突變型藍(lán)綠藻及提升藍(lán)綠藻的光合生長及生質(zhì)生產(chǎn)的方法
【專利說明】
[OOCM] 相關(guān)申請案
[0002] 依據(jù)35U.S.C. § 119,本申請案享有美國臨時申請案的優(yōu)先權(quán)（申請日：2014年8 月7號；【申請?zhí)枴?2/034, 337)，其中所有內(nèi)容皆引入本文W參酌。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明關(guān)于一種突變型藍(lán)綠藻W及藉由使用該藍(lán)綠藻提升藍(lán)綠藻的光合生長及/ 或生質(zhì)生產(chǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 光系統(tǒng)II(PhotosystemII，PSII)為一種在植物與藍(lán)綠藻的類囊體膜內(nèi)的大的膜 蛋白復(fù)合物[1-4]。其利用光能量在腔側(cè)上氧化水W及在該類囊體膜的基質(zhì)側(cè)上減少色素 體釀（plastoquinone，P曲[1-4]。然而，在光過量的情況下，光系統(tǒng)II(PSII)為光合裝置 的光誘導(dǎo)損傷的主要目標(biāo)[5,6]。為了避免運(yùn)個問題，光合生物體已發(fā)展出數(shù)種不同且復(fù) 雜的光保護(hù)機(jī)制W確定其在光過量的情況下可W生存[5, 6]。在高等的植物中，過量的光 能量在PSII光捕捉天線（li曲t-harvestingantenna,LHCII)中被消耗為熱，而減少達(dá)到 反應(yīng)中屯、的激發(fā)能量的量且保護(hù)PSII免于光損害。運(yùn)個過程（也稱為非光化學(xué)巧光澤焰 (no噸hotochemicalfluorescencequenching,NP曲）設(shè)及葉黃素循環(huán)的活化W及LHCII 的構(gòu)型改變，其透過在PSII的腔內(nèi)Δ抑的形成來控制拉6]。相較之下，藍(lán)綠藻使用藻膽 體作為天線W捕捉太陽光。許多藍(lán)綠藻發(fā)展出一種獨(dú)特的藍(lán)綠光誘導(dǎo)的NPQ機(jī)制W應(yīng)對 高光逆境巧-10]。當(dāng)暴露在高強(qiáng)度的白光或藍(lán)光下，可溶性澄色類胡蘿l·素蛋白（orange carotenoidprotein, 0CP)將會歷經(jīng)光轉(zhuǎn)換成活化的紅色形式。該紅色形式的0CP可與藻 膽體的別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC)核屯、交互作用且誘發(fā)在該藻膽體上消耗過多 激發(fā)能量為熱的NPQ效應(yīng)，從而保護(hù)PSII反應(yīng)中屯、對抗光損傷（7-17)。在運(yùn)個過程中，0CP 作為光傳感器、訊號傳播子W及能量澤焰劑。當(dāng)藍(lán)光或白光的強(qiáng)度降低，在紅色形式的0CP 與該藻膽體的APC核屯、之間的連結(jié)在巧光恢復(fù)蛋白（fluorescencerecoveryprotein， FR巧的幫助下被釋放。FRP與該紅色形式的OCP的C端區(qū)域交互作用且加速其轉(zhuǎn)換成澄色 形式且自該藻膽體分離W停止該NPQ過程（14)。與在高等植物W及藻類中的光保護(hù)機(jī)制相 反，到目前為止并無證據(jù)顯示在藍(lán)綠藻中的0CP調(diào)節(jié)的光保護(hù)機(jī)制中有PSII的回饋調(diào)節(jié)。
[0005] 從來自細(xì)長嗜熱性聚球藻（Thermosynechococcuselonga1:us)運(yùn)種藍(lán)綠藻的 PSII的2.9 A分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)模型顯示一種新發(fā)現(xiàn)的PQ分子（QC)及其擴(kuò)散渠道 [3, 18]。頭部基團(tuán)的QC分子位于一個由脂類的尾部、地及一個Car分子包圍的非常疏水的 空腔中；QC分子的尾部座落在一疏水性通道中，由細(xì)胞色素（巧tochrome，切t)b559aW及 0次單位（分別由PS祀化及psbF基因編碼）的跨膜螺旋化及PsbJ所圍繞，PsbJ朝向類 囊體膜的內(nèi)部空間開放巧，1引。提出由PQ(或P卵2)占領(lǐng)運(yùn)個QC位置是為了從池中的地 位置上交換PQ/P卵2 [3, 1引或為了調(diào)節(jié)氧化還原電位與細(xì)胞色素b559的反應(yīng)巧，18-20,不 同的看法亦參閱參考文獻(xiàn)21]。此外，該QC位置還被提議作為細(xì)胞色素b559的P卵2氧化 酶活性的催化位置巧2-29]。然而，在來自火神嗜熱性聚球藻化vulcanus)的PSII的近期 1.身A分辨率晶體結(jié)構(gòu)模型中則未觀察到占領(lǐng)該QC位置巧]。QC的功能仍然未定。
[0006]PCT專利申請案W0 2012/092033描述了通過中斷至少一種類胡蘿h素的生產(chǎn) 及/或減少至少一種類胡蘿l·素結(jié)合蛋白的表現(xiàn)來中斷NPQ過程，W在光合微生物中增強(qiáng) 生質(zhì)生產(chǎn)，并推測還原NPQ可造成有較高光子的比例為產(chǎn)生生質(zhì)的光化學(xué)與生化途徑提 供能量。然而，已有報告顯示，藍(lán)綠藻的光活性澄色類胡蘿l·素蛋白除了具有能量澤焰功 能外，在類囊體膜中的單線氧澤焰劑中具有新的功能（Sedoud等人，植物細(xì)胞期刊（2014 年）26, 1781-1791)。因此，通過于藍(lán)綠藻內(nèi)中斷至少一種類胡蘿h素的生產(chǎn)及/或減少 至少一種類胡蘿l·素結(jié)合蛋白的表現(xiàn)來中斷NPQ過程可能導(dǎo)致易感光抑制，運(yùn)是光合能力 中的光誘導(dǎo)的降低，歸因于澄色類胡蘿l·素蛋白的雙光保護(hù)功能的中斷（植物細(xì)胞期刊 (2006 年））。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在本發(fā)明中，意外地發(fā)現(xiàn)，一些新穎構(gòu)筑的突變型藍(lán)綠藻細(xì)胞，其在細(xì)胞 色素b559α或β次單位或PsbJ上具有點(diǎn)突變，在中度藍(lán)光條件下顯示狀態(tài)轉(zhuǎn) 換（statetransition)的提升作用W及在強(qiáng)度藍(lán)光條件下顯示非光化學(xué)巧光澤焰 (nonphotochemicalfluorescencequenching,NP曲的減弱作用，而不影響澄色類胡蘿h 素蛋白（0CP)的表現(xiàn)。其進(jìn)一步顯現(xiàn)出，與野生型細(xì)胞在正常生長條件下比較，一些該突變 型藍(lán)綠藻表現(xiàn)出提升的光合生長與生質(zhì)生產(chǎn)，其因此可能在用于各種應(yīng)用的生質(zhì)生產(chǎn)上具 有價值，例如生質(zhì)能源應(yīng)用W及生物燃料、糧食、飼料W及其他有價值的商業(yè)產(chǎn)品的商業(yè)生 產(chǎn)。
[0008] -般而言，本發(fā)明提供了在細(xì)胞色素b559a或β次單位或PsbJ上具有突變的突 變型藍(lán)綠藻細(xì)胞，特別是在PSII中該建議的化轉(zhuǎn)移通道的開口附近，其相較于野生型細(xì)胞 時，表現(xiàn)出提升的光合生長與生質(zhì)生產(chǎn)。
[0009] 具體而言，于一方面，本發(fā)明提供一種突變型藍(lán)綠藻，其表現(xiàn)突變型細(xì)胞色素多勝 膚，該突變型細(xì)胞色素多勝膚包含選自由下列所組成的群組的突變：
[0010] (a)在對應(yīng)于具有SEQIDNO: 1的細(xì)胞色素b559α多勝膚中的位置23W丙胺酸 (alanine,Α)予W胺基酸取代；
[0011] 化）在對應(yīng)于具有SEQIDN0:2的細(xì)胞色素b5590多勝膚中的位置28W丙胺 酸（A)或鄉(xiāng)胺酸（valine,V)予W胺基酸取代，或在對應(yīng)于具有SEQIDN0:2的細(xì)胞色素 b559 0多勝膚中的位置32W苯丙胺酸（地en^alanine，巧予W胺基酸取代；W及
[0012] (C)在對應(yīng)于具有SEQIDNO: 3的細(xì)胞色素PsbJ多勝膚中的位置16W苯丙胺酸 (巧或精胺酸（arginine,時予W胺基酸取代，或在對應(yīng)于具有SEQIDN0:3的細(xì)胞色素 PsbJ多勝膚中的位置20W苯丙胺酸（巧予W胺基酸取代。
[0013] 特定而言，本發(fā)明的突變型藍(lán)綠藻，與不具有任何該突變的野生型藍(lán)綠藻在相同 條件下相比時，顯現(xiàn)出一或多種有益的特征，包括（1)抑制的非光化學(xué)巧光澤焰（NP曲，（2) 加速的非光化學(xué)巧光澤焰（NP曲的黑暗恢復(fù)，（3)正常量的澄色類胡蘿h素蛋白（0CP)，及 /或（4)提升的光合生長率及/或生質(zhì)生產(chǎn)。
[0014]于某些具體實施例中，該突變選自由S23Aa、S28A0、S28Ve、V32F0、A16FJ、 A16RJW及A20FJ所組成之群組。
[0015] 于某些具體實施例中，該突變型藍(lán)綠藻包含編碼SEQIDN0:4的突變型細(xì)胞色素 b559a多勝膚的基因（PS祀）。
[0016] 于某些具體實施例中，該突變型藍(lán)綠藻包含編碼SEQIDNO:5、6或7的突變型細(xì) 胞色素b559 0多勝膚的基因（psb巧。
[0017] 于某些具體實施例中，該突變型藍(lán)綠藻包含編碼SEQIDNO:8、9或10的突變型細(xì) 胞色素PsbJ多勝膚的基因（PsbJ)。
[0018] 于某些具體實施例中，該突變型藍(lán)綠藻可自一屬的種中被制造，包括但不限 于麗絲藻屬（Agmenellum)、項圈藻屬（An油aenopsis)、魚腥藻屬（An油aena)、組囊 藻屬（Anacystis)、節(jié)螺藻屬（Art虹ospira)、束絲藻屬（Aphanizomenon)、星厘藻屬 (Asterocapsa)、博氏藻屬度orzia)、眉藻屬（Calot虹ix)、管抱藻屬（Qiamaesiphon)、 擬綠膠藍(lán)藻屬（化lorogloeopsis)、色球藻屬（化roococcus)、擬甲色球藻屬 (Qiroococcidiopsis)、發(fā)毛針藻屬（Crinalium)、色球藻目之一屬（切anobacterium)、鱷 藻屬（Crocos地aera)、色球藻目之一屬（切anobium)、寬球藻目之一屬（切anocystis)、藍(lán) 螺藻屬（切anospira)、藍(lán)桿藻屬（切anothece)、柱抱藻屬（切l(wèi)in化ospermopsis)、筒抱藻 屬（切l(wèi)in化ospermum)、藍(lán)纖維藻屬值actylococcopsis)、包皮藻屬（Dermoca巧ella)、 飛氏藻屬（Fischerella)、夫列藻屬（Rremyella)、真枝藻目之一屬（Geitleria)、無類 囊體藍(lán)藻屬（Gloeobacter)、顫藻目之一屬（Geitlerinema)、粘球藻屬（Gloeocapsa)、 粘桿藻屬（Gloeothece)、光環(huán)螺旋藻屬化alospirulina)、真枝藻屬（lyengariella)、 瘦銷絲藻屬化巧tolyngbya)、銷絲藻屬化yngbya)、湖生藍(lán)絲藻屬化i皿ot虹ix)、微銷 藻屬（Microcoleus)、粘囊藻屬（Myxosarcina)、微胞藻屬（Micro巧stis)、節(jié)球藻屬 (Nodularia)、念珠藻屬（Nostoc)、擬珠藻屬（Nostochopsis)、顫藻屬（Oscillatoria)、 席藻屬（Phormidium)、厚皮藻屬（Pleurocapsa)、浮游藍(lán)絲藻屬（Planktot虹ix)、綠球藻 屬（Prochlorococ州S)、原綠藻屬（Prochloron)、原綠發(fā)藻屬（Prochlorot虹ix)、假魚 腥藻屬（Pseudan油aena)、膠須藻屬（^Rivularia)、裂須藻屬（Schizot虹ix)、螺旋藻屬 (Spirulina)、雙岐藻屬（S巧tonema)、直毛藻屬（Stanieria)、顫藻目之一屬（Starria)、 束藻屬（Symploca)、真枝藻屬（Stigonema)、聚球藻屬（Synechococcus)、集胞藻屬 (Synecho巧stis)、嗜熱性聚球藻屬（Thermosynechococ州S)、束毛藻屬（Trichodesmium)、 單岐藻屬（Tolypot虹ix)、常絲藻屬（Tychonema)，W及異球藻屬狂enococcus)。
[0019] 于某些具體實施例中，該突變型藍(lán)綠藻為選自由集胞藻屬（Synechocystis)、 聚球藻屬（Synechococ州S)、節(jié)螺藻屬（Art虹ospira)、念珠藻屬（Nostoc)、魚腥藻屬 (An油aena)、嗜熱性聚球藻屬（Thermosynechococcus)W及藍(lán)桿藻屬（切anothece)所組成 的群組的屬。
[0020] 于另一方面，本發(fā)明提供一種生質(zhì)或生物分子的生產(chǎn)方法，包含在光照條件下在 適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如本文所描述的突變型藍(lán)綠藻，W及自該培養(yǎng)中收獲生質(zhì)或生物分 子。
[0021] 于某些具體實施例中，該生物分子選自由碳水化合物、脂肪酸、蛋白質(zhì)、胺基酸、勝 膚、色素、祗類、類胡蘿l·素、維生素，或其他高價值生物分子所組成之群組。
[0022] 本發(fā)明之一或多個具體實施例的細(xì)節(jié)闡述于下列說明中。本發(fā)明之其他特征或優(yōu) 點(diǎn)將會自w下數(shù)個具體實施例的詳細(xì)描述中w及自所附之申請專利范圍中變得明顯。
【附圖說明】
[0023] 前面的摘要，W及W下本發(fā)明之詳細(xì)描述，當(dāng)結(jié)合所附之圖式一起閱讀時，將會更 好理解。為了說明本發(fā)明之目的，顯示于圖式的具體實施例系為目前較佳者。然而，應(yīng)當(dāng)理 解的是，本發(fā)明不限于所示之精確的安排及手段。
[0024] 在圖式中：
[0025] 圖1中顯示藉由葉綠素a巧光測量得到反應(yīng)飽和閃光的來自Qa電子轉(zhuǎn)移至Qe與 Qb的動力學(xué)，對于（A)野生型（黑色線）、A16FJ(藍(lán)色線），W及V32F0突變細(xì)胞（綠色 線）；度）野生型（黑色線）、S23Aα(藍(lán)色線），W及S28Aβ細(xì)胞色素bs59突變細(xì)胞（紅色 線）。條件：20μg的葉綠素在2mL的BG-11培養(yǎng)基中。樣品在黑暗下靜置1分鐘。正規(guī)化 化與Fm的程度。
[0026] 圖2A-圖沈中顯示在紅色光化的光線存在與缺乏下，時間依賴型的閃光誘導(dǎo)的 (A)野生型、度)A16FJ、（C)V32F0、（D)S23AaW及巧)S28A0突變細(xì)胞的巧光產(chǎn)量。紅色 光化的光線的強(qiáng)度為約80-90μEm2s1。
[0027] 圖3A-圖3J中顯示在藍(lán)色光化的光線存在與缺乏下，時間依賴型的閃光誘導(dǎo)的野 生型（A，巧、A16FJ度，G)、V32F0 (C，H)、S23Aa值，I)W及S28A0突變細(xì)胞化J)的巧光產(chǎn) 量。藍(lán)色光化的光線的強(qiáng)度為（A)至似~65μΕm2s及（F)至（J)~400μΕm2s1。 其他條件與圖2中的相同。
[0028] 圖4中顯示為野生型與突變類囊體膜的0CP含量的西方墨點(diǎn)分析。
[002引 圖5A-圖抓中顯示在強(qiáng)藍(lán)光化的光線存在與缺乏下，DCMU、DBMIBW及紅光對時 間依賴型的閃光誘導(dǎo)的野生型細(xì)胞的巧光產(chǎn)量的影響。（A)添加lOmMDCMU，度）添加lOmM DBMIB，（C)無添加，（D)加上紅色光化的光線。藍(lán)色光化的光線的強(qiáng)度為~250μΕm2si。 (D)組中紅色光化的光線的強(qiáng)度為~50-60μΕm2s1。其他條件與圖2A-圖沈中的相同。
[0030] 圖6顯示野生型與突變細(xì)胞在30°C在周圍空氣中W及來自巧光燈30μmolμE m2s1的環(huán)境下光合生長曲線。誤差線表示二生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)誤差線不能被看 到時，誤差為比符號的尺寸小。
[0031]圖7中顯示集胞藻屬（Synecho巧stis)PCC6803、藍(lán)桿藻屬（切anothece)PCC7822、 魚腥藻屬（An油aena)ATCC29413，W及純頂節(jié)藻屬（Art虹opiraplatensis)的（a)細(xì)胞色 素b559a多勝膚，（b)細(xì)胞色素b559 0多勝膚，W及（C)細(xì)胞色素PsbJ多勝膚的胺基酸 序列的比對。
【具體實施方