蘇氨酸脫氨酶、編碼基因、載體、工程菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蘇氨酸酶基因、載體，和產(chǎn)蘇氨酸脫氨酶基因工程菌及其構(gòu)建方法和 應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。 (二） 技術(shù)背景
[0002]蘇氨酸脫氨酶（Threoninedeaminase，簡稱TD，EC4. 3. 1. 19)，又稱蘇氨酸脫水 酶，是生物體內(nèi)氨基酸代謝的重要酶類，能夠催化L-蘇氨酸或L-絲氨酸脫氨生成α- 丁酮 酸或丙酮酸，尤其是在生物催化生產(chǎn)α-丁酮酸的工藝中具有關(guān)鍵的作用。α-丁酮酸是 一種是生產(chǎn)L-2-氨基丁酸、L-異亮氨酸、正丙醇、D-2-羥基丁酸以及食品配料的重要原材 料，尤其是L-2-氨基丁酸，作為抗癲癇藥物左乙拉西坦和抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇的重要 前體，受到廣泛的關(guān)注。
[0003] 目前已經(jīng)有一些蘇氨酸脫氨酶的報(bào)道，例如來自于施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeriSDM的蘇氨酸脫氨酶，其最高的底物濃度為30g/L。然而，這些蘇氨酸脫氨酶對高 底物濃度的耐受能力較弱，大大限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此篩選出新型的表達(dá)耐 高底物濃度的蘇氨酸脫氨酶基因，并通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)的基因工程菌在α- 丁 酮酸的制備中具有重要的意義。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種新的能夠催化L-蘇氨酸制備α- 丁酮酸的蘇氨酸脫氨 酶，而且該酶具有更高的催化活力和底物耐受能力，更適用于工業(yè)化制備該中間體，解決了 一般的蘇氨酸脫氨酶最適底物濃度低的問題；應(yīng)用該菌種生產(chǎn)蘇氨酸脫氨酶具有產(chǎn)量高、 工藝簡單、便于工業(yè)化應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，該菌株可以直接用于α- 丁酮酸的生產(chǎn)，而不需細(xì)胞破 碎。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種來源于大腸桿菌（Escherichia coli)的蘇氨酸脫水酶（記為 EcTD)，所述蘇氨酸脫水酶的氨基酸序列為SEQ IDN0:1所示。
[0007] 1 MADSQPLSGAPEGAEYLRAVLRAPVYEAAQVTPLQKMEKLSSRLDNVILVKREDRQPVHS
[0008] 61 FKLRGAYAMMAGLTEEQKAHGVITASAGNHAQGVAFSSARLGVKALIVMPTATADIKVDA
[0009] 121 VRGFGGEVLLHGANFDEAKAKAIELSQQQGFTWVPPFDHPMVIAGQGTLALELLQQDAHL
[0010] 181 DRVFVPVGGGGLAAGVAVLIKQLMPQIKVIAVEAEDSACLKAALDAGHPVDLPRVGLFAE
[0011] 241 GVAVKRI⑶ETFRLCQEYLDDIITVDSDAICAAMKDLFEDVRAVAEPSGALALAGMKKYI
[0012] 301 ALHNIRGERLAHILSGANVNFHGLRYVSERCELGEQREALLAVTIPEEKGSFLKFCQLLG
[0013] 361 GRSVTEFNYRFADAKNACIFVGVRLSRGLEERKEILQMLNDGGYSVVDLSDDEMAKLHVR
[0014] 421 YMVGGRPSHPLQERLYSFEFPESPGALLRFLNTLGTYWNISLFHYRSHGTDYGRVLAAFE
[0015] 481 LGDHEPDFETRLNELGYDCHDETNNPAFRFFLAG*
[0016] 任何對SEQIDNO:1所示氨基酸序列中氨基酸進(jìn)行缺失、插入或替換的處理獲得 的多肽片段或其變體，只要其與SEQIDNO:1所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017] 進(jìn)一步，為實(shí)現(xiàn)EcTD在大腸桿菌等原核生物中的可溶性異源表達(dá)，通過基因工程 常規(guī)操作，以全合成的方法獲得了對應(yīng)于所述SEQIDN0 :1氨基酸序列的該蘇氨酸脫氨酶 的核苷酸序列，如SEQIDN0:2所示。
[0018] 1 ATGGCGGACTCTCAGCCGCTGTCTGGCGCACCGGAAGGTGCTGAATACCTGCGTGCTGTA
[0019] 61 CTGCGTGCTCCGGTGTACGAAGCCGCCCAGGTGACGCCGCTGCAGAAGATGGAAAAACTG
[0020] 121 TCTTCCCGTCTGGATAATGTGATTCTGGTGAAACGTGAGGATCGTCAGCCGGTACACAGC
[0021] 181 TTCAAACTGCGTGGTGCCTACGCAATGATGGCTGGTCTGACCGAAGAACAGAAAGCACAC
[0022] 241 GGCGTTATTACGGCATCTGCTGGTAACCACGCACAGGGCGTAGCGTTCTCTTCCGCGCGT
[0023] 301 CTGGGCGTGAAAGCGCTGATCGTTATGCCAACCGCAACCGCCGACATCAAAGTAGATGCT
[0024] 361 GTGCGTGGCTTTGGCGGTGAAGTACTGCTGCATGGTGCAAACTTTGATGAGGCTAAAGCG
[0025] 421 AAGGCGATCGAACTGTCTCAGCAACAGGGCTTCACTTGGGTTCCTCCGTTCGATCACCCG
[0026] 481 ATGGTTATTGCCGGTCAGGGCACCCTGGCCCTGGAACTGCTGCAGCAAGATGCCCATCTG
[0027] 541 GACCGTGTCTTTGTACCGGTCGGCGGCGGTGGTCTGGCTGCAGGTGTAGCGGTTCTGATC
[0028] 601 AAACAGCTGATGCCGCAGATTAAAGTCATTGCGGTTGAAGCTGAAGATAGCGCGTGCCTG
[0029] 661 AAAGCAGCACTGGATGCGGGCCATCCGGTTGATCTGCCGCGTGTTGGTCTGTTTGCCGAA
[0030] 721 GGCGTTGCAGTTAAACGCATTGGTGATGAAACTTTTCGTCTGTGCCAGGAATACCTGGAC
[0031] 781 GACATCATCACTGTCGACTCCGATGCGATTTGTGCTGCTATGAAAGATCTGTTCGAAGAC
[0032] 841 GTGCGCGCTGTAGCTGAACCGTCTGGTGCTCTGGCTCTGGCAGGCATGAAGAAATATATC
[0033] 901 GCTCTGCATAACATCCGCGGTGAACGTCTGGCCCATATCCTGTCTGGCGCTAACGTGAAC
[0034] 961 TTCCACGGCCTGCGTTACGTGTCCGAACGTTGCGAACTGGGCGAACAGCGTGAAGCCCTG
[0035] 1021 CTGGCAGTTACTATCCCGGAGGAAAAGGGTTCCTTCCTGAAATTCTGCCAGCTGCTGGGT
[0036] 1081 GGCCGTAGCGTTACGGAATTCAATTACCGCTTCGCGGACGCTAAAAACGCGTGCATCTTC
[0037] 1141 GTGGGCGTACGTCTGTCTCGCGGTCTGGAGGAACGTAAGGAGATCCTGCAGATGCTGAAC
[0038] 1201 GATGGTGGCTATTCTGTAGTTGATCTGTCTGACGATGAAATGGCTAAACTGCACGTGCGT
[0039] 1261 TATATGGTCGGCGGTCGTCCATCCCATCCGCTGCAGGAACGTCTGTATTCCTTTGAATTC
[0040] 1321 CCTGAGTCTCCGGGTGCACTGCTGCGTTTCCTGAATACCCTGGGCACCTATTGGAACATC
[0041] 1381 TCTCTGTTCCACTACCGTAGCCACGGTACCGACTATGGTCGCGTACTGGCGGCATTCGAA
[0042] 1441 CTGGGTGATCACGAACCGGATTTCGAAACTCGCCTGAACGAACTGGGTTATGACTGTCAT
[0043] 1501 GATGAGACCAACAACCCGGCATTTCGCTTCTTCCTGGCGGGCTAA
[0044] 任何對SEQIDNO:2所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入 處理獲得的核苷酸序列，只要其與該核苷酸序列具有90%以上的同源性，均屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0045] 本發(fā)明提供一種由所述重組蘇氨酸脫氨酶編碼基因構(gòu)建的重組載體。
[0046] 本發(fā)明還提供一種由所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
[0047] 本發(fā)明涉及所述蘇氨酸脫水酶編碼基因在制備蘇氨酸脫水酶中的應(yīng)用，所述的應(yīng) 用為：構(gòu)建含有所述蘇氨酸脫氨酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，誘 導(dǎo)培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中分離得到含有重組蘇氨酸脫氨酶的菌體細(xì)胞。
[0048] 本發(fā)明將蘇氨酸脫氨酶基因EcTD同表達(dá)載體pET_28b(+)連接，構(gòu)建了含有 蘇氨酸脫氨酶基因的表達(dá)重組質(zhì)粒。將表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28b(+)-EcTD轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌BL21 (DE3)菌株中，獲得含有重組質(zhì)粒pET-28b(+)-EcTD的重組大腸桿菌BL21 (DE3) / pET-28b(+)-EcTD。以重組菌為酶源，進(jìn)行生物催化。具體地，將重組基因工程菌E.coli BL21 (DE3) /pET28b(+) -EcTD接種至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng) 10h，再以1. 5%接種量（v/v)接種至新鮮的含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)至菌體濃度0D600約0. 8左右，再向LB液體培養(yǎng)基中加入終濃度為0.ImM的IPTG， 28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)10h后，將培養(yǎng)液在4°C、lOOOOrpm離心lOmin，棄去上清液，收集濕菌體，即為 含有胞內(nèi)表達(dá)重組蘇氨酸脫氨酶的大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28b-EcTD濕菌體。
[0049] 本發(fā)明還涉及所述的蘇氨酸脫氨酶在生物催化L-蘇氨酸制備α-丁酮酸中的 應(yīng)用，具體地，所述的應(yīng)用為：以含蘇氨酸脫水酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體 為催化劑，以L-蘇氨酸為底物，以pH值4. 0-10.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在15~50 °C、 150-200rpm條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化得到α- 丁酮酸。
[0050] 反應(yīng)式如下：
[0051]
[0052] 進(jìn)一步，所述緩沖液優(yōu)選pH 7. 0的磷酸鈉緩沖液。
[0053] 進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為100~600g/L，優(yōu)選120~480g/L，最優(yōu) 選 240g/L。
[0054] 進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中生物催化劑的質(zhì)量用量以濕菌體的重量計(jì)為5~50g/L， 優(yōu)選5~30g/L，最優(yōu)選10g/L，所述濕菌體含水質(zhì)量為70~90 %。
[0055] 進(jìn)一步，所述反應(yīng)液分離純化的方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心去除大腸桿菌 細(xì)胞，上清液減壓蒸餾至1/2體積，除去反應(yīng)液中殘留的氨，80°C保溫40min，使蛋白質(zhì)變 性，離心去除變性蛋白；為了更好地去除培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)含物殘留的色素，加熱時(shí)可以在反 應(yīng)中加入少量的活性炭脫色，再用循環(huán)水式真空栗進(jìn)行抽濾，收集澄清的濾液；然后進(jìn)行旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水，得到α-丁酮酸。
[0056] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提