一種結直腸癌檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種結直腸癌檢測試劑盒，尤其涉及一種以糞便 為檢測樣本的簡易的結直腸癌檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 目前在結直腸癌篩查上主要有兩種常用技術。
[0003] -種是大便隱血試驗。通常腸癌的發(fā)生演變在早期可以沒有任何征兆，癌細胞可 在大腸腸壁上生長數(shù)十年再轉(zhuǎn)移到其他部位，在沒有任何癥狀前，增生的組織可滲出少量 血液，血液進入大便被排出。而大便隱血試驗就是檢測大便中的血液成分（檢測對象是血 紅蛋白），若多次、持續(xù)的陽性反應提示消化道出血，應做進一步檢查以警惕腸道腫瘤的發(fā) 生。該法的優(yōu)點是結果顯示快、清晰，結果可以半定量。但其存在一系列缺點：首先，其特異 性差，受飲食影響大。含亞鐵離子的食物和藥物對結果有干擾，假陽性率30%。隱血檢查前， 指導患者應避免服用鐵劑、動物血、肝類、瘦肉以及大量綠葉蔬菜3天，如有牙齦出血，誤咽 下血性唾液，以防糞便隱血檢查呈假陽性；其次，其敏感度低，出血量>90μg/ml才能檢出； 再次，該方法學限制條件多：患者提前準備時間長，由于取材部位不同，反應時間不同，對顯 色的判斷不同，故在同一方法的試驗中，也可產(chǎn)生誤差，因此一般測試時候均要求患者采用 不同天的糞便樣品連續(xù)測定。
[0004] 另一種方法是腸鏡檢查。目前腸鏡檢查對于腸內(nèi)病變診斷而言，是最有效可靠的 診斷方法。絕大多數(shù)早期腸癌患者可由內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)并確診。它通過肛門插入可檢查到直 腸、乙狀結腸、降結腸、橫結腸、升結腸和盲腸以及與大腸相連的一小段小腸（回盲末端）。 通過鏡子不但可以清楚地發(fā)現(xiàn)腸道病變，還可對部分腸道病變進行治療，如：大腸息肉等良 性病變鏡下直接摘除，對腸道出血進行鏡下止血，對大腸內(nèi)異物進行清除。腸鏡檢查技術是 目前其它診療手段無法替代的主要手段。目前腸鏡檢查對于腸內(nèi)病變診斷而言，是最有效 可靠的診斷方法。然而，其也存在一系列的缺點：首先，其需要檢查前準備，作腸鏡需要在檢 查前3天開始進食流質(zhì)或少渣半流質(zhì)飲食，檢查當天上午空腹，檢查前一天開始服用甘露 醇等導瀉劑清潔腸道，服用的液體量通常高達2L，清潔灌腸以保證腸道的清潔度，之后不能 再進食。檢查時醫(yī)生會通過腸鏡向腸腔內(nèi)注入一定量氣體使腸道膨大便于觀察。由于結腸 結構迂回曲折，檢查過程中被檢查者會有不同程度的脹痛或牽拉感覺。對于過分緊張或高 度腸痙攣的受檢者，則需要使用鎮(zhèn)靜劑或解痙藥物。對于不能配合的小兒，則需要在麻醉下 進行。其次，其對醫(yī)生的操作熟練水平有很高的要求，初學者容易在腸鏡下遺漏病變部位造 成漏診。由于檢查過程中需要注入氣體，會使腸內(nèi)壓力增大，易引起穿孔。再次，病人在檢 查過程中費力，費時，有一定的痛苦。并且檢查費用高，較難大規(guī)模推廣。
[0005] 除了上述兩種方法之外，分子診斷方法是近年來發(fā)展迅速的癌癥診斷方法。目前 已報道的（伍勇等）結直腸癌分子診斷法中，有采用糞便DNA檢測并結合F0BT聯(lián)合診斷的 方法，該方法需要首先對糞便中的DNA進行提取，再檢測標記物APC、K-ras、p53。
[0006] 糞便是人或動物的食物殘渣排泄物。糞便的四分之一是水分，其余大多是蛋白質(zhì)、 無機物、脂肪、未消化的食物纖維、脫了水的消化液殘余、以及從腸道脫落的細胞和死掉的 細菌，還有維生素K、維生素B、糞膽色素和尿膽素。正常情況下人的消化道上皮也會脫落一 些細胞，這些正常方式脫落的細胞進行程序性壞死，使其細胞中含有的核酸自然降解掉，所 以在正常人的糞便中基本檢測不到人的核酸。但是當消化道出現(xiàn)病變，或者發(fā)生癌變時，消 化道內(nèi)會有大量的體細胞或者癌細胞，非正常脫落。這些細胞不會啟動程序性壞死程序，其 細胞內(nèi)的核酸不會自發(fā)的降解掉。這些脫落的細胞隨著腸道內(nèi)容物向下游運動，并在腸道 菌群的作用下細胞被破壞，其中的核酸釋放出來被降解成短的片段DNA。這些短片段的人 的DNA和腸道內(nèi)的數(shù)以億計的細菌以及食物殘渣和代謝產(chǎn)物混合在一起形成糞便被排除 體外。消化道的病變越嚴重或者是消化道腫物體積越大和腫瘤性質(zhì)越惡變，腸道內(nèi)混入的 人的核酸就越多。
[0007] 李建生等研究了定量檢測糞便中長DNA片段在大腸癌診斷中的意義，其公開了通 過熒光定量AluPCR檢測糞便中長DNA片段，可以作為一種潛在的大腸癌篩查方法。典型 的人基因組Alu序列長282bp，由兩個同源但有差別的亞基構成。限制性剪切酶AluI可將 其剪切成130bp和170bp兩段，因此將其定名為Alu序列，平均每5kbDNA就有一個Alu序 列。Alu序列一般散在分布，少數(shù)呈簇狀分布。在細胞遺傳學水平上觀察，Alu重復序列集 中在基因轉(zhuǎn)錄最活躍的染色體區(qū)段內(nèi)。在所有已知的基因內(nèi)含子中，幾乎都發(fā)現(xiàn)了Alu序 列。由于Alu序列的特殊性，使用特異的引物對該序列擴增可以將人類的基因組DNA與非 人類基因組DNA區(qū)分開來。李建生等公開的該方法首先提取糞便中的DNA，再對其中的Alu 進行檢測，其診斷大腸癌總的敏感性為46. 67 %。
[0008] 但由于糞便成份復雜，因此無法直接用PCR進行擴增。若要檢測糞便中人的核酸 通常的辦法是采用核酸抽提的方法，先使用機械力使糞便充分的混勻和碎裂，然后使用有 機溶劑或者是磁珠捕獲的方式將全部的或者是需要的核酸富集起來，之后再經(jīng)過純化，然 后才能進行PCR擴增實驗，步驟繁瑣、費時。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的在于提供一種使用方便、前處理簡單的結直腸癌檢測試劑。
[0010] 本發(fā)明所提供的結直腸癌診斷試劑可以簡便地以糞便作為檢測樣本，對結直腸癌 進行診斷。
[0011] 發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的：
[0012] 首先，發(fā)明提供了一種結直腸癌檢測試劑盒，其含有Alu(Arthrobacterluteus) 檢測試劑和PvPP。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術最顯著的區(qū)別在于提供一種操作方式極其簡單的檢測試劑。其 不需要經(jīng)過任何細胞破碎或DNA提取過程。這在此前的結直腸癌分子診斷中都是從未出現(xiàn) 過的。
[0014] 首先，發(fā)明找到了一種合適的樣本，其為糞便樣本，這種無創(chuàng)式的取樣方式所獲得 的樣本可以通過本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)的簡便方法得以檢測出腸癌標記物。
[0015]目前，幾乎所有的分子標記檢測方法都離不開DNA的提取，而這些方法幾乎都需 要使用酶類和有機溶劑，常用的DNA提取方法例如：
[0016] 一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為 100-150kb；
[0017] 二、異丙醇沉淀法：用二倍容積異丙醇替代乙醇，沉淀DNA，同時可去除小分子 RNA(在異丙醇中可溶狀態(tài)）；
[0018] 三、表面活性劑快速制備法：用TritonX-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然后 用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析；等等。
[0019] 而在以糞便為檢測樣本的分子檢測方法中，由于糞便中的基質(zhì)成分非常復雜，DNA 的提取更是其中必不可少的一步，并且其提取過程十分繁雜，如上述李建生等所采用的方 法，就多達20步，其需要使用多種試劑，不可或缺的例如蛋白酶K、乙醇。
[0020] 而本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種可以無需進行糞便DNA提取，而是將未經(jīng)DNA抽提的糞 便或糞便混懸上清液進行簡單前處理再直接進行PCR擴增來實現(xiàn)結直腸癌標記物的糞便 檢測的方法。因此本發(fā)明所提供的檢測試劑盒不含酶類、有機溶劑等DNA提取試劑。這使 得其在便于操作的同時也成為一種環(huán)境友好的試劑盒。
[0021] 該技術的成功實施一方面離不開合適的結直腸癌標記物的篩選。同時，合適的前 處理方式（添加PvPP)才能進一步促進Alu的順利擴增。
[0022] 在眾多的結直腸癌標記物中，發(fā)明人成功地篩選出Alu這種標記物，其可以在合 適的條件下，無需進行糞便總DNA提取而直接以PvPP前處理的方式進行PCR擴增及檢測。
[0023] 因此，發(fā)明人首次提供了一種以糞便為檢測樣本，可直接進行PCR擴增的結直腸 癌檢測試劑盒，其含有Alu檢測試劑，同時特別優(yōu)選地，需要同時