鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株和野毒株的檢測(cè)試劑與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及用于鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株 和野毒株的二重?zé)晒舛縋CR引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該引物和探針進(jìn)行豬偽狂犬 病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因檢測(cè)的方法和檢測(cè)試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)引起的一種以發(fā)熱、奇 癢及腦脊髓炎為主要臨床癥狀的急性傳染病，可致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及胎兒干尸化；對(duì) 初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)，麻痹，衰竭死亡，死亡率100% ;成年豬常為隱性 感染，耐過(guò)的呈隱性感染的成年豬是該病的主要傳染源。豬偽狂犬病最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，因臨 床表現(xiàn)與狂犬病類(lèi)似，故稱(chēng)偽狂犬病。20世紀(jì)60年代之前豬偽狂犬病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)未造成重大 危害，然而在60?70年代，搶毒株的出現(xiàn)導(dǎo)致豬場(chǎng)爆發(fā)該病的數(shù)量顯著增長(zhǎng)，且各日齡豬 均可感染，癥狀也明顯加劇，這種變化在美國(guó)和西歐廣泛存在。該病在全球范圍內(nèi)的流行呈 上升趨勢(shì)，世界上已有50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道該病的流行。我國(guó)1947年劉永純從豬體分 離到PRV以來(lái)，已有24個(gè)省、自治區(qū)的報(bào)道流行。
[0003] 豬偽狂犬病毒屬于皰瘆病毒科甲型皰瘆病毒亞科，豬皰瘆病毒I型。目前，PRV只 發(fā)現(xiàn)一種血清型，但不同毒株在生物學(xué)特性和毒力等方面有差異。PRV具有泛嗜性，可以在 多種組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖，且可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變及核內(nèi)嗜酸性包涵體，對(duì)兔腎和豬腎 細(xì)胞尤為敏感。PRV基因組為線形雙鏈DNA，大小約180kb，GC%含量高達(dá)74%。PRV基因 組由72個(gè)閱讀框組成，可編碼70種蛋白，目前發(fā)現(xiàn)和命名的有11種糖蛋白，其中g(shù)B、gC、 gD、gE和gl基因編碼的糖蛋白與病毒的毒力有關(guān)。目前已有的PRV的檢測(cè)方法主要有病 毒分離鑒別、動(dòng)物接種試驗(yàn)、免疫學(xué)檢測(cè)方法、血清學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。用 于PCR檢測(cè)的主要為gB、gE和gH基因，其中g(shù)E基因 GC%含量高達(dá)74. 16%，gH基因是病 毒復(fù)制所必須，并且糖蛋白gH在皰瘆病毒中較為保守。
[0004] 由于目前我國(guó)廣泛使用的豬偽狂犬病疫苗為gE基因缺失的疫苗，該基因是PRV的 主要毒力因子之一，但不是病毒復(fù)制所需的，而gD與病毒復(fù)制有關(guān)，存在于疫苗株和野毒 株中。因此，若能提供一種能夠同時(shí)鑒別gE基因和gD基因的方法，將有助于快速鑒別區(qū)分 豬偽狂犬病野毒株和gE基因缺失株（PRV疫苗株），有助于有效判斷豬是否感染野毒株的 PRV。目前，現(xiàn)有的PRV檢測(cè)方法基于ELISA、PCR和病毒分離等方法普遍存在敏感性低、耗 時(shí)長(zhǎng)等不足，這非常不利于該病防控工作的開(kāi)展。因此，若能提供一種能夠同時(shí)鑒別gE基 因和gD基因的熒光PCR方法，將有助于快速鑒別區(qū)分豬偽狂犬病野毒株和gE基因缺失株 (PRV疫苗株），有助于有效判斷豬是否感染野毒株的PRV，對(duì)該病的防控具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供用于鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因 的特異性引物對(duì)和探針；
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株和野毒株的熒光定量 PCR方法及其檢測(cè)試劑。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明對(duì)已知豬偽狂犬病病毒gD和gE基因特異基因的DNA 序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出豬偽狂犬病病毒gD和gE基因高度保守且具有型特異性基因序列， 設(shè)計(jì)檢測(cè)gD基因和gE基因的2對(duì)特異性引物對(duì)和2個(gè)TaqMan MGB探針，分別命名為 PRV-F (Pl)、PRV-R (P2)、PRV-F (P3)、PRV-R (P4)、PRV-MGB-FAM-探針（P5)、PRV-MGB-VIC-探 針（P6)，2對(duì)特異性引物對(duì)，2個(gè)TaqMan MGB探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5-6所 不O
[0008] 本發(fā)明提供上述2對(duì)特異性引物和2個(gè)TaqMan MGB探針結(jié)合使用，可用于二重?zé)?光定量PCR方法鑒別檢測(cè)豬偽狂犬病病毒疫苗株和野毒株。
[0009] 本發(fā)明提供一種鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株和野毒株的檢測(cè)試劑，含有2對(duì)特異 性引物對(duì)和2條熒光探針；2對(duì)特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1?4所示，2條 熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5?6所示。
[0010] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑還包括：DNA裂解液、熒光定量反應(yīng)液、陰性模板、陽(yáng)性模板，所 述陰性模板為雙蒸水，所述陽(yáng)性模板為豬偽狂犬病病毒基因組DNA。
[0011] 進(jìn)一步地，本發(fā)明檢測(cè)試劑其25 yL總工作體系為：
[0012] 試劑 體積pL 濃度 IOxExTaq 緩沖液 2.5 dNTP 2.0 2.5mM Ex Taq 酶 0.25 5U/liL gD基因上游引物 〇·5 0·4μΜ gD基因下游引物 〇.5 〇.4μΜ gE基因上游引物 〇·5 〇.4μΜ gE基因下游引物 Ο·5 〇·4μΜ 探針 Ρ5 0.8 0.6μΜ 探針 Ρ6 1.0 〇.7μΜ DNA模板 2.0 去核酸水 補(bǔ)足至25 。
[0013] 本發(fā)明檢測(cè)試劑的工作程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性15sec，60°C退火 30sec，40個(gè)循環(huán)。
[0014] 本發(fā)明還提供一種鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株和野毒株的檢測(cè)試劑。
[0015] 本發(fā)明提供上述2對(duì)特異性引物和2條熒光探針在制備鑒別豬偽狂犬病毒疫苗株 和野毒株檢測(cè)試劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 本發(fā)明提供了一種鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因的二重?zé)?光定量PCR方法，具體地，是應(yīng)用本發(fā)明的2對(duì)特異性引物和2條熒光探針，以PRV基因組 DNA為模板，通過(guò)熒光定量PCR方法和實(shí)現(xiàn)鑒別。
[0017] 上述方法每次檢測(cè)樣本時(shí)須設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，在檢測(cè)中兩種對(duì)照成立的 判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0018] 在"FAM/NONE"和"VIC/ΝΟΝΕ"雙標(biāo)記模式下，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)兩條特定的擴(kuò)增曲線 Ct值< 29. 0 ;陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)特定的擴(kuò)增曲線且Ct值> 32. 0或無(wú)。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照 結(jié)果不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
[0019] 樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0020] Ct值彡29. 0時(shí)樣品結(jié)果為陽(yáng)性；
[0021] Ct值彡32. 0的樣品結(jié)果為陰性；
[0022] Ct值在29. 0?32. 0之間時(shí)，且出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線的樣品需要重復(fù)，結(jié)果為陽(yáng)性者 判定為陽(yáng)性，結(jié)果為陰性者判定為陰性；若重復(fù)試驗(yàn)Ct值依然低于32判定為陽(yáng)性擴(kuò)增，超 過(guò)32判定為陰性擴(kuò)增。若樣品中檢測(cè)到PRV的gE和gD基因雙陽(yáng)性，判為野毒株。
[0023] 本發(fā)明提供了用于鑒別豬偽狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因的特異性 引物和探針，針對(duì)PRV gE基因缺失疫苗檢測(cè)出gD基因而檢測(cè)不出gE基因，建立了鑒別豬 偽狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因的二重?zé)晒舛縋CR方法，具有很高的檢測(cè) 靈敏度，檢測(cè)豬偽狂犬病病毒疫苗株gD和野毒株gE基因的最低檢測(cè)限為I. OX IO1拷貝/ UL ;該方法還具有100%的特異性，其重復(fù)性好，可作為檢測(cè)臨床標(biāo)本的手段，提高鑒別豬 偽狂犬病病毒疫苗毒和野毒株的陽(yáng)性率，操作簡(jiǎn)單，可在Ih?2h內(nèi)完成，大大縮短檢測(cè)周 期。本發(fā)明檢測(cè)試劑將有助于快速鑒別區(qū)分PRV野毒株和gE基因缺失株（豬偽狂犬病疫 苗株），有助于有效判斷豬是否感染野毒株的PRV，為豬偽狂犬病傳染源調(diào)查、傳播環(huán)境、病 原追溯提供了有效工具，對(duì)該病的防控具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為PRV gD/gE基因二重FQ-PCR擴(kuò)增曲線，其中，1為VIC探針（P6探針）gD基 因擴(kuò)增曲線，2為FAM探針（P5探針）gE基因擴(kuò)增曲線，3, 4為陰性對(duì)照。
[0025] 圖2為PRV gD/gE基因二重FQ-PCR檢測(cè)gD基因敏感性擴(kuò)增曲線；1?7為分別對(duì) 應(yīng)的質(zhì)粒濃度 I. OX 1〇6, I. OX 1〇5, I. OX 1〇4, I. OX 1〇3, I. OX 1〇2, I. OX 101，I. OX 10°拷貝 / UL ;8、9為陰性對(duì)照。
[0026] 圖3為PRV gD/gE基因二重FQ-PCR檢測(cè)gD基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0027] 圖4為PRV gD/gE基因二重FQ-PCR檢測(cè)gE基因敏感性擴(kuò)增曲線：1?6為分別對(duì) 應(yīng)的質(zhì)粒濃度 I. 0X105, I. 0X104, I. 0X103, I. 0X102, I. 0X101，I. 0X10〇c〇pies/yL，7、8 為陰性對(duì)照。
[0028] 圖5為PRV gD/gE基因二重FQ-PCR檢測(cè)gE基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029] 圖6為PRV gD/gE基因二重FQ-PCR體系單一檢測(cè)gD基因特異性擴(kuò)增曲線；I :gD 基因 VIC通道擴(kuò)增曲線；2 :gE基因 FAM通道擴(kuò)增曲線，3, 4 :陰性對(duì)