一種Na⁺/H⁺逆轉(zhuǎn)運蛋白基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥質(zhì)膜上的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因及其應(yīng)用。該Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因全長3460bp，該基因表達后定位在細胞質(zhì)膜上，發(fā)揮Na+/H+交換功能，將Na+排到胞外，因而還本發(fā)明還公開了利用所述Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化載體，以及提高植物耐鹽性的方法。
【專利說明】
一種NaVH+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種能將Na+排到胞外的NaVH+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2000年首次從擬南芥中克隆了切幻基因并被認(rèn)為是位于質(zhì)膜上的NaVH+逆轉(zhuǎn)運蛋白，在其N端是12個串膜結(jié)構(gòu)域，在C端有長的親水尾巴。亞細胞定位的結(jié)果表明該蛋白定位在細胞膜上，是目前植物中僅有的被鑒定位于質(zhì)膜上的負(fù)責(zé)Na+外流的蛋白。NaVH+逆轉(zhuǎn)運蛋白將H+轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)的同時將Na+運送到胞外。擬南芥中該基因的突變使得植物體對鹽非常敏感，且造成Na+外排和Na+從根部到莖葉長距離運輸?shù)娜毕?。通常情況下SOSl會通過C端的自我抑制結(jié)構(gòu)域和臨近的結(jié)構(gòu)域相互作用使SOSl處于休眠狀態(tài)，S0S2-S0S3激酶復(fù)合體將SOSl磷酸化從而激活SOSl，SOSl蛋白C端的[V，I]VR[V, IlDSPS基序中的兩個絲氨酸是發(fā)生磷酸化的位點。如果磷酸化位點或被S O S 2 - S O S 3復(fù)合體識別的位點發(fā)生突變都會抑制SOSl的活性。
[0003]在水稻中克隆了NaVH+逆轉(zhuǎn)運蛋白，與擬南芥中的*^幻基因同源，位于質(zhì)膜上具有NaVH+轉(zhuǎn)運的功能，轉(zhuǎn)化酵母后降低酵母中的Na+含量，擬南芥中的S0S2-S0S3復(fù)合體可以激活水稻OsSOSl ο 轉(zhuǎn)化擬南芥soW突變體后可以降低突變體對鹽的敏感性。以上結(jié)果表明SOS信號通路在谷類作物中存在并發(fā)揮作用，這說明SOS通路在單子葉和雙子葉植物中存在保守性。木本植物白楊中研究結(jié)果表明SOS信號通路的相關(guān)蛋白可以和擬南芥中的蛋白對應(yīng)，并互補擬南芥相應(yīng)突變體的表型。擬南芥、水稻和楊樹中的實驗充分證明了SOS通路在草本、木本植物中，單子葉和雙子葉植物中都存在，并且功能是保守的。小麥中?^幻基因的研究也取得了一些成果，最近用非損傷微測技術(shù)檢測小麥根Na+離子流時，在耐鹽品種Kharchia 65檢測到較強的Na+離子外流現(xiàn)象，證明該現(xiàn)象由質(zhì)膜H+-ATPase提供能量，由5??同源基因介導(dǎo)產(chǎn)生。
[0004]本發(fā)明對小麥T1aiStt?基因進行克隆和功能研究，發(fā)現(xiàn)可以互補鹽敏感酵母突變體;轉(zhuǎn)化擬南芥突變體后可以降低突變體對鹽的敏感性，過表達則提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性;小麥中5??基因的沉默也會導(dǎo)致小麥葉片Na+離子含量的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明人通過比對擬南芥和水稻的?基因序列，設(shè)計引物，在小麥品種科遺26中克隆了小麥的5??基因，Genebank登錄號為FN356229，并和擬南芥、水稻的切沿基因進行比對，發(fā)現(xiàn)和水稻、擬南芥中的SOSl蛋白也表現(xiàn)出序列高度相似性。經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥和酵母的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，小麥*^幻基因可以提高擬南芥和酵母的耐鹽性，小麥中*^幻基因的沉默也會導(dǎo)致小麥葉片Na+離子含量的提高。
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種質(zhì)膜NaVH+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因，該基因能將植物體內(nèi)的Na+離子排到胞外。
[0007]本發(fā)明所提供的基因來源于耐鹽小麥品種科遺26，是具有如SEQID N0.1所示核苷酸序列，或其簡并序列組成。SEQ ID N0.1所示的DNA長度為3460 bp(其中ORF區(qū)為3429)，是細胞核基因，位于小麥第三同源群A染色體上，命名為編碼1143個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。
[0008]本發(fā)明提供擴增上述基因全長的引物對，所述引物對中，正向引物的序列為SEQID N0.2所示，反向引物的序列為SEQ ID N0.3所示。
[0009]本發(fā)明提供包含所述基因的表達載體，所述基因可操作連接于35S啟動子。將所述的表達載體轉(zhuǎn)化到植物中，并篩出耐鹽性的植株。
[0010]本發(fā)明提供的小麥Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因利用基因工程技術(shù)將其遺傳轉(zhuǎn)化到雙子葉植物擬南芥中，過表達可以提高擬南芥的耐鹽性，同時可以互補擬南芥突變體。
[0011 ]本發(fā)明提供包含所述基因的酵母表達載體，所述基因可操作連接于表達載體的啟動子下游。
[0012]本發(fā)明提供的小麥Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因利用基因工程技術(shù)將其遺傳轉(zhuǎn)化到缺乏內(nèi)源Na+轉(zhuǎn)運體系的酵母中，并篩出可以互補缺乏內(nèi)源Na+轉(zhuǎn)運體系的酵母株系。
[0013]本發(fā)明提供包含所述基因的病毒載體，所述基因可操作連接于病毒載體的T7啟動子和復(fù)制原點下游。
[0014]本發(fā)明提供的小麥Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因利用基因工程技術(shù)將其遺傳轉(zhuǎn)化到單子葉禾本科植物小麥中，降低小麥內(nèi)源基因TaSOSl -AI的表達，增加小麥葉片Na+的積累。因此，利用7? ^能創(chuàng)制耐鹽性材料，這為小麥的耐鹽性研究提供了有價值的材料，對小麥的遺傳改良具有重要意義。
[0015]
【附圖說明】
[0016]圖1為基因的染色體定位。
[0017]圖2為雙子葉植物雙元表達載體的構(gòu)建流程。
[0018]圖3為擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的PCR和RT-PCR鑒定結(jié)果，其中，A為PCR鑒定結(jié)果，從左至右上樣順序為:野生型陰性對照、野生型轉(zhuǎn)基因株系Τ1-6、Τ1-9和Τ1-10、突變體陰性對照、突變體轉(zhuǎn)基因株系Tl-1、Τ1-2和Τ1-7; B為轉(zhuǎn)野生型RT-PCR鑒定結(jié)果，從左至右上樣順序為:陰性對照、野生型轉(zhuǎn)基因株系Τ1-6、Τ1-9和Τ1-10 ;C為轉(zhuǎn)突變體RT-PCR鑒定結(jié)果，從左至右上樣順序為:突變體陰性對照、突變體轉(zhuǎn)基因株系T1-UT1-2和T1-7。
[0019]圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥在MS和MS加NaCl培養(yǎng)基上生長實驗結(jié)果，為突變體，Tl-
1、Τ1-2和T1-7分別為轉(zhuǎn)突變體的轉(zhuǎn)基因株系，col為野生型，Τ1-6、Τ1-9和Τ1-10分別為轉(zhuǎn)野生型的轉(zhuǎn)基因株系。
[0020]圖5為轉(zhuǎn)基因酵母株系陽性克隆PCR鑒定，ΑΧΤ3-Α和ΑΝΤ3-Α分別代表^單獨轉(zhuǎn)化AXT3和ANT3突變體，CK為轉(zhuǎn)化空載體對照。
[0021]圖6為轉(zhuǎn)基因酵母在AP和AP加NaCl培養(yǎng)基上生長實驗結(jié)果，W303為野生型，AXT3和ANT3分別代表轉(zhuǎn)空載體的突變體，AXT3-A和ANT3-A分別代表單獨轉(zhuǎn)化AXT3和ANT3突變體。野生型、突變體和轉(zhuǎn)基因酵母在AP培養(yǎng)基上的生長，10倍梯度稀釋滴在AP或AP+30 mM NaCl的培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3天后拍照。
[0022]圖7為轉(zhuǎn)基因酵母細胞Na+、K+濃度和K+ /Na+比。
[0023]圖8為病毒誘導(dǎo)/??基因沉默表型，A為不含BSMV病毒緩沖液侵染小麥葉片的接種對照;B為/基因片段的BSMV病毒侵染小麥葉片表型。
[0024]圖9為病毒誘導(dǎo)TaSOSl 基因沉默定量PCR表達分析。
[0025]圖10為病毒誘導(dǎo)基因沉默的植株葉片的Na+、K+濃度。
【具體實施方式】
[0026]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027]
實施例1小麥質(zhì)膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因的獲得
1.小麥質(zhì)膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因的分離，具體包括如下步驟:
(I)將小麥科遺26( Tritium aestivum L.)的種子用10%的花王水溶液對種子進行表面消毒10分鐘，用滅菌蒸餾水洗滌3遍。將種子放入有兩層消毒濾紙的培養(yǎng)皿中，在室溫中放置2天后(90%種子萌發(fā))將培養(yǎng)皿放入4°C冰箱中處理24 h，使萌發(fā)的種子均一化。然后將培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)室(23°C，16 h光照/8 h黑暗)中生長2天，將生長一致的幼苗置入含1/2Hogland營養(yǎng)液的容器中進行水培，大約7天后取幼苗葉片洗凈吸干，用液氮速凍，保存于-80 0C冰箱用于總RNA的提取。
[0028](2)用Trizol法(Trizol購于天根公司)提取步驟(I)保存的小麥葉片的總RNA，經(jīng)DNA酶I處理后備用。
[0029 ] (3 )用隨機引物(TAKARA公司產(chǎn)品)和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司產(chǎn)品)將步驟(2 )的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系及參數(shù)為:總RNA 2 yg，隨機引物(10 μΜ)1.25 μ1，5ΧMMLV RT Buffer 5 yl，dNTP(各10 mM) 1.25 μ?,RNase Inhibitor (40 U/μΙ) I μ?，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μΙ) lyl，DEPC水補至25 μ?，瞬時離心，37°C 60 min，70°C 15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。程序結(jié)束后將cDNA立即置于冰上冷卻或存于-20°C備用。
[0030](4)根據(jù)J氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上對小麥的EST數(shù)據(jù)庫進行TBLASTN搜索，用電子克隆的方法預(yù)測了小麥的?基因，設(shè)計基因特異引物，引物序列為SEQ IDN0.2所示(正向引物)和SEQ ID N0.3所示(反向引物)，以上述步驟(3)所得cDNA為模板，用PCR方法擴增得到化如幻基因全長序列。PCR反應(yīng)體系為:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ I，DNA聚合酶buffer(10X，含 MgCl2)2 yl，dNTPs(2.5 mM)2 μ?，正向引物(10 μΜ)1 μ?，反向引物(10μΜ)1 ylExTaq聚合酶(Takara，5 υ/μ1)0.2 μ?，補滅菌超純水至20 μ?。擴增程序:94°C預(yù)變性5 min，[ 94°C 30 s，58.4°C 40 s，72°C 3 min 30 s] X 35個循環(huán)，72°C補平 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，克隆到T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，挑陽性克隆送到北京諾賽基因公司測序，得到如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。該序列長度為3429 bp,編碼1143個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。
[0031]
2.小麥質(zhì)膜NaVH+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因的染色體定位
(I)提取中國春的缺體四體植株的基因組DNA，方法如下:配制三種儲存液:1、提取緩沖液(500 ml):0.35 M sorbitol(31.9 g sorbitol), 0.1 M TrisHCl pH 8.0(50 ml IMTrisHCl pH 8.0),5 mM EDTA pH 8.0(5 ml 0.5 M EDTA pH 8.0)，滅菌超純水定容到500ml; Π、水解緩沖液(500 ml):0.2 M Tris HCl pH 8.0(100 ml IM Tri HCl pH 8.0),0.05M EDTA pH 8.0(50 ml 0.5 M EDTA pH 8.0),2 M NaCl(200 ml 5 M NaCl),2% CTABC10 gCTAB)，滅菌超純水定容到500 ml; ΙΠ、sarcosyl stock 5%(w/v)。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，配方如下(120 ml):將 0.6 g sodiumdi sulfite (sodium metabisulfite)和 2.4 g PVP-40 加入到50 ml提取緩沖液溶解中，然后再加50 ml水解緩沖液和20 ml sarcosyl stock。將葉片在磨樣機上研磨充分后，加I ml 65°C預(yù)熱工作液，繼續(xù)在65°C溫育I h，期間經(jīng)常顛轉(zhuǎn)晃動。在冰上冷卻5 min加I ml氯仿:異戊醇(24:1)，充分混勾30 mino40C, 10,000 g離心20min。轉(zhuǎn)移上層水相于一新的EP管中，加等體積冷異丙醇，上下顛倒混勻10 min，可見絮狀核酸。4。(3，10，000 g離心30 min。棄上清，沉淀用2 ml 70 % EtOH洗一遍，瞭干沉淀后加250 μ
1的 I X TE (10 mM TrisHCl pH 8.0, I mM EDTA pH 8.0)。0.8 %瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA質(zhì)量。
[0032](2)PCR擴增，以中國春缺體四體材料基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA(50 ng/pl)2 μ?，DNA聚合酶buffer( 10 X，含 MgCl2)2 yl，dNTPs(2.5 mM)
2μ?，正向弓丨物 5,AGTGCATCATTGCTGTCTTCAACC3,(10 μΜ)1 μ?，反向弓丨物5,AGTCGTCATCTTCTCCTACCGCC3 ^ (1 μΜ)1 μ?，ExTaq 聚合酶(Takara，5 υ/μ1)0.2 μ?，補滅菌超純水至20 μ?。擴增程序:94°C預(yù)變性5 min，[ 94°C 30 s,66.4°C 40 s，72°C 30 s] X30個循環(huán)，72°C補平10 min，然后瓊脂糖電泳檢測。電泳結(jié)果如圖1所示，TaSOSl^定位在小麥第三同源群的A組染色體上。
[0033]實施例2小麥質(zhì)膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因的功能
1.雙子葉植物雙元表達載體的構(gòu)建
將TaSOSl基因的上游弓丨物加上XbaI酶切位點5 二 GATCTAGAATGGAGACGGAGGAGGCCG-3入下游引物為5'- TCAGCTGCCTCGCGGTGG-3 O，以7?切幻全長T載體質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接于pGEM-T Vector后測序。將測序正確的質(zhì)粒TaSOSl-Al-T和雙元表達載體PCAMBIA1300-35S-⑶S(簡稱pl300-GUS)質(zhì)粒經(jīng)XbaI和SacI酶切后，回收相應(yīng)片段，連接轉(zhuǎn)化;菌落PCR鑒定為陽性克隆的提取質(zhì)粒，進一步作酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒pl300- TaSOSl-Al保存待用。雙子葉植物雙元表達載體構(gòu)建流程如圖2所示。
[0034]
2.雙子葉植物雙元表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 (I)農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
挑取根癌農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種于3 ml的新鮮YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；按1:10的比例接種于50 ml YEB(利福平Rif 60 mg/L)的培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，28°C繼續(xù)培養(yǎng)至0D6qq=0.4-0.6 ο將菌液置于冰上。5,000 rpm，4°C離心5 min，棄上清，將菌體懸于10ml 0.15 mol/L NaCl中。5,000 rpm，4°C離心5 min，棄上清。菌體用I ml 預(yù)冷的20 mmol /I,CaCl2(4°C)輕輕懸浮細胞，每管200 μ?，加入終濃度為20%的無菌甘油，液氮中速凍I分鐘，置-70 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0035](2)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
將10 μ?構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA(pl300- TaSOSl-Al)加入200 μ?農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，混勻；冰浴30 min，液氮迅速冷凍3-5 min，37°C水浴5 min;加入I ml YEB培養(yǎng)基，28°C，150rpm,4 h； 10,000 rpm,30 s，棄去部分上清，重新懸浮細胞，涂布于YEB(Kan 50 mg/L和Rif
60mg/L)培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)48 h。
[0036](3)重組農(nóng)桿菌鑒定
挑取轉(zhuǎn)化平板上長出的單菌落，接種于YEB(Kan 50mg/L和Rif 60mg/L)液體培養(yǎng)基中，28 °C振蕩培養(yǎng)過夜。取2 μ I過夜菌液作為模板進行PCR，上下游引物分別為5 '-GATCTAGAATGGAGACGGAGGAGGCCG-3、5TCAGCTGCCTCGCGGTGG-3')。
[0037]PCR反應(yīng)體系(20μ1)為:菌液2 μ?，DNA聚合酶buffer( 10 X，含 MgCl2)2 yl，dNTPs(2.5 mM)2 μ?，正向引物(10 μΜ)1 μ?，反向引物(10 μΜ)1 μ?，ExTaq 聚合酶(Takara，5 U/μ1)0.2 μ?，補滅菌超純水至20 μ?。擴增程序:94°C預(yù)變性5 min，[ 94°C 30 s，58.4°C 40s，72°C 3 min 30 s] X35個循環(huán)，72°C補平 10 min。
[0038]
3.擬南芥的轉(zhuǎn)化及篩選 (I)擬南芥植株的培養(yǎng)
首先取約100 μ?的擬南芥野生型和突變體種子分別置于2 ml的無菌離心管中，加入Iml無菌水，表面浸潤2 min，吸棄上清。加入I ml 70%乙醇，重懸種子，表面消毒I min，，小心吸棄乙醇，加入I ml無菌水，重懸種子，吸棄上清(水洗重復(fù)3次)。加入I ml 20%花王漂白水，重懸種子，深度消毒10 min, 10000 rpm離心I min，小心吸棄花王漂白水，用無菌水重懸種子，沖洗3次以上。用無菌水重懸種子，用移液器移至MS培養(yǎng)基上，均勻平鋪，4°C春化3 (1;移至培養(yǎng)室，23°(:，16 h/8 h(光/暗)條件培養(yǎng)。10天后，當(dāng)幼苗長出2-4片真葉時，移栽到盆中(蛭石:營養(yǎng)土 = 2:1)中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:22-23°C，16 h/8 h(光/暗)培養(yǎng)。擬南芥生長大約2周后進入花期，待其抽苔至10-15 cm，形成1-2個角果時，即可用于轉(zhuǎn)化，此時花蕾狀態(tài)最佳。轉(zhuǎn)化前將角果及已完全開放的花蕾剪去，僅留下剛剛露白及幼嫩的花蕾。
[0039](2)農(nóng)桿菌培養(yǎng)
接種單個菌落于5 ml YEBCKan 50 mg/L和Rif 60 mg/L)培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按1:1000接種到200 ml YEB的錐形瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)10-12 h，當(dāng)菌液生長至OD6qq值為0.8左右時，5000 rpm離心15 min收集菌體，用轉(zhuǎn)化介質(zhì)(1/2 X MS，5%鹿糖，0.01 mg /ml 6-BA，
0.03% Sillwet-77，Κ0Η調(diào)pH=5.7)重懸沉淀至OD6QQ達到0.8左右。
[0040](3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化
采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(Clough SJ, 1998):將含有農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)倒入200 ml燒杯中，將上述帶有花蕾的擬南芥倒置其上，使整個花序都進入轉(zhuǎn)化介質(zhì)，浸泡30 s后取出擬南芥，將葉、莖、花上多余的水珠抖落，側(cè)臥放在干凈的塑料盆中，并用薄膜覆蓋避光保濕培養(yǎng)24 h。揭開薄膜，將擬南芥置于光下，用水澆透后，正常培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后植株正常生長、開花、結(jié)果，2-3周后，待角果完全枯黃、欲開裂時，即可收獲種子。種子儲存在2 ml的離心管中，常溫短期保存，或于4 °C，-20 0C長期保存。
[0041](4)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株篩選
將轉(zhuǎn)化后的種子消毒后播種在含有Hyg 20 yg/ml的MS培養(yǎng)基上，4°C春化3天，然后正常光照培養(yǎng)。約10天后即可辨認(rèn)出轉(zhuǎn)入外源基因的擬南芥幼苗(Tl代)。由于雙元載體上具有Hyg抗性位點，所以抗性苗子葉為綠色，下胚軸較長，并長出4片真葉；而非轉(zhuǎn)化體沒有抗性，只有2片真葉。移栽出抗性植株，繼續(xù)培養(yǎng)，收取T2代種子。將T2代種子播種在含Hyg 20yg/ml的培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，根據(jù)其后代(T2代)的分離比，可以判定是否為純合體和外源基因插入的拷貝數(shù)。選取單基因插入的轉(zhuǎn)基因植株移栽，單株收取種子(Τ3代)，繼續(xù)在含Hyg20 yg/ml的培養(yǎng)基上篩選，后代不發(fā)生分離(全為綠苗)的即為純合體。
[0042](5)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
對上述篩選出的Tl代擬南芥陽性植株，按常規(guī)方法小量提取其基因組DNA，取I μι基因組DNA為模板，用引物對5'- GATCTAGAATGGAGACGGAGGAGGCCG-3'和 5'-TCAGCTGCCTCGCGGTGG-3 '，通過常規(guī)PCR擴增，分別以野生型和突變體擬南芥基因組DNA為對照，進一步檢測陽性植株。同時還對T3代轉(zhuǎn)基因植株小量提取RNA，進行RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因的表達情況，分別以野生型和突變體擬南芥RNA為對照。結(jié)果如圖3所示，絕大部分潮霉素抗性苗為轉(zhuǎn)基因陽性植株，且能正常表達7? 5??基因。
[0043](6)轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀測
將擬南芥野生型、突變體和轉(zhuǎn)基因純合株系分別播種于1/2 MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4天后，挑選生長一致的擬南芥一部分轉(zhuǎn)入含鹽(突變體50 mM NaCl，野生型150 mM NaCl)的1/2MS培養(yǎng)基中，一部分作為對照轉(zhuǎn)入不含鹽的1/2 MS培養(yǎng)基中，將平板豎直放置，注意觀察擬南芥幼苗根的生長，大約5天后進行觀察。結(jié)果如圖4所示，在不含鹽的1/2 MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型和突變體比較沒有差別，在150 mM NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根較野生型的長，在50 mM NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根較突變體的長。說明轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽性強，來自小麥的TaSOSl^基因能提高擬南芥植株的耐鹽性。
[0044]
4.互補酵母突變體表型
(I)酵母菌株
酵母(SaccharoinycGS cererisiae)互補實驗需要的突變株系包括AXT3(MATa,ade2~l,his3~ll, Ie u2~l 12, trpl -1，ura3~l, A enal::HI S3::ena4 ,nhal::LEU2, nhx:: TRPl, can I —川60，缺乏內(nèi)源的NHXl和質(zhì)膜上的Na+轉(zhuǎn)運體ENA1-4和NHA1;ANT3 iMAT a,ade2_l，his3_11, leu2~112, trpl -1, ura3~l, A enal::HIS3::ena4, nhal，缺乏質(zhì)膜上的Na+轉(zhuǎn)運體 ENA1-4 和 NHA1。對照株系 W303 ( MAT a, ade2~l ,his3~ll, leu2~112, trpl -1, ura3~l) 0
[0045](2)載體構(gòu)建
用含有外源片段的質(zhì)粒為模板，用含有酶切位點的引物進行PCR擴增，合成引物:5 '-GATCTAGAATGGAGACGGAGGAGGCCG-3 '(黑體為謂每切位點)，5 '-GAGGTACCTCAGCTGCCTCGCGGTGG-37黑體為酶切位點)，連T載體測序正確后提質(zhì)粒，將含有外源片段的質(zhì)粒和載體PYPGE15分別進行雙酶切酶切產(chǎn)物電泳，分別將目的條帶切膠回收，連PYPGE15載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，抗性篩選，提取質(zhì)粒用ZhI和進行酶切鑒定。
[0046](3)轉(zhuǎn)化酵母
將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化酵母菌株，轉(zhuǎn)化方法如下:取1.5 ml酵母過夜菌液，12,000 rpm離心10 S。棄上清，用Iml水洗，離心10 S。棄上清，將提前配置好的360 μ?轉(zhuǎn)化反應(yīng)液(PEG3350(50%) 240 μ?，I M LiAc 36 μ?，鮭精 DNA 11 μ?，構(gòu)建好質(zhì)粒載體30 μ?，ddH20至360 μ?)加到酵母沉淀中，混勻。42°C水浴I h，不要震動，離心10 S，棄上清，取100μ I菌液涂板(YNB不含尿嘧啶)。備注:YNB培養(yǎng)基配方，0.67%酵母氮堿基(不含氨基酸，Difco)，2%葡萄糖，3%瓊脂，pH6.2。根據(jù)培養(yǎng)菌株和pYPGE15載體的特性，培養(yǎng)基需補加腺嘌呤(0.05 8/1)，色氨酸(0.1 8/1)，組氨酸(0.05 8/1)，亮氨酸(0.1 g/L)，pYPGE15載體含有合成尿嘧啶的基因，無需另加。菌落PCR鑒定陽性克隆，如圖5所示。
[0047](4)酵母菌耐鹽性鑒定
酉孝母耐鹽性鑒定使用AP(Arginine Phosphate Medium)培養(yǎng)基，配方如下(I L):PO4H3 (85%)0.55 ml，MgSO4C 1M)2 ml,CaCl2 (0.1Μ)2 ml,OligoelementsC100 X)10 ml，加KCl至終濃度I mM，根據(jù)實驗需要加NaCl至合適濃度，用L-arginine調(diào)pH6.5，補加滅菌水至900 ml，如果是固體培養(yǎng)基需加20 g/L瓊脂。高壓滅菌，冷卻至50°C加100 ml 20%的葡萄糖(0.5 atm，110°C滅菌)和10 ml 100 X維生素儲液(過濾滅菌)。其中配制I L 100XOligoelements需要Boric acid(50 mg)，CuS04(4 mg)，IK(10 mg)，F(xiàn)eCl3(20 mg)，MnS04.H20(40 mg),Na2MoO4.2H20(20 mg),ZnSO4.7H20(4 mg)； 100 ml 100 X Vitamins 需要B1tinCI ml,0.2 mg/ml 乙酉享)，Nicotinic acid(4 mg)，Pyridoxine(4 mg),Thia mine(4mg),Panthotenic acid(4 mg)。
[0048]將鑒定正確的酵母菌株于AP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，將菌液濃度通過測OD值調(diào)一致，然后按1X倍數(shù)進行一系列梯度稀釋，用移液器分別吸取10 μ?于固體AP(30 mM NaCl)培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)3天后觀察，拍照，如圖6所示，在不含鹽的AP培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因酵母與野生型酵母W303和突變體AXT-3，ANT-3比較沒有差別，在30 mM NaCl的AP培養(yǎng)基中，突變體AXT-3，ANT-3酵母生長受到抑制，而轉(zhuǎn)基因的酵母能很好恢復(fù)突變體表型，在鹽板上的表型接近野生型。
[0049](5)酵母菌離子含量測定
將鑒定正確的酵母菌株于AP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后擴大培養(yǎng)到50 mL含10 mMNaCl的AP液體培養(yǎng)基中(28°C，200 rpm)，培養(yǎng)到OD?0.20后，用冷的緩沖液(10 mMMaCl2、10 mM CaCl2和I mM HEPES)洗兩遍，65°C干燥48小時，稱重，放入消解罐中，加入硝酸和雙氧水(7:1，優(yōu)級純)，總體積不小于消解罐體積的1/4，然后于消解爐中進行消解。消解完成后將消解液轉(zhuǎn)入容量瓶中，雙蒸水定容至25 ml，用ICP/MS (Thermo, San Jose, CA,USA)檢測Na+、K+離子含量。檢測結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)TaSOSl 的酵母株系體內(nèi)的Na+含量顯著低于突變體對照，約是對照的50%;相反K+含量與對照相比大約升高40%，轉(zhuǎn)^的酵母株系K+/Na+比約是對照的3倍，說明基因具有外排Na+的功能。
[0050]病毒介導(dǎo)基因沉默
(I)病毒載體的構(gòu)建
大麥條紋花葉病毒的基因組包含三條不同的單鏈RNA分子。將三條鏈的cDNA分別克隆到pBSMV載體上(具有Amp抗性)，即pBSMV-a、pBSMV-0、pBSMV- γ ;構(gòu)建好的帶有外源GFP片段的γ鏈(pBSMV- γ -GFP)，作為病毒侵染的對照并用來構(gòu)建載體;帶有外源H)S(八氫番茄紅素脫氫酶)片段的γ鏈(pBSMV-y-PDS)，侵染小麥若干天后葉片會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，可以為病毒侵染成功提供證據(jù)。該載體上具有T7啟動子和轉(zhuǎn)錄原點，可以通過T7 RNA聚合酶將線性化載體在體外轉(zhuǎn)錄，獲得病毒的RNA，將RNA轉(zhuǎn)錄本接種小麥葉片，病毒RNA在植物體內(nèi)包裝形成具有活性的基因組并在植物體內(nèi)傳播。在γ鏈上設(shè)置了一個油6 /位點，用于接收外源目標(biāo)片段(待沉默基因的片段)，外源片段可以隨著病毒自身基因組的復(fù)制而得到復(fù)制，目標(biāo)基因片段通過RNAi機制沉默植物內(nèi)源RNA的表達。
[0051 ]設(shè)計帶有油乂酶切位點的引物5 二GCTAGCTCCCTCGGCGACGGCGAC-3 75 'UTR)，5GCTAGCTCTCGAAGAGGAGGGCGGGG-3 ' PCR擴增相應(yīng)待沉默基因的片段，回收后連接到PromegaT-vector上，轉(zhuǎn)化，鑒定陽性克隆，然后測序。確定序列完全正確后，用MeI酶將目的片段從T-vector上切下，同時用油61酶將病毒載體pBSMV- γ -GFP中的GFP切下，分別回收目標(biāo)基因片段和載體pBSMV- γ，連接并轉(zhuǎn)化。用引物5 'CAACTGCCAATCGTGAGTAGG3 '鑒定反向插入的陽性克隆用于病毒體外轉(zhuǎn)錄，將連接正確的載體命名為pBSMV-γ-TaSOSl-Al。
[0052](2)病毒體外轉(zhuǎn)錄
先將環(huán)狀載體線性化，步驟如下:分別提取pBSMV-a、pBSMV-0、pBSMV- γ -TaSOSl-Al以及pBSMV- γ -PDS和pBSMV- γ -GFP的質(zhì)粒。每種質(zhì)?？傆? yg，分成三管，線性化條件如下，pBSMV-α 2 yg，10 X 緩沖液5 μ1，Μ/?/內(nèi)切酶2 μ1(20單位)，補ddH20至50 yl，37°C，6小時后檢測，確保酶切徹底。pBSMV- γ -TaSOSl-Al、pBSMV- γ -PDS和pBSMV- γ -GFP線性化體系同pBSMV-cupBSMV-β線性化體系用分e I內(nèi)切酶取代M/u /，其它與pBSMV-α線性化體系相同。將150 μ?的酶切產(chǎn)物中加入350 μ?的DEPC水，500 μ?的酚:氯仿(1:1)混勻，12，000 rpm，離心10 min。小心吸取上清450 μ?至一新的EP管中，加入45 μ? 3 M的NaAc(pH5.2)，I ml的無水乙醇，4 °C沉淀過夜。12，000 rpm，離心1 min，70%乙醇(DEPC水配制)洗滌一次，將DNA溶于20 μ I DEPC水中。
[0053](3)病毒RNA合成
用EPICENTRE公司的AmpliCAP-Max? T7 and T3 High Yield Message Maker Kits合成病毒RNA，按照說明書進行操作:1.5 yg線性化片段，2 μ I 1X Transcript1nBuffer,8 μI Cap/NTP PreMix,2 μI 100 mM DTT,2 μI AmpliCap-Max Τ7 EnzymeSolut1n，補水至20 yl，42°C反應(yīng)2.5 h，放入_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054](4)接種病毒
將合成好的α、β和含有目的片段的γ RNA各20 μ?混合，加入3倍體積(180 yDDEPC水稀釋，然后加入等體積(240 μ?)的2XGKP buffer(50 mM Glycine,30 mM K2HPO4(PH9.2) ,1%Bentonite, 1% Celite)，混合后可以用于接種。在小麥的二葉期，第二葉平展而第三葉還未長出時，帶無菌手套將8?10 μ?轉(zhuǎn)錄混合液抹到第二片葉上。接種溫度為18?20°C，接種完后，用DEPC水噴小麥葉片，蓋上保鮮膜，將小麥澆透，保濕24 h，然后正常培養(yǎng)。按上述相同方法，用稀釋的GKP緩沖液接種同樣數(shù)量的小麥幼苗作為模擬接種對照(mock controls)ο
[0055](4)Realtime QT-PCR分析基因表達當(dāng)用病毒侵染的對照出現(xiàn)癥狀時(約20天)，即BSMV = TaPDS重組病毒侵染的小麥第3、4片葉子出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，而接種對照沒有觀察到該現(xiàn)象，說明病毒侵染成功如圖8所示。分別提取對照和病毒侵染的小麥葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用熒光定量PCR的方法檢測^基因是否發(fā)生沉默。結(jié)果如圖9所示，在BSMV:TaS0Sl_Al病毒侵染的小麥中，成功將的表達水平下調(diào)60%。
[0056](5)離子濃度的測定
當(dāng)被病毒侵染的對照出現(xiàn)癥狀時(約20天)，加200 mM NaCl處理24小時，取葉片，烘干，消解后用ICP/MS (Thermo, San Jose, CA, USA)檢測Na+、K+離子含量。結(jié)果如圖10所示BSMV: TaSOSl-Al侵染的小麥葉片積累的Na+是BSMV: GFP接種對照的2倍多，K+含量沒有明顯變化。
【主權(quán)項】
1.一種植物Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白基因，其特征在于:所述基因是SEQID N0.1所示核苷酸序列，或其簡并序列組成。2.包含權(quán)利要求1所述基因的表達載體。3.如權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于，其是酵母表達載體。4.如權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于，其是病毒載體載體。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的表達載體，其特征在于:將權(quán)利要求1所述基因可操作連接于啟動子和轉(zhuǎn)錄原點。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達載體，其特征在于:將權(quán)利要求1所述基因可操作連接于35S啟動子。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因在植物中發(fā)揮NaVH+交換功能將Na+排到胞外的應(yīng)用，其特征在于:將權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)化到植物中，并能夠表達;或者將權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)化到酵母突變體中，并篩出互補酵母突變體的酵母菌株。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:進一步篩出提高葉片Na+含量的植株，或篩出耐鹽性植株。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物單子葉植物，優(yōu)選為小麥。10.擴增權(quán)利要求1所述的基因的引物對，其特征在于:正向引物的序列為SEQID N0.2所示，反向引物的序列為SEQ ID N0.3所示。
【文檔編號】C12N15/81GK106047886SQ201610285252
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】高振賢, 張愛民, 史占良, 陽文龍, 劉冬成, 郭進考
【申請人】石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院