一株可以高效分泌納豆激酶的地衣芽胞桿菌工程菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一株可以高效分泌納豆激酶的地衣芽胞桿菌工程菌，屬于酶工程和微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]納豆激酶是由枯草納豆芽胞桿菌分泌的一種單鏈絲氨酸蛋白酶，該酶具有良好的溶栓活性，Asp32, His64, Ser221組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)構(gòu)成其活性中心，相比于尿激酶，t-PA及鏈激酶等纖溶酶，納豆激酶其良好的溶栓效果及生物安全性，使之成為未來可用于治療心血管疾病的特效藥。同時作為一種功能性保健食品，納豆激酶食品也越來越受到消費者的青睞。
[0003]目前報道的用于生產(chǎn)納豆激酶的芽胞桿菌主要有枯草芽胞桿菌，解淀粉芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌等。因為其高效的外源蛋白分泌效率和生物安全性，地衣芽胞桿菌可以作為一個優(yōu)良的表達宿主用于表達外源蛋白，地衣芽胞桿菌B110是由野生菌地衣芽胞桿菌WX-02中缺失了 8種自身胞外蛋白酶后得到的一株可用于高效外源蛋白表達的宿主菌，在前期的研究中，我們已實現(xiàn)了來源于枯草納豆芽胞桿菌MBS 04-6中納豆激酶基因々τ/?地衣芽胞桿菌B110中的表達，但其酶活只有11.73 FU/mL。
[0004]外源蛋白分泌到胞外主要經(jīng)過識別、結(jié)合、折疊和分泌三個階段。信號肽在外源蛋白分泌過程中具有十分重要的作用，它就像一個帶有定位系統(tǒng)的火車頭引導外源蛋白跨膜，通過信號肽酶的剪切作用，前體蛋白變成成熟蛋白從而分泌到胞外。由于信號肽在外源蛋白分泌中的重要作用，使得我們可以通過優(yōu)化信號肽來提高外源蛋白的表達量。Brockmeier et al (2006)和Degering et al (2010)通過建立信號狀篩選文庫對地衣芽胞桿菌14580和枯草芽胞桿菌168中的Sec-SRP途徑中的信號肽進行了篩選，通過篩選得到了可以提高相應目標蛋白表達的信號肽。同時，他們也提出了信號肽并沒有普適性這一觀點。與此同時，關(guān)于外源蛋白表達過程中其他元件的優(yōu)化及信號肽特定位點的改造人們也做了很多的工作，這些策略都為加強外源蛋白的表達提出了新的思路，也為我們今后更好的研究和應用外源蛋白表達系統(tǒng)指明了方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一株可以高效分泌納豆激酶的地衣芽胞桿菌工程菌(保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏編號:CCTCC NO:M 2014253 ;分類名稱:地衣芽胞桿菌{Bacillus licheniformis) BL10 (pP43SacCNK);保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)洛珈山路16號(武漢大學)；保藏日期:2014年6月12日)，其在液體發(fā)酵過程中可以高效分泌納豆激酶，為以后的科學研究和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
[0006]技術(shù)路線
1重組載體中表達元件的克隆
以枯草芽胞桿菌168的總DNA為模板，采用PCR的方法擴增出P43啟動子和果聚糖酶SacC的信號肽(序列見SEQ ID NO: 1 )，引物分別為P43-F/R，Sp-SacC-F/R ；以枯草納豆芽胞桿菌MBS 04-6的總DNA為模板，采用PCR的方法擴增出納豆激酶基因辦引物為AprN_F/R ；以地衣芽胞桿菌WX-02的總DNA為模板，采用PCR的方法擴增出淀粉酶基因的終止子序列，引物為TamyL-F/R。
[0007]2以果聚糖酶SacC的信號肽為信號肽的納豆激酶分泌型表達載體的構(gòu)建
以實驗室保存的表達載體PHY300PLK為初始載體構(gòu)建納豆激酶高效分泌表達載體。先將P43啟動子、果聚糖酶SacC的信號肽、納豆激酶基因ΑττΛ及淀粉酶基因的終止子片段通過S0E-PCR的方法連到一起，構(gòu)成PSacCNK。通過EcoRI/Xbal雙酶切，純化回收后與同樣經(jīng)過EcoRI/Xbal雙酶切的pHY300PLK空質(zhì)粒酶連，酶連溫度為16° C，時間為8 h，酶連產(chǎn)物隨后轉(zhuǎn)化E.coimm α，挑轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，將PCR驗證正確的轉(zhuǎn)化子挑菌接至含有5 mL LB培養(yǎng)基的PA瓶中(50 ug/mL氨芐抗生素)，抽質(zhì)粒并測序。
[0008]3地衣芽胞桿菌納豆激酶工程菌株B110 (pP43SacCNK)的構(gòu)建
將構(gòu)建好的納豆激酶分泌型表達載體和PHY300PLK空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化地衣芽胞桿菌B110。首先做地衣芽胞桿菌B110感受態(tài)，在平板上活化菌種，然后挑菌至含有5 mL LB的PA瓶中，37° C過夜培養(yǎng)，隨后以5%的接種量轉(zhuǎn)接至生長培養(yǎng)基中，37° C，200 rpm培養(yǎng)至0D6。。到0.85左右,5500 rpm離心6 min收集菌體，用洗滌培養(yǎng)基重懸菌體,5500 rpm離心6 min,重復三次后加入1 mL洗滌培養(yǎng)基重懸菌體，分裝至滅過菌的1.5 mLEP管中，一80° C保存。
[0009]將吹干后的電轉(zhuǎn)杯在冰上預冷15 min，然后將100 ul的地衣芽胞桿菌B110感受態(tài)細胞與10 ul重組載體混勻后加入電轉(zhuǎn)杯中，冰上預冷3-5 min后，2.4 kV條件下點擊，電擊時間4.8-5.2ms，隨后立即加入800ul恢復培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至1.5 mLEP管中。37° C，lOOrpm培養(yǎng)3 h后涂LB平板(20 ug/mL四環(huán)抗生素)。待長出轉(zhuǎn)化子后挑菌進行菌落PCR驗證和抽質(zhì)粒驗證，驗證正確后保存菌種。驗證引物為pHY-F/R。
[0010]4地衣芽胞桿菌B110 (pP43SacCNK)發(fā)酵實驗
在平板上活化菌種，挑菌接至含有50 mL液體LB的250 mL三角瓶中，37° C，180 rpm培養(yǎng)10 h，隨后以1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37° C，180 rpm培養(yǎng)48 h。
[0011]5納豆激酶酶活的測定
采用平板法測定發(fā)酵液中納豆激酶的酶活。先將發(fā)酵液10000 rom離心5 min取上清，倒纖維蛋白原平板，待平板凝固后用微量打孔器打孔，后取10 ul發(fā)酵上清液點孔，37° C條件下培養(yǎng)10-12 h，使用游標卡尺來計算平板上透明圈的直徑并與標準液相比較從而得到納豆激酶的酶活。
[0012]6定量測定地衣芽胞桿菌B110 (pP43SacCNK)發(fā)酵終點納豆激酶的分泌量
BSA標準曲線的制作。預先準備好不同濃度的BSA溶液(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6mg/mL、0.8 mg/mL、l mg/mL),與等量的 2*SDS_PAGE buffer 混合后，跑 SDS-PAGE,點樣量均為10ul。染色脫色后根據(jù)蛋白膠上目標條帶的深度及條帶面積得到BSA蛋白的標準曲線。
[0013]樣品預處理。1.5 mLEP管中加入900 ul發(fā)酵液上清，與100 ul 100%TCA混勻后，4° C條件下靜置過夜，10000 rpm離心10 min，隨后用500 ul無水乙醇洗去TCA，重復三次，待乙醇吹干后加入45 ul的2M硫脲和8M尿素的混合溶液，與等量的2*SDS_PAGE buffer混勻后點樣，點樣量為10ul。根據(jù)樣品條帶的深度及面積，參照蛋白的標準曲線得到發(fā)酵液中納豆激酶蛋白的分泌量。
[0014]
【附圖說明】
[0015]圖1為納豆激酶分泌型載體中表達元件瓊脂糖凝膠圖
泳道1為來源于枯草芽胞桿菌168中啟動子P43的條帶(305 bp);泳道2為來源枯草芽胞桿菌168中果聚糖酶SacC的信號肽條帶(72 bp);泳道3為來源于枯草納豆芽胞桿菌MBS 04-6中納豆激酶基因々ττΛ序列條帶(1056 bp),泳道4為來源于地衣芽胞桿菌wx_02中淀粉酶基因條帶(502 bp)，泳道5為5K DNA marker (從上到下依次為:5000bp，3000 bp,2000 bp,1500 bp,1000 bp,750bp,500 bp,250 bp,100 bp)。
[0016]圖2為納豆激酶分泌型載體質(zhì)粒圖譜
以表達質(zhì)粒PHY300PLK為原始質(zhì)粒，在其基礎(chǔ)上加入來源于枯草芽胞桿菌168的啟動子P43，來源于枯草芽胞桿菌168中果聚糖酶SacC的信號肽，來源于納豆芽胞桿菌MBS04-6中的納豆激酶基因ΑττΛ及來源于地衣芽胞桿菌WX-02中淀粉酶基因的終止子，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pP43SacCNK。