混合 溶劑溶解,在暗室中于室溫下反應(yīng)4h,加入2. 63mg CREDVW多肽,室溫下反應(yīng)4h,產(chǎn)物 用截留分子量為10000的透析管在蒸餾水中透析48h,冷凍干燥,得到白色的用REDV多 肽修飾的雙親梳形基因載體PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV (I-1)。在激發(fā)波長(zhǎng)為290nm時(shí), PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV在360nm處有明顯的熒光發(fā)射峰。見(jiàn)圖7。
[0076] 反應(yīng)路線為:
[0077]
[0083] REDVW是由精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-色氨酸構(gòu)成的多肽。
[0084] 通過(guò)測(cè)定不同濃度的純CREDVW多肽在360nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度,得到熒光發(fā)射 峰強(qiáng)度和CREDVW多肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y = 5429. 3C(mg/mL)+12. 3(R2 = 0. 999),
[0085] 測(cè)定式(1-1)所示物質(zhì)在360nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度,通過(guò)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì) 算出式(1-1)中含有的CREDVW多肽的質(zhì)量,從而測(cè)定得到:CREDVW多肽的質(zhì)量占式(1-1) 總質(zhì)量的2%。
[0086] 檢測(cè)實(shí)施例1制備的用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體(1-1)在水溶液中的 粒徑分布,其范圍在30-200nm之間,平均粒徑在100nm左右,見(jiàn)圖5。在干態(tài)下的粒徑在 30-100nm之間,平均粒徑在50nm左右,見(jiàn)圖6。
[0087] 在中性水溶液中表面Zeta電位為15_33mv。
[0088] 實(shí)施例2:用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體的制備方法,包括如下步驟:
[0089] (1)帶苯環(huán)基的聚甲基丙烯酸羥乙酯梳型大分子引發(fā)劑(II-2)的制備:
[0090] 在氮?dú)夥毡Wo(hù)下,將聚合管高溫烘烤除水,自然冷卻后在鼓吹氮?dú)饬鞯耐瑫r(shí),依次 加入600mmol甲基丙烯酸輕乙酯反應(yīng)單體,1. 2mmol溴化亞銅和2. 4mmol 2, 2' -聯(lián)批陡催化 劑以及l(fā)mmol 1-溴乙基苯引發(fā)劑到無(wú)水丁酮溶劑中使溶解,密封后在液氮冷卻下,反復(fù)進(jìn) 行抽真空,通氮?dú)獠僮?次,在80°C反應(yīng)24小時(shí)得混合液,混合液用二氯甲烷稀釋后過(guò)中性 氧化鋁柱除去未反應(yīng)的溴化亞銅,然后用冰乙醚沉淀后真空干燥得白色產(chǎn)物PHEMA(