一種tRNASer(UCN)基因檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體 tRNASerWCN)基因A7445C突變檢測(cè)方法及試劑盒的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是影響人們正常生活的常見疾病，新生兒中患有先天性耳聾的比例約為千分 之一，而有60%W上的先天性耳聾患者是由遺傳因素引起的。根據(jù)除耳聾W外是否有其他 并發(fā)癥，可W將遺傳性耳聾分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾，前者在遺傳性耳聾中約 占30%，后者所占比例約為70%。
[0003] 線粒體是一種由兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)氧化憐酸化和合成Ξ憐酸腺巧 (AT巧的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，所W有"細(xì)胞動(dòng)力工廠"之稱。除了為細(xì)胞供能 夕F，線粒體還參與如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞調(diào)亡等過程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì) 胞周期的能力。
[0004] 線粒體DNA，尤其是12SrRNA和tRNASerWCN)基因是與耳聾相關(guān)的基因突變熱點(diǎn) 區(qū)域。2006年GuanMX等人發(fā)現(xiàn)，tRNASerWCN)A7445C突變可能與非綜合征性耳聾相關(guān)。
[0005] 目前對(duì)于突變檢測(cè)最常用方法為第一代測(cè)序技術(shù)，但此技術(shù)對(duì)儀器要求高，操作 繁瑣且成本昂貴，結(jié)果誤差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段長(zhǎng)度 多態(tài)性（PCR-RFL巧是目前應(yīng)用較廣泛、相對(duì)成熟的檢測(cè)方法，但操作繁瑣，操作過程中影 響結(jié)果的不確定因素太多；近年來，變性高效液相色譜值HHX)和基因忍片的應(yīng)用為點(diǎn)突 變檢測(cè)提供了思路，檢測(cè)技術(shù)靈敏度和特異度均較高，自動(dòng)化程度高，適合高通量檢測(cè)，但 設(shè)及儀器昂貴，需專人操作，不適合廣泛推廣。因此，迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)易的 突變篩查方法應(yīng)用與臨床突變篩查。
[0006] 中國(guó)專利CN201310172063. 0公開了一種檢測(cè)耳聾相關(guān)的線粒體DNAT7505C突變 的試劑盒，由DNA提取混合液、擴(kuò)增T7505C片段的PCR混合液、針對(duì)T7505C設(shè)計(jì)的一對(duì)外 引物、針對(duì)T7505C設(shè)計(jì)的一對(duì)內(nèi)引物、限制性內(nèi)切酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和盒體組成。但 是該方法在操作過程中存在雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的等問題，很難通過一次測(cè)序獲得 精確的數(shù)據(jù)。
[0007] 中國(guó)專利CN200910050224. 2公開了一種線粒體基因耳聾相關(guān)新突變12201T>C 所在序列具有序列1的結(jié)構(gòu)；采用線粒體基因耳聾相關(guān)新突變對(duì)耳聾患者進(jìn)行線粒體突變 位點(diǎn)優(yōu)先檢測(cè)，有助于排除或診斷線粒體基因突變導(dǎo)致的耳聾；可采用線粒體基因耳聾相 關(guān)新突變制備診斷探針、引入突變?cè)斐擅盖形稽c(diǎn)的引物和試劑盒，能簡(jiǎn)便快捷的進(jìn)行線粒 體相關(guān)耳聾的篩查。但是該利用該結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，且儀器設(shè)備昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：提供了一種操作簡(jiǎn)便、易掌握的tRNASeHUCN) 基因檢測(cè)方法及應(yīng)用，對(duì)儀器設(shè)備及操作人員無特殊要求，適合在一般醫(yī)院、分子生物實(shí)驗(yàn) 室開展，為全國(guó)性開展非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體tRNASerWCN) 7445A乂突變的大規(guī)模 篩查和預(yù)防性檢查提供條件。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種線粒體tRNASerWCN)基因A7445C突變 檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑和酶切反 應(yīng)試劑。
[0010]所述提取樣本全基因組DNA的試劑可W進(jìn)一步包括：裂解液、溶液I、酪-氯 仿-異戊醇混合液和溶液II;所述溶液I為蛋白酶K溶液，溶液II為氨氧化鋼溶液； W11] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑還可W進(jìn)一步包括：dNTP、10XPCR緩沖液、MgC12、引物、 Taq酶和Ξ蒸水；
[0012] 所述酶切反應(yīng)試劑還可W進(jìn)一步包括：限制性內(nèi)切酶甜alMIX體系和Ξ蒸水。
[0013] 所述引物序列優(yōu)選為：
[0014]SerWCN)F5，-ACGCCAAAATCCATTTCACT-3 '
[0015]SeHUCN)R5，-CGGGAATTGCATCTGTTTTT-3，。
[0016] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突 變檢測(cè)中使用的引物，所述引物特異性的擴(kuò)增包含7445位點(diǎn)的序列，并且擴(kuò)增的序列中不 含有其它TCTAGA回文結(jié)構(gòu)。
[0017] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突 變檢測(cè)中使用的引物，所述引物中無連續(xù)出現(xiàn)的5個(gè)同一堿基，GC含量為40%，無引物二聚 體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)引物人工合成。
[0018] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明再提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突 變的檢測(cè)方法，所述方法包括：
[0019]步驟SO 1，提取全基因組DNA;
[0020]步驟S02，特異性PCR擴(kuò)增及酶切；
[0021] 步驟S03,突變鑒定。
[0022] 所述步驟S02,特異性PCR擴(kuò)增及酶切，可W進(jìn)一步包括：采用專一性限制性內(nèi)切 酶甜al在一對(duì)Ser(UCN)F和Ser(UCN)R引物的配合下，對(duì)樣本的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增和酶切；
[0023] 所述Ser〇JCN)F和Ser〇JCN)R引物的擴(kuò)增優(yōu)選包含7445位點(diǎn)的序列，且擴(kuò)增的序 列中不含有其它TCTAGA回文結(jié)構(gòu)；
[0024] 所述檢測(cè)方法優(yōu)選利用特異性PCR擴(kuò)增技術(shù)和專一性限制性內(nèi)切酶Xbal特異性 的識(shí)別TCTAGA回文結(jié)構(gòu)的特性，每份DNA樣本通過一次特異性的PCR反應(yīng)和一次酶切反應(yīng) 進(jìn)行檢測(cè)。
[00巧]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了一種前述任一項(xiàng)線粒體tRNASeHUCN)基 因A7445C突變檢測(cè)中使用的引物在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[00%] 所述步驟SOI，提取全基因組DNA，可W進(jìn)一步包括：運(yùn)用蛋白酶K消化裂解蛋白 質(zhì)，然后采用酪-氯仿-異戊醇法從細(xì)胞/血液/組織樣本中提取全基因組DNA。
[0027] 述步驟S03,突變鑒定，可W進(jìn)一步包括：將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行聚丙締酷胺凝膠電 泳，根據(jù)酶切后產(chǎn)生的DNA片段大小不同，檢測(cè)線粒體tRNASerWCN)基因7445位點(diǎn)突變狀 況。
[0028] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0029] 1.本發(fā)明的所用標(biāo)本血液、尿液、組織等采集后仍可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，如血液樣 本可建立永生化類淋己母細(xì)胞系、尿液細(xì)胞可用于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、組織可用于誘導(dǎo)多功 能干細(xì)胞的建立，可保存珍貴的遺傳資源。
[0030] 2.本發(fā)明試劑盒借助特異性PCR技術(shù)與專一性限制性內(nèi)切酶甜al特異性的 識(shí)別TCTAGA回文結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，每份DNA樣本用1對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用專 一性限制性內(nèi)切酶Xbal進(jìn)行1次酶切即可在幾小時(shí)內(nèi)對(duì)非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體 tRNASeHUCN)基因A7445C突變進(jìn)行檢測(cè)。
[0031] 3.與其他檢測(cè)方法相比，本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、易掌握；對(duì)儀器設(shè)備及操作 人員無特殊要求，適合在一般醫(yī)院、分子生物實(shí)驗(yàn)室開展，為全國(guó)性開展非綜合征性耳聾相 關(guān)的線粒體tRNASeHUCN)7445A乂突變的大規(guī)模篩查和預(yù)防性檢查提供條件。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明實(shí)施方式所述的特異性條帶擴(kuò)增循環(huán)條件圖；
[0033] 圖2為本發(fā)明實(shí)施方式所述突變樣本、對(duì)照樣本PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物圖；
[0034] 圖3為本發(fā)明實(shí)施方式所述突變樣本、對(duì)照樣本測(cè)序峰圖；
[0035] 圖4為本發(fā)明檢測(cè)方法流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]W下將結(jié)合實(shí)施方式來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù) 手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)W實(shí)施。
[0037] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施方式及實(shí)施方式中的特征可 W相互組合。
[0038] 本發(fā)明通過酶切法進(jìn)行非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體tRNASerWCN) 7445A乂突 變檢測(cè)，克服了現(xiàn)有方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作難、成本高等缺點(diǎn)，提供非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒 體tRNASerWCN) 7445A乂突變檢測(cè)試劑盒，W及該方法或該的試劑盒在檢測(cè)與非綜合征性 耳聾相關(guān)的線粒體tRNASerWCN) 7445A乂突變檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0039] 本發(fā)明的一實(shí)施方式中，提供了一種線粒體tRNASeHUCN)基因A7445C突變檢測(cè) 試劑盒，所述試劑盒包括：提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑和酶切反應(yīng)試 劑。
[0040]所述提取樣本全基因組DNA的試劑可W進(jìn)一步包括：裂解液、溶液I、酪-氯 仿-異戊